基于雙熒光基團分子信標對水體中鉛離子（Ⅱ）的檢測

熊威威，張應(yīng)坤，魯子敬，汪鵬，翟琨*，向東山*

（1.湖北民族大學(xué) 生物資源保護與利用湖北省重點實驗室，化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，湖北 恩施 445000；2.恩施職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖北 恩施 445000）

鉛（Pb）是一種嚴重危害人體健康的重金屬元素，是三大重金屬污染物之一[1]。Pb具有良好的延展性、柔軟性和耐腐蝕性等特性，因而被廣泛地應(yīng)用于冶金、蓄電池、印刷、顏料、油漆等工業(yè)與生活用品中[2]。但隨著含Pb物質(zhì)使用的逐漸增加，大量的含Pb化合物隨著生活污水、工業(yè)廢水、工業(yè)廢料及生活垃圾進入大自然中。由于含Pb化合物在自然條件下不能被降解[3]，并可在生物體中進行富集，因此Pb可直接或間接地進入人體，對人體健康造成危害。據(jù)報道，Pb進入人體可損傷神經(jīng)系統(tǒng)及大腦，還可引起嬰幼兒臟器發(fā)育不全及貧血等疾病，嚴重威脅人類健康[4]。因此，對于Pb的檢測具有十分重要的意義。

目前對Pb2+的常用檢測方法有比色法[5-6]、紫外-可見分光光度法[7]、電化學(xué)分析法[8]、火焰原子吸收光譜法[9]和電感耦合等離子體質(zhì)譜法[10]等。但這些方法有的檢測靈敏度較低，有的重復(fù)性不好，有的需要昂貴的儀器，因此，建立一種簡單快速、特異性好、靈敏度高、適用于常規(guī)檢測Pb2+的方法具有較強的現(xiàn)實意義。

分子信標（Molecular beacon）是一種具有莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的雙標記的寡核苷酸熒光探針，它具有很強的特異性和較高的靈敏度，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、環(huán)境科學(xué)及食品科學(xué)等領(lǐng)域[11-13]。核酸適配體（Aptamer）是一種經(jīng)體外篩選得到的、對相應(yīng)靶標分子（如蛋白質(zhì)，核酸、病毒，藥物分子、重金屬離子等）有嚴格識別能力和高度親和力的寡核苷酸序列。據(jù)報道，Pb2+的核酸適配體已被篩選出來（核酸中的G堿基能與Pb2+形成穩(wěn)定的G-四聯(lián)體空間結(jié)構(gòu)）并應(yīng)用到Pb2+高選擇性的檢測中[14-16]。目前基于Pb2+核酸適配體及分子信標對Pb2+的定量檢測已有一些應(yīng)用，但檢測過程較為復(fù)雜，不適合快速的常規(guī)檢測[17-18]。

為了簡化Pb2+定量檢測的步驟，加快其檢測速度，同時提高檢測的靈敏度，本實驗基于Pb2+的核酸適配體[19]，設(shè)計了一個能特異性識別Pb2+的雙熒光基團分子信標，利用分子信標直接對Pb2+進行檢測，建立了一個Pb2+的快速常規(guī)檢測方法。該分子信標由能發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移的兩個熒光基團（FAM和TAMRA）代替經(jīng)典分子信標中的一個熒光基團和一個猝滅基團，與FAM相連接的3個核苷酸中都含有鳥嘌呤（G堿基），分子信標的環(huán)及莖的一部分設(shè)計為Pb2+的核酸適配體。在這個分子信標中，TAMRA既是一個熒光基團，又是一個猝滅基團，它本身能發(fā)射熒光，同時又可以對一些熒光基團的熒光進行猝滅。FAM的發(fā)射光譜與TAMRA的吸收光譜有重疊，所以當熒光基團FAM和TAMRA靠近時，F(xiàn)AM的熒光能被TAMRA所吸收。另外，G堿基在熒光共振能量轉(zhuǎn)移中可以通過光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移的方式猝滅TAMRA所發(fā)射的熒光，且具有很好的猝滅效果[20]。因此，在該分子信標中，F(xiàn)AM的熒光能被TAMRA所猝滅，TAMRA的熒光能被G堿基所猝滅，在沒有Pb2+存在時，F(xiàn)AM和TAMRA的熒光信號都很弱。當分子信標與Pb2+反應(yīng)后，分子信標的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)被破壞，F(xiàn)AM與TAMRA、TAMRA與G堿基彼此分開，距離增加，熒光共振能量轉(zhuǎn)移及光誘導(dǎo)的電子轉(zhuǎn)移消失，F(xiàn)AM與TAMRA的熒光同時得到恢復(fù)。根據(jù)FAM與TAMRA熒光恢復(fù)的程度即可實現(xiàn)對Pb2+的定量檢測。

