利用環(huán)境DNA-宏條形碼技術(shù)監(jiān)測蘇州地區(qū)小管福壽螺的入侵

陳曉 方靖怡 王萌 沈晴 孫振軍 王備新

摘要 ：小管福壽螺Pomacea canaliculata是我國南方重要的外來入侵有害生物，目前已在江蘇蘇州的河道、湖塘等水體中廣泛發(fā)生，并呈現(xiàn)向北入侵趨勢。及時準確地監(jiān)測小管福壽螺在水體中的入侵擴散是有效防控其為害的關(guān)鍵。傳統(tǒng)觀察法受其生活史、發(fā)生狀況及環(huán)境等影響，難以在入侵早期及時監(jiān)測。新興的環(huán)境DNA-宏條形碼（environmental DNA metabarcoding）技術(shù)可實現(xiàn)對入侵生物快速、靈敏的監(jiān)測。本文分別采用環(huán)境DNA-宏條形碼技術(shù)和傳統(tǒng)觀察方法對蘇州地區(qū)河流、湖泊和運河共38個樣點的小管福壽螺發(fā)生情況進行了檢測。結(jié)果顯示，環(huán)境DNA-宏條形碼技術(shù)檢測到小管福壽螺的發(fā)生率（92.11%）遠高于傳統(tǒng)觀察法（36.84%）。豐度閾值的設(shè)定和水體類型對環(huán)境DNA-宏條形碼技術(shù)的檢測結(jié)果有一定影響，本研究為今后運用環(huán)境DNA-宏條形碼技術(shù)進行福壽螺入侵監(jiān)測提供技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞 ：環(huán)境DNA（eDNA）; 高通量測序; 小管福壽螺; 生物入侵

中圖分類號：

S 40

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2020389

Monitoring of the invasive species Pomacea canaliculata via environmental DNA metabarcoding in Suzhou city

CHEN Xiao1， FANG Jingyi1，2， WANG Meng1， SHEN Qing3， SUN Zhenjun3*， WANG Beixin1*

（1. College of Plant Protection， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China;

2. Wageningen University， Wageningen 6700 AK， The Netherlands; 3. Suzhou

Station of Plant Protection and Plant Quarantine， Suzhou 215008， China）

Abstract

Pomacea canaliculata is a dangerous invasive species in southern China. At present， P.canaliculata has widely occurred in rivers， lakes， and other water bodies in Suzhou， Jiangsu province， and shows a trend of northward invasion. Timely and accurate monitoring of its invasion and spreading in water bodies is the key to effectively prevent and control its harm. Owing to the effect of its life history， occurrence， and environment， traditional observation cannot monitor P.canaliculata in the early stage of invasion. The emerging environmental DNA metabarcoding technology shows rapid and sensitive monitoring of invasive organisms. In this paper， environmental DNA metabarcoding and traditional observation methods were used to detect the occurrence of P.canaliculata in 38 samples of rivers， lakes， and canals in Suzhou. The results showed that the detection rate of P.canaliculata by environmental DNA metabarcoding technique （92.11%） was much higher than that by traditional observation method （36.84%）. The setting of abundance threshold and water body type have a certain impact on the detection results by environmental DNA metabarcoding technology. This study would provide technical support for the future use of this technology to monitor Pomacea.

Key words

environmental DNA; high-throughput sequencing; Pomacea canaliculata; biological invasion

