富血小板血漿在脊髓損傷神經(jīng)再生微環(huán)境治療機制研究進展

蘇 輝，譚國慶，徐展望

(1.山東中醫(yī)藥大學，山東 濟南 250035 2.山東中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，山東 濟南 250035)

脊髓損傷(SCI)作為脊柱損傷最嚴重的并發(fā)癥，通常伴有損傷平面下方的感官和運動功能喪失。當今由于創(chuàng)傷造成的脊柱損傷日益加劇，其中脊髓損傷是脊柱損傷最嚴重的并發(fā)癥，脊髓損傷影響全球超過250萬人，較高的發(fā)病率的同時給社會增加較大的經(jīng)濟負擔。通過對脊髓損傷中的病理生理的研究中，目前診療主要以促進以神經(jīng)保護、軸突再生和神經(jīng)再生的神經(jīng)微環(huán)境改善為主要治療方案。

富含血小板的血漿(PRP)含有多種生長因子。在脊髓損傷領(lǐng)域中，尋找促進周圍神經(jīng)再生及恢復的治療方法仍然是在艱難中積極探索。而富含血小板的血漿(PRP)含有多種生長因子和活性蛋白質(zhì)等因素對神經(jīng)再生存在著強大的作用[1]，并逐漸在脊髓損傷治療領(lǐng)域發(fā)揮作用。但是PRP治療機制多向化的同時尚缺乏臨床效果及實驗研究數(shù)據(jù)的比較。本文通過總結(jié)分析目前PRP在脊髓損傷中的臨床實驗研究進展，為今后富含血小板的血漿(PRP)在脊髓損傷中更好的應(yīng)用做出相應(yīng)數(shù)據(jù)支持及臨床實驗指導。

1 PRP通過產(chǎn)生營養(yǎng)生長因子加速神經(jīng)元細胞軸突生長促進神經(jīng)再生

1.1PRP能夠產(chǎn)生胰島素樣生長因子-I(IGF-I)促進軸突生長:胰島素樣生長因子-I(IGF-I)作為一種多能的因子，在既往的研究證實IGF-1刺激神經(jīng)元、膠質(zhì)細胞、寡頭細胞和施萬細胞的蛋白質(zhì)合成，抑制神經(jīng)細胞的凋亡，促進神經(jīng)元軸突的生長與恢復。已有文獻在臨床研究及應(yīng)用于肌腱損傷的兔子模型中發(fā)現(xiàn)PRP治療后其胰島素樣生長因子-I(IGF-I)呈上調(diào)趨勢，Emel等[2]在開展富含血小板的血漿(PRP)在老鼠神經(jīng)損傷模型中神經(jīng)再生的可衡量的影響中。其實驗研究結(jié)果表明，PRP的參與治療提高IGF-I的表達，使之能夠通過提高軸突抗再生的速度來促進神經(jīng)生長恢復及加速癱瘓肌肉的功能恢復。但目前針對其治療機制局限于老鼠面神經(jīng)損傷中實驗研究，其實驗支持脊髓損傷中神經(jīng)微環(huán)境中相應(yīng)數(shù)據(jù)研究有限，后期可在中樞及外周神經(jīng)多方面開展。

1.2PRP能夠產(chǎn)生表皮生長因子受體(EGF-R)加速神經(jīng)元軸突生長促進神經(jīng)再生:表皮生長因子受體(EGF-R)及其配體是開發(fā)和維護包括神經(jīng)系統(tǒng)在內(nèi)的各種組織的重要調(diào)節(jié)器。基因敲除、轉(zhuǎn)基因或其他體內(nèi)和體外實驗等研究表明，這些由神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞產(chǎn)生的分子在調(diào)節(jié)神經(jīng)、膠質(zhì)前體細胞或干細胞增殖、遷移、分化和生存、維持分子平衡以及調(diào)節(jié)神經(jīng)損傷反應(yīng)方面發(fā)揮了重要作用。盡管個別EGF家族配體可能功能冗余，但開發(fā)和維護神經(jīng)系統(tǒng)需要集體EGF-R的參與。目前，大量實驗僅證實EGF為PRP各種因子中含量最高的生長營養(yǎng)因子，但針對PRP在干預脊髓損傷促進神經(jīng)恢復中對于表皮生長因子受體(EGF-R)是否直接具有積極調(diào)控的作用缺乏明確的實驗支持。