與目前已有的基于分子信標及核酸適配體對Pb2+的定量檢測方法相比，本方法利用分子信標直接與Pb2+反應(yīng)實現(xiàn)對Pb2+的檢測，簡化了Pb2+定量檢測的步驟，加快了檢測速度。另外，本方法所構(gòu)建的分子信標在對Pb2+進行定量檢測時能產(chǎn)生兩個不同的熒光響應(yīng)信號，利用TAMRA與FAM的總熒光強度對Pb2+進行定量分析，可顯著提高檢測的靈敏度。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

實驗所用儀器包括RF-5301PC型熒光光譜儀（日本Shimadzu公司），PHS-3C pH計（中國上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）。Pb（NO3）2試劑為優(yōu)級純（型號：GR500G），其他所有化學(xué)試劑均為分析純，購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司（中國）；實驗所用的緩沖溶液為0.1 mol·L-1的Tris-HNO3緩沖溶液；分子信標由上海生工生物技術(shù)有限公司（中國）合成并用高效液相色譜法進行純化，其堿基序列為：5′-FAM-（CH2）6-GGG AAA CCA CTG GAA GGT GTG GAA GGT TTC CC-（CH2）6-TAMRA-3′（斜體部分為Pb2+核酸適配體的堿基序列）。

1.2 樣品制備

分子信標用0.1 mol·L-1的Tris-HNO3緩沖溶液（pH 8.3，含60 mmol·L-1的NaNO3）稀釋成濃度為3×10-7mol·L-1的儲備液，Pb（NO3）2用蒸餾水配制成不同濃度的溶液備用。將50 μL不同濃度的Pb（NO3）2溶液加入到50 μL 3×10-7mol·L-1的分子信標溶液中混合均勻，在45℃的水浴鍋中加熱12 min，冷卻至常溫后，加入Tris-HNO3緩沖溶液至終體積達到500 μL，在室溫下反應(yīng)35 min，然后對體系中FAM及TAMRA的熒光信號進行檢測。除非文中特別指明，本研究中所有樣品的測定條件均與以上條件保持一致。

1.3 水樣的取樣與消化

自來水取自湖北民族大學(xué)基礎(chǔ)化學(xué)實驗教學(xué)示范中心實驗室，天然礦泉水取自湖北恩施龍洞河源頭，河水取自湖北恩施龍洞河三孔橋處（離源頭3 km處，途經(jīng)一個醫(yī)院和一所高校），取樣時間均為2020年7月5日中午。采水過程中所用的簡易采水器和盛水容器均為聚乙烯材質(zhì)，采集自來水時先放水5 min再進行取樣，天然礦泉水和河水的取樣均使用洗凈的簡易采水器，潤洗3次后在水深20 cm處采集水樣，水樣帶回實驗室后冷藏保存，并于當日完成測定。所取水樣清徹透明，無色、無懸浮雜質(zhì)和沉淀。消化時，移取水樣100 mL于消化罐中，加入5 mL濃HNO3溶液，然后置于溫控板上加熱，溫度設(shè)為90℃。待樣品蒸發(fā)至體積約為10 mL時，再加入5 mL濃HNO3與2 mL濃HClO4溶液，再次加熱至體積為1 mL左右。重復(fù)上述步驟，直至溶液澄清透明為止。將最終樣品冷卻至室溫后，用0.45 μm濾膜過濾，然后轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，用2%的硝酸溶液定容。

1.4 Pb2+的檢測

Pb2+的檢測通過對反應(yīng)后體系中FAM及TAMRA的熒光信號進行檢測來實現(xiàn)，本實驗采用同步熒光分析法對FAM及TAMRA的熒光信號進行檢測。熒光基團FAM最大激發(fā)波長為494 nm，最大發(fā)射波長為520 nm，熒光基團TAMRA的最大激發(fā)波長為559 nm，最大發(fā)射波長為582 nm，它們的斯托克斯位移（Stokes shift）分別為26 nm與23 nm，為了同時滿足FAM及TAMRA熒光信號的測定，同步掃描的波長間隔（Δλ）設(shè)置為25 nm，熒光分光光度計的激發(fā)及發(fā)射狹縫寬度均設(shè)置為10 nm。所有熒光強度的數(shù)值均在FAM或TAMRA的最大發(fā)射波長處測得。