外來物種入侵是重要的全球環(huán)境問題和生態(tài)安全問題[1]。入侵生物對農(nóng)、林、牧、漁業(yè)和交通航運等產(chǎn)生直接或間接的破壞，造成重大的經(jīng)濟損失和生態(tài)安全問題。福壽螺Pomacea屬軟體動物門Mollusca，腹足綱Gastropoda，瓶螺科Ampullariidae，是世界100種惡性外來入侵物種之一[2]，具有適應(yīng)性強、生長快、繁殖力高，食性雜且食量大等特點，在局部區(qū)域?qū)λ尽④?、蓮藕、芡實等農(nóng)作物造成嚴重危害。此外，福壽螺還是一些危害人體健康的寄生蟲的中間宿主，如卷棘口吸蟲Echinostoma revolutum和廣州管圓線蟲Angiostrongylus cantonensis等[3]。長期以來福壽螺被認為只有1種，即小管福壽螺Pomacea canaliculata，福壽螺通常也特指小管福壽螺，但現(xiàn)在通過分子生物學(xué)方法發(fā)現(xiàn)福壽螺屬包括多個種[4]。小管福壽螺自1981年引入廣東后，逐漸擴散至浙江、江西、云南和四川等地，現(xiàn)已成為影響南方農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要有害生物[5]。2003年中國國家環(huán)?？偩謱⑵淞腥胧着?6種外來入侵生物名單[6]。當前，小管福壽螺作為外來物種已在江蘇蘇州定殖[7]，在部分河道、湖塘發(fā)生量較大，并呈現(xiàn)逐漸向北（無錫、常州、鎮(zhèn)江、南京）擴散的趨勢。入侵初期是防治入侵物種的重要時期，監(jiān)測預(yù)警是有效防控生物入侵的重要手段[1]。然而，小管福壽螺生活于水中，可潛藏在水底，非繁殖期有較強的隱蔽性[6]，傳統(tǒng)的現(xiàn)場觀察和調(diào)查問卷法發(fā)現(xiàn)難度大，不利于早期預(yù)警。如何有效地開展早期監(jiān)測是當前福壽螺防控中的重要工作內(nèi)容。

環(huán)境DNA（environmental DNA， eDNA）是指生物體經(jīng)由體表、尿液、糞便、黏液或細胞死亡裂解后等釋放到環(huán)境中的DNA片段[8]。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，DNA宏條形碼技術(shù)（DNA metabarcoding）可以從混合樣本中同時獲得更多的生物信息。環(huán)境DNA-宏條形碼技術(shù)，即利用宏條形碼技術(shù)對環(huán)境樣本中分離的DNA進行擴增測序，可以同時鑒定混合樣本中多個分類單元[9]（后文簡稱為環(huán)境DNA技術(shù)）。目前，環(huán)境DNA技術(shù)已成功應(yīng)用于入侵水生生物的監(jiān)測，并展現(xiàn)出快速、靈敏等優(yōu)點。該技術(shù)可以在亞洲鯉魚入侵北美五大湖早期密度較低時檢測到其存在[1011]。Takahara等[12]發(fā)現(xiàn)環(huán)境DNA技術(shù)相比傳統(tǒng)觀察法能更準確地反映入侵物種藍鰓太陽魚Lepomis macrochirus在日本的擴散趨勢。此外，對云南梯田克氏原螯蝦Procambarus clarkia的環(huán)境DNA監(jiān)測結(jié)果也表明該技術(shù)的檢出率明顯高于傳統(tǒng)的誘捕法[13]。然而，當前我國多數(shù)地區(qū)對福壽螺的發(fā)生監(jiān)測依然以走訪調(diào)查、現(xiàn)場觀察等為主[1416]，尚未見利用環(huán)境DNA-宏條形碼技術(shù)進行監(jiān)測的相關(guān)研究。入侵生物的早期預(yù)警需要在其豐度很低時監(jiān)測到其存在，因此低豐度序列的閾值篩選尤為重要。研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)境DNA在不同類型的水體中的富集也存在差異[17]。為此，還需明確篩選出的豐度閾值及各種環(huán)境因素對環(huán)境DNA技術(shù)監(jiān)測結(jié)果的影響。

本文旨在利用環(huán)境DNA技術(shù)監(jiān)測蘇州地區(qū)不同水體類型的38個樣點的小管福壽螺發(fā)生情況，探索環(huán)境DNA技術(shù)是否可以作為批量檢測入侵生物福壽螺的靈敏、高效的技術(shù)，明確豐度閾值和水體類型對環(huán)境DNA技術(shù)檢測結(jié)果的影響，為今后運用環(huán)境DNA-宏條形碼技術(shù)對福壽螺進行監(jiān)測和早期預(yù)警提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域和樣點設(shè)置