1.3PRP能夠產(chǎn)生血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)加速神經(jīng)元軸突生長促進神經(jīng)再生:血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是一種與血管生成和再血管化相關(guān)的分泌線粒體。長期以來，VEGF一直被認為是脊髓神經(jīng)元生存的一個強有力的神經(jīng)營養(yǎng)因子。Hongyu Wang等[3]在大鼠的實驗結(jié)果中表明，VEGF具有抑制各種炎癥和增加細胞自噬功能。Zi-Xing Xu等小組的實驗研究[4]表明VEGF同NT-3的共同應(yīng)用治療可減少脊髓的炎癥，促進軸突生長，并促進更好的運動恢復。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)在治療脊髓損傷促進神經(jīng)微環(huán)境改善中的積極作用也為今后開展臨床工作及基礎(chǔ)研究提供了新的治療方案與課題。

1.4PRP能夠產(chǎn)生外源性血小板衍生生長因子(PDGF)加速神經(jīng)元軸突生長促進神經(jīng)再生加速軸突生長促進神經(jīng)再生。PDGF作為一種外源性血小板衍生生長因子能夠在脊髓損傷的情況下通過調(diào)節(jié)各種離子通道增強神經(jīng)元的興奮性，增加突觸可塑性和生長功能，并減少神經(jīng)元細胞的凋亡[5]。在臨床實驗中通過研究分析后得出血小板濃縮物釋放出的大量外源性血小板衍生生長因子(PDGF)。Xue-Yan Guo研究[6]中，對大鼠直接皮下注射PDGF后，結(jié)果表明PDGF能夠減少神經(jīng)元細胞凋亡。外源性血小板衍生生長因子(PDGF)-AA過度表達寡頭細胞祖細胞(OPCs)的移植促進脊髓損傷(SCI)大鼠模型中神經(jīng)功能的組織生長和恢復。PRP參與治療后產(chǎn)生的PDG對于SCI大鼠的模型中，能夠促進大鼠的神經(jīng)組織損傷的改善、骨髓化和功能恢復加速。進一步試驗證實，PDGF-AA提高了內(nèi)源性少突膠質(zhì)細胞前體細胞OPC和神經(jīng)膠質(zhì)細胞OLs的存活率，并促進了OPC的擴散及其在OLs中的分化。此外，PDGF還保護運動神經(jīng)元細胞免受因受傷的脊髓而導致的凋亡。研究文獻中涉及外源性血小板衍生生長因子(PDGF)在改善神經(jīng)再生微環(huán)境中作用的相關(guān)通路及其治療機制中所調(diào)控的各種離子通道研究較少。目前臨床也有將血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和外源性血小板衍生生長因子(PDGF)作為創(chuàng)傷性脊髓損傷治療的聯(lián)合應(yīng)用，將VEGF和PDGF應(yīng)用于脊髓神經(jīng)損傷區(qū)域。其試驗研究結(jié)果證明了這些生長因子的意外協(xié)同作用，它們改善了因損傷出現(xiàn)炎癥過程，并創(chuàng)造了一個有利于軸突保存、發(fā)芽的微環(huán)境，為神經(jīng)再生創(chuàng)造了條件。但其實驗結(jié)果僅支持其聯(lián)合應(yīng)用通過改善炎癥間接的促進神經(jīng)再生，對于是否直接作用于神經(jīng)再生恢復生長機制缺乏直接證據(jù)，但也為后期研究提供靶向及路徑。

1.5PRP能夠產(chǎn)生神經(jīng)營養(yǎng)因子加速神經(jīng)元軸突生長促進神經(jīng)再生:神經(jīng)營養(yǎng)因子是指機體產(chǎn)生的能夠促進神經(jīng)細胞存活、生長、分化的一類蛋白質(zhì)因子，能夠通過促進神經(jīng)元細胞的分化及增殖并減少凋亡促進神經(jīng)再生[7]。神經(jīng)營養(yǎng)素是一系列生長因子，對神經(jīng)元細胞起作用。神經(jīng)營養(yǎng)素包括神經(jīng)生長因子(NGF)、大腦衍生的神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)和神經(jīng)營養(yǎng)素。神經(jīng)營養(yǎng)素通過跨膜受體信號系統(tǒng)促進神經(jīng)調(diào)節(jié)恢復。已有動物及體外實驗進行了針對PRP在NGF及BDN分泌的實驗研究，部分研究并進行了定量實時PCR和ELISA分析，確定了PRP誘導能夠具有產(chǎn)生神經(jīng)生長因子(NGF)和膠質(zhì)細胞系衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)的能力[8]，從而促進脊髓損傷后神經(jīng)的恢復及改善。神經(jīng)營養(yǎng)素-3(NT-3)被發(fā)現(xiàn)顯著促進神經(jīng)運動功能并改善神經(jīng)狀態(tài)的恢復，其根本原因可能是NT-3抑制寡頭細胞中自噬蛋白的表達，促進寡頭細胞增殖，同時J Ye的研究表明NT-3可以抑制MAPK信號通路，從而促進SCI的恢復。Liheng Li等[9]的實驗中在聚合酶鏈反應(yīng)的結(jié)果表明，PRP釋放生長因子，包括神經(jīng)生長因子和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子。與其他組相比，免疫化學還顯示PRP組的S-100蛋白質(zhì)表達水平較高。其實驗表明富含血小板的血漿釋放腦系統(tǒng)中的營養(yǎng)因子，使用PRP可以促進損傷恢復。但目前針對神經(jīng)營養(yǎng)素等相關(guān)因子研究較少且未深入探究其作用機制，對于促進神經(jīng)元細胞的分化及增殖并減少凋亡促進神經(jīng)再生的作用機制僅處于猜測階段，后期仍需大量數(shù)據(jù)支持。