2 結(jié)果與討論

2.1 實驗原理

檢測Pb2+的原理如圖1所示，熒光基團FAM連接在分子信標的5′端，與FAM相連接的3個核苷酸中的堿基均為G堿基，另一個熒光基團TAMRA連接在分子信標的3′端，分子信標的環(huán)及莖的一部分設(shè)計為Pb2+的適配體（GGA AGG TGT GGA AGG）。沒有Pb2+存在時，分子信標為莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，F(xiàn)AM與TAMRA的熒光信號都很弱。當有Pb2+存在時，分子信標與Pb2+反應(yīng)形成穩(wěn)定的G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)，分子信標的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)被破壞，F(xiàn)AM與TAMRA的熒光同時得到恢復(fù)。在分子信標過量的前提下，Pb2+的濃度越大，與Pb2+結(jié)合的分子信標就越多，F(xiàn)AM與TAMRA的熒光信號就越強。根據(jù)FAM與TAMRA熒光增加的程度，即可實現(xiàn)對Pb2+的雙色熒光定量檢測。

2.2 方法可行性分析

圖2為分子信標與不同濃度的Pb2+反應(yīng)后，體系中熒光基團TAMRA與FAM所對應(yīng)的熒光光譜圖。從圖2可以看出，當沒有Pb2+存在時，TAMRA與FAM的熒光信號都很弱（圖2a），但加入不同濃度的Pb2+后，TAMRA與FAM的熒光信號都顯著增強，且Pb2+的濃度越大，它們的熒光信號也越強。這說明利用該方法對Pb2+進行定量檢測是可行的。

圖1 基于雙熒光基團分子信標檢測Pb2+的基本原理Figure 1 Principle of detection for Pb2+based on dual-fluorophore molecular beacon

圖2 不同濃度的Pb2+體系所對應(yīng)的同步熒光光譜圖Figure 2 The synchronous fluorescence spectra of system at different concentrations of Pb2+

2.3 實驗條件優(yōu)化

2.3.1 緩沖溶液pH對測定結(jié)果的影響

本實驗以Tris-HNO3為緩沖體系，探究了緩沖體系的pH對測定結(jié)果的影響（圖3）。結(jié)果表明，緩沖體系的pH在7.4～8.3的范圍內(nèi)時，熒光基團FAM及TAMRA的熒光強度均隨著pH的增加而增加；當pH大于8.3時，F(xiàn)AM及TAMRA的熒光強度均隨著pH的增加逐漸降低。這說明當緩沖體系的pH較低時（＜8.3），分子信標與Pb2+形成G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性隨pH的升高而加強；當pH較高時（＞8.3），分子信標與Pb2+形成G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性隨pH的升高而逐漸減弱。因此，本實驗選擇pH為8.3的Tris-HNO3緩沖體系。

2.3.2 加熱時間和溫度對測定結(jié)果的影響

圖3 pH對熒光強度的影響Figure 3 Effect of pH on fluorescence intensity

為了使分子信標與Pb2+更好更快地結(jié)合形成G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)，反應(yīng)體系進行了加熱處理，目的是在加熱時使分子信標的莖部打開，在冷卻過程中，分子信標更容易與Pb2+特異性結(jié)合，形成穩(wěn)定的G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)。為了得到合適的加熱時間和溫度，本實驗對加熱時間和溫度對測定結(jié)果的影響進行了考察。

當溫度為45℃、加熱時間為3～12 min時，F(xiàn)AM及TAMRA的熒光強度均隨加熱時間增加而增大，當加熱時間超過12 min后，其熒光強度基本不變，說明在12 min之內(nèi)分子信標的莖部即可完全打開（圖4），因此本實驗孵育時間選擇為12 min。

當加熱時間為12 min時，考察了溫度對測定結(jié)果的影響。結(jié)果（圖5）表明，當溫度在35～45℃時，F(xiàn)AM及TAMRA的熒光強度均隨溫度的升高而增大，當溫度高于45℃時，其熒光強度幾乎不再變化。因此本實驗的加熱溫度選擇為45℃。