蘇州地區(qū)處于江蘇省南部，屬于長江流域太湖水系，水系發(fā)達，河網(wǎng)稠密，為福壽螺的繁殖和擴散提供了良好條件[18]。本研究于2019年1月在蘇州市相城區(qū)、常熟市、張家港市及昆山市進行水環(huán)境樣品及福壽螺生物樣品的采集，共設(shè)置了38個樣點（編號S01～S38），其中河流樣點24個，湖泊樣點6個和運河樣點8個（表1）。

1.2 環(huán)境DNA采集和福壽螺發(fā)生調(diào)查

采用過濾法收集水體中的環(huán)境DNA。每個樣點設(shè)3個采樣位置，各位置相隔5 m，每個位置在30～50 cm水深處用采樣瓶各采集500 mL水樣，合計1.5 L。將玻璃微纖維濾膜（GF/F，孔徑0.7 μm）放置于過濾裝置（Nalgene 300-4100過濾器）中，隨后將充分搖勻的水樣通過過濾裝置進行過濾。水樣過濾后用鑷子將濾膜放入離心管中，并加入無水乙醇置于4℃移動冰箱短期保存，帶回實驗室后放在-20℃環(huán)境保存。每次過濾前用75%乙醇和超純水充分沖洗過濾裝置，以防止各樣點交叉污染，所有儀器和材料在使用前均滅菌處理。

采用現(xiàn)場觀察法記錄采樣點周邊100 m范圍內(nèi)福壽螺的發(fā)生情況，觀察到有空殼、卵塊、活體的水域均認為有福壽螺存在，并隨機采集10只福壽螺活體帶回實驗室。

1.3 DNA提取與擴增

將38個樣點分3組進行環(huán)境DNA提取與擴增，每組包括12（或13個）樣點收集的樣品以及1個陽性對照和1個陰性對照。陽性對照（SP）為10頭沖洗干凈的福壽螺在1.5 L無菌水內(nèi)培養(yǎng)72 h后用過濾法收集的環(huán)境DNA樣本，使用純凈水過濾后的樣本作為陰性對照（SN）。另外選取4頭活體福壽螺，分別提取其組織DNA后測序獲得物種COⅠ序列，構(gòu)建本地福壽螺序列數(shù)據(jù)庫。試驗結(jié)束后10頭福壽螺均用75%乙醇殺死并作為標本保存。

環(huán)境DNA擴增前首先用無菌剪刀將濾膜剪碎成約3 mm的碎片，使用上海生工Ezup柱式動物基因組DNA抽提試劑盒（Ezup Column Animal Genomic DNA Purification Kit）從濾膜中提取環(huán)境DNA。采用上游引物mlCOlintF：5′-GGWACWGGWTGAACWGTWTAYCCYCC-3′和下游引物jgHCO2198：5′-TANACYTCNGGRTGNCCRAARAAYCA-3′（用N替代原序列中的I）對樣品的環(huán)境DNA進行擴增[19]。在每對引物上游、下游的5′-末端分別添加8個核苷酸長度的標簽，用以區(qū)分各個測序組中的每個樣品。PCR反應(yīng)體系為50 μL。反應(yīng)條件為94℃ 5 min;95℃ 10 s，62℃ 30 s（每次循環(huán)該過程都比上1個循環(huán)降低1℃），72℃ 60 s，16個循環(huán);95℃ 10 s，46℃ 30 s，72℃ 30 s，25個循環(huán);72℃ 5 min。測序平臺為Illumina Hiseq 2 500。

福壽螺組織DNA提取試劑盒同上，利用上游引物L(fēng)CO1490：5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′和下游引物HCO2198： 5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′進行擴增[20]。反應(yīng)條件為94℃ 1 min;94℃ 30 s，45℃ 90 s，72℃ 1 min，6個循環(huán);94℃ 30 s，51℃ 90 s，72℃ 1 min，36個循環(huán);72℃ 5 min。測序平臺為ABI 3730XL。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