2 PRP通過刺激細胞增殖減少凋亡促進神經(jīng)再生

2.1PRP顯著刺激了施萬細胞的增殖和遷移:神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)膠質(zhì)細胞稱施萬(schwann，SC)細胞，它沿神經(jīng)元的突起分布。施萬細胞的外表面有基膜，能分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子，促進受損的神經(jīng)元的存活及其軸突的再生，參與周圍神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)纖維的構(gòu)成[10]。目前動物實驗結(jié)果表明PRP加速了SC在體內(nèi)的擴散。有力的證明了PRP對SC的積極調(diào)控作用，但未明確其具體作用通路及相關(guān)靶點。

2.2PRP顯著促進了星形膠質(zhì)細胞的凋亡。星形膠質(zhì)細胞具有支持和分隔神經(jīng)細胞的作用，能產(chǎn)生和分泌某些神經(jīng)遞質(zhì)以及表達某些神經(jīng)遞質(zhì)受體，可幫助調(diào)節(jié)神經(jīng)元周圍的離子微環(huán)境[11]。脊髓神經(jīng)系統(tǒng)損傷后，損傷區(qū)域星形膠質(zhì)細胞通過增生可形成膠質(zhì)“瘢痕”，從而一定程度在神經(jīng)再生及恢復發(fā)揮著重要作用。Maryam Borhani-Haghighi等[12]在給小鼠注射PRP后，通過細胞分析得出大量微膠質(zhì)、星形細胞細胞因子的表達被逆轉(zhuǎn)。在具有SCI的老鼠中，即PRP增強了運動器的恢復，促進了血管生成和神經(jīng)元再生，并調(diào)節(jié)了血管大小。同時，PRP的注射增加了疼痛閾值，抑制了星形細胞的激活，減少了PKM2和有氧糖解的表達，表明PRP可以抑制星形細胞的活化，減少PKM2的表達和糖解和GFAP、GLUT1和p-STAT3在星形細胞中的表達水平，從而能夠改善脊髓神經(jīng)損傷導致的慢性炎癥。目前對于PRP與星形膠質(zhì)細胞的相關(guān)研究較為充分，以明確證實相關(guān)信號通路及靶點蛋白，可信度較高，具有較強的臨床及實驗指導意義。未來可增加體內(nèi)實驗相關(guān)研究，進一步證實其作用療效。

2.3PRP顯著誘導干細胞分化:國外在重建受損的脊髓的治療中使用干細胞和PRP的混合物與纖維蛋白涂層作為生物治療手段。通過對四例嚴重受損的脊髓使用造血干細胞SCs和富含血小板的蛋白質(zhì)(PRP)進行神經(jīng)溶解和脊髓重建手術(shù)。其結(jié)果顯示患者表現(xiàn)出運動和客觀的感官改善。這些患者在手術(shù)或植入造血干細胞時均未表現(xiàn)出任何惡化或并發(fā)癥的跡象。結(jié)果表明，富含血小板的血漿(PRP)的合成物的應(yīng)用具有明顯的優(yōu)越性，PRP的使用使大多數(shù)hBMSC得以生存并分化為神經(jīng)表型。Tengfei Zhao的動物實驗[13]中研究發(fā)現(xiàn)了PRP和BDNF-BMSC植入物的老鼠在術(shù)后8周表現(xiàn)出比對照動物更強的后肢動體性能，具有更多的軸狀再骨髓化。其結(jié)論為由PRP和BDNF過度表達的BMSC組成的聯(lián)合治療通過加強星形細胞向移植和軸位再骨髓的遷移，對大鼠在SCI之后的功能恢復產(chǎn)生了有益的效果。