2.3.3 分子信標與目標物Pb2+反應(yīng)時間對測定結(jié)果的影響

將分子信標與Pb2+的混合物加熱之后，取出冷卻至室溫，此時分子信標與Pb2+特異性結(jié)合形成G-四聯(lián)體。本實驗對分子信標與Pb2+的結(jié)合時間進行了考察。結(jié)果（圖6）表明，在20～35 min內(nèi)，F(xiàn)AM及TAMRA的熒光強度均隨著反應(yīng)時間的增加而增大，隨后趨于穩(wěn)定。這說明分子信標與Pb2+在35 min內(nèi)即可反應(yīng)完成。根據(jù)文獻[17-18]報道，已有的基于分子信標對Pb2+的檢測方法，反應(yīng)時間都需要60 min以上，因此本方法極大縮短了反應(yīng)時間，可顯著加快Pb2+的檢測速度。

2.3.4 緩沖溶液中NaNO3的濃度對測定結(jié)果的影響

圖4 加熱時間對熒光強度的影響Figure 4 Effect of heating time on fluorescence intensity

圖5 加熱溫度對熒光強度的影響Figure 5 Effect of temperature on the fluorescence intensity

圖6 反應(yīng)時間對熒光強度的影響Figure 6 Effect of reaction time on fluorescence intensity

溶液中的陽離子可以中和分子信標的負電荷，使分子信標與Pb2+結(jié)合更加穩(wěn)定[21]，因此溶液中電解質(zhì)的濃度對測定結(jié)果會有影響。本實驗通過改變緩沖溶液中NaNO3的濃度，來探討電解質(zhì)的濃度對反應(yīng)體系的影響。結(jié)果（圖7）表明，當NaNO3濃度在0～60 mmol·L-1時，F(xiàn)AM及TAMRA的熒光強度均隨著NaNO3濃度的增大而逐漸增大，當NaNO3的濃度超過60 mmol·L-1時，F(xiàn)AM及TAMRA的熒光強度趨于穩(wěn)定。因此本實驗選擇含60 mmol·L-1的NaNO3緩沖溶液。

2.4 工作曲線及檢出限

在優(yōu)化條件下，對不同濃度Pb2+所對應(yīng)的FAM及TAMRA的熒光強度進行了考察。圖8a為不同濃度Pb2+所對應(yīng)的FAM及TAMRA的同步掃描的熒光光譜圖。圖8b和圖8c分別為FAM及TAMRA在其最大波長處的熒光強度與Pb2+濃度之間的線性關(guān)系，圖8d為FAM及TAMRA在其最大波長處的熒光強度之和與Pb2+濃度之間的線性關(guān)系。結(jié)果表明，Pb2+濃度在8×10-10～4×10-8mol·L-1范圍內(nèi)，F(xiàn)AM、TAMRA的熒光強度（ΔI，ΔI=I-I0，I0為體系中沒有Pb2+時熒光強度，I為體系中存在Pb2+時的熒光強度）分別與Pb2+的濃度（C）呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，其擬合的回歸方程分別為 ΔI1=1.543C+8.953（=0.992 8），ΔI2=1.532C+9.678（R22=0.994 6）。利用FAM、TAMRA的熒光強度對Pb2+進行定量分析時的檢出限分別為2.5×10-10mol·L-1及3.0×10-10mol·L-1。另外，TAMRA與FAM的總熒光強度與Pb2+的濃度（C）在8×10-10～4×10-8mol·L-1范圍內(nèi)同樣呈現(xiàn)出良好線性關(guān)系，其擬合的回歸方程為ΔIT=3.052C+13.129（R2T=0.998 7），檢出限為1.5×10-10mol·L-1。這說明利用TAMRA與FAM的總熒光強度對Pb2+進行定量分析時，其靈敏度更高（斜率更大）。對9個濃度均為7×10-9mol·L-1的平行樣品進行測定，其相對標準偏差（RSD）為3.8%，說明該方法具有較好的精密度。