利用SEED軟件（Version 2.1.05）對測序獲得的原始數(shù)據(jù)進行處理與分析，將原始數(shù)據(jù)成對導(dǎo)入并進行拼接組裝[21]。篩選出質(zhì)量Q≥30的序列，在去除過長和過短序列后，按照標簽將序列分組為各個樣點數(shù)據(jù)。去除引物與標簽不匹配的錯誤序列，刪去嵌合體。對所得優(yōu)質(zhì)序列按照大于97%的相似度進行可操作分類單元（operational taxonomic units， OTUs）聚類。將獲得的OTUs序列與NCBI上的數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對。為防止NCBI中發(fā)布的序列錯誤或比對出現(xiàn)錯誤，我們同時將OTUs與基于福壽螺組織DNA COⅠ序列構(gòu)建的本地序列數(shù)據(jù)庫進行比對，完成OTUs的物種信息注釋。將經(jīng)過處理分析后的信息匯總，得到各樣點中監(jiān)測到的福壽螺OTUs的豐度表，篩選其中一致性（similarity）=100%，覆蓋度（coverage）=100%的結(jié)果為有效的可操作分類單元。

為了評估低豐度序列的準確性，我們設(shè)置了序列豐度閾值和相對豐度閾值兩種篩選方式，研究不同閾值設(shè)置對檢測結(jié)果的影響[22]。序列豐度（n）即每個OTU中各個樣點測得的序列數(shù)。相對豐度（m）是指某樣點的目標OTU序列數(shù)占該樣點檢測到的所有OTUs序列總數(shù)的比例。將得到的物種序列數(shù)進行標準化處理，通過lg（n+1）進行對數(shù)轉(zhuǎn)換。所有的分析及作圖通過R語言（Version 4.0.1）完成。利用R語言中的“pheatmap包”對處理后的小管福壽螺序列及每個樣點的總序列數(shù)據(jù)進行對比統(tǒng)計，制作豐度熱圖。為評估相對序列豐度是否合適作為篩選物種存在的方式，將標準化處理的數(shù)據(jù)利用R語言中的“l(fā)m包”進行線性擬合。為探討兩種方法檢測到的福壽螺發(fā)生率是否與水體類型有關(guān)，我們進一步分析了河流、湖泊、運河中的福壽螺檢出率，即環(huán)境DNA技術(shù)檢測到福壽螺序列或現(xiàn)場觀測到福壽螺的樣點數(shù)與檢測總樣點數(shù)的比值。

2 結(jié)果與分析

2.1 現(xiàn)場觀察法和環(huán)境DNA-宏條形碼技術(shù)檢測結(jié)果

現(xiàn)場觀察法在38個樣點中的14個樣點觀察到小管福壽螺發(fā)生痕跡，其中活體、卵塊和空殼都觀察到的有2個樣點（S19、S23），觀察到卵塊和空殼的有4個樣點（S20、S21、S35、S36），僅觀察到卵塊或空殼的樣點數(shù)分別有6個（S08、S16、S31、S34、S37、S38）和2個（S12、S15）。

利用環(huán)境DNA-宏條形碼技術(shù)在38個樣點和6組對照中共得到21 973 306條DNA序列，其中福壽螺的序列數(shù)共111 317條。在36個樣點中檢測到4 852條福壽螺序列，陽性對照組（SP）檢測到106 465條福壽螺序列，陰性對照組（SN）未檢測到福壽螺序列，說明試驗操作無污染。通過USEARCH聚類得到兩個OTU，經(jīng)比對及注釋，其GenBank序列號分別為EF514972和EU528586，均為小管福壽螺。其中36個樣點及3個陽性對照中共檢測到103 141條序列的注釋結(jié)果為EF514972，遠高于注釋結(jié)果為EU528586的8 176條序列（表2，圖1）。此外，從現(xiàn)場采集的福壽螺中獲得的COⅠ序列經(jīng)BLAST比對及注釋后結(jié)果同樣為小管福壽螺，驗證了環(huán)境DNA技術(shù)檢測到的物種信息結(jié)果準確。

2.2 不同序列豐度閾值對檢測結(jié)果的影響

不同序列豐度閾值下小管福壽螺COⅠ條碼序列檢出率的結(jié)果（表3）表明，在序列豐度閾值n≥3和相對豐度閾值m≥0