間質(zhì)干細胞(MSC)在修復中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺陷方面顯示出了很有希望的潛力。Reza Salarinia等[14]的研究調(diào)查了在SCI大鼠模型中綜合使用MSC和PRP的治療效果。其使用實時PCR方法用于凋亡細胞死亡評估的TUNEL測試，以及用于軸突再生檢查的神經(jīng)過濾NF200免疫化學。結(jié)果表明，與MSC和PRP的合作治療有效地緩解了被評估的類別。與僅接受MSC或PRP治療的動物相比，在Bcl-2和caspase3的表達、凋亡指數(shù)和NF200陽性軸突的表達中觀察到顯著差異。最后，這項研究表明，MSC和PRP的結(jié)合協(xié)同促進其治療效果在SCI。在對動物進行局部神經(jīng)軸切除術(shù)后，通過功能結(jié)果測量、電生理評價、神經(jīng)營養(yǎng)因子檢測、組織學評價。得出結(jié)論為PRP和nMSC的結(jié)合使用比單獨使用其中任何一種都顯示出更大的有益效果。這項研究為PRP和nMSC在急性神經(jīng)損傷的外周神經(jīng)再生中的潛在臨床應(yīng)用提供新的有利證據(jù)。但目前的臨床及實驗研究皆為PRP及干細胞的聯(lián)合使用，故其改善神經(jīng)微環(huán)境的研究結(jié)果未能明確證實PRP自身獨特直接治療機制。故后期可開展單獨應(yīng)用PRP治療的相關(guān)研究，為其治療機制提供更加有力的研究證明。

2.4PRP顯著促進了少突膠質(zhì)細胞的凋亡。少突膠質(zhì)細胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)平衡和生理學中具有獨特而重要的生物特性。越來越多的實驗證據(jù)表明，這些少突膠質(zhì)細胞與許多慢性、神經(jīng)退行性和神經(jīng)損傷疾病背后的病理生理機制有關(guān)。這些細胞對神經(jīng)生長恢復可塑性和慢性疼痛狀態(tài)促進組織修復的發(fā)展和改善也有重要影響。脊髓損傷(SCI)導致大量少突膠質(zhì)細胞死亡。動物實驗中在小鼠中分離出的PRP應(yīng)用于脊髓損傷的大鼠，發(fā)現(xiàn)其軸突生長恢復的潛力。后將PRP移植到肌張力障礙的Shiverer小鼠中，也證實了PRP衍生細胞在正常周期內(nèi)產(chǎn)生良好的脊髓髓鞘的能力。前期的實驗研究結(jié)果為臨床治療提供的較好的理論支持，但對于少突膠質(zhì)細胞及脊髓損傷神經(jīng)微環(huán)境的病理生理研究的相關(guān)機制仍需要進一步研究，旨在證實PRP可通過多靶點，多通路促進少突膠質(zhì)細胞的凋亡。

3 總結(jié)與展望

富含血小板的血漿(PRP)所包含生長因子，包括血小板衍生生長因子(PDGF)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)、胰島素樣生長因子-1(IGF-1)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)等的對于神經(jīng)膠質(zhì)細胞及干細胞等通過相關(guān)通路發(fā)揮著重要作用，改善微環(huán)境從而促進神經(jīng)突出生長，旨在恢復脊髓神經(jīng)損傷。目前PRP在脊髓神經(jīng)損傷領(lǐng)域的研究及應(yīng)用逐漸增多，安全性、可行性和有效性逐漸被證實。它是一種自體、生物兼容、無毒的材料且制備簡單快捷，不會產(chǎn)生主要的免疫反應(yīng)。PRP相關(guān)治療機制原理仍然需要更多的進一步研究，其具體作用的相關(guān)通路及靶點仍未可知。現(xiàn)有對于PRP的研究多在集中在動物實驗及細胞研究水平，臨床實驗及應(yīng)用仍未大數(shù)據(jù)大規(guī)模開展。今后應(yīng)進一步充分研究并逐步開展臨床體內(nèi)實驗，以進一步驗證其臨床效應(yīng)探究其作用機制，為今后促進脊髓損傷中神經(jīng)微環(huán)境的恢復提供更加有力的研究支持，也為未來在脊髓損傷治療領(lǐng)域提供新的治療思路與方案。