2.5 方法特異性分析

為了考察方法的特異性，將水體中常見的陽離子及能與Pb2+發(fā)生配位或沉淀反應(yīng)的陰離子分別加入到含Pb2+濃度相同的溶液中，并與只含Pb2+的溶液進行對比實驗。在各個濃度均為4×10-8mol·L-1的Pb2+溶液中分別加入濃度為 1×10-5mol·L-1的 Hg2+（Hg）、K+（K）、Na+（Na）、Ca2+（Ca）、Mg2+（Mg）、Mn2+（Mn）、Ni2+（Ni）、Cd2+（Cd）、Cu2+（Cu）、Fe3+（Fe）、Al3+（Al）、Cr3+（Cr）、Cl-（Cl）、Br-（Br）、Ac-（Ac）、SO42-（S）的溶液，在相同的條件下與4×10-8mol·L-1的Pb2+（Pb）進行對比實驗。結(jié)果（圖9）表明，即使在含Pb2+的溶液中加入濃度遠大于Pb2+濃度的其他離子，各樣品所對應(yīng)的熒光強度也幾乎沒有變化，這表明上述離子的存在對Pb2+的檢測沒有干擾，即該方法對Pb2+具有很高的選擇性。盡管有一些陽離子（如K+）也能與含G堿基的分子信標形成G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)，但據(jù)文獻[19]報道，當Pb2+與K+同時存在時，Pb2+與G堿基結(jié)合形成G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)比K+與G堿基結(jié)合形成G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)要更穩(wěn)定，因此K+的存在不會對Pb2+的檢測產(chǎn)生干擾，本實驗的結(jié)果也證明了這一點。另外，盡管水樣中還存在其他不同的陰離子，但考慮到分子信標是帶負電的，水樣中帶負電的陰離子與分子信標存在排斥作用[22-23]，不會發(fā)生反應(yīng)，因此本實驗只考察能與Pb2+發(fā)生配位或沉淀反應(yīng)的陰離子。

圖7 NaNO3濃度對熒光強度的影響Figure 7 Effect of NaNO3concentration on fluorescence intensity

2.6 實際樣品檢測與加標回收實驗

圖8 不同Pb2+濃度所對應(yīng)的FAM及TAMRA的同步熒光光譜圖、FAM及TAMRA的熒光強度、FAM和TAMRA的總熒光強度與Pb2+濃度的線性關(guān)系圖Figure 8 Synchronous fluorescence spectra of FAM and TAMRA at different concentrations of Pb2+，the linear relationships between the fluorescence intensity of FAM，the fluorescence intensity of TAMRA，and the total fluorescence intensity of FAM and TAMRA and the Pb2+concentration，respectively

圖9 方法特異性分析Figure 9 Specificity analysis of methods

為了驗證方法的實用性，本實驗對實際水樣中的Pb2+進行了檢測，并進行加標回收實驗。在自來水、天然礦泉水及河水3種不同類型的水樣中，分別取4份相同的水樣，加入不同濃度的Pb（NO3）2溶液（表1），消解后各取50 μL按本方法對各樣品中的Pb2+濃度進行測定。表1的結(jié)果顯示，河水、自來水及天然礦泉水水樣中Pb的含量分別為2.85×10-9mol·L-1、2.49×10-9mol·L-1及2.24×10-9mol·L-1，均低于國家規(guī)定的飲用水Pb2+含量標準。在這3種實際水樣中進行加標回收實驗，其回收率在96.7%～104.3%，且所取水樣測定結(jié)果的相對標準偏差都小于5%，這說明本方法在實際樣品的檢測中具有較高的準確度。

表1 采用本方法分別測定河水水樣（Ri）、自來水水樣（Ti）與礦泉水水樣（Si）中的Pb2+（n=3）Table 1 Determination of Pb2+in river water samples（Ri），tap water samples（Ti）and spring water sample（Si）by this method（n=3）

3 結(jié)論

（1）本實驗利用Pb2+的適配體及兩個熒光基團FAM與TAMRA構(gòu)建了一種能特異性地識別Pb2+的特殊的雙熒光基團分子信標，并利用該分子信標建立了一種高靈敏的Pb離子雙色熒光定量檢測方法。

（2）利用所建立的分析方法實現(xiàn)了不同類型水樣品中Pb2+的定量檢測，其加標回收率在96.7%～104.3%，且所取水樣測定結(jié)果的相對標準偏差都小于5%。

（3）該方法操作簡單、特異性好、靈敏度高，是一種適用于水體中Pb2+常規(guī)快速的定量檢測方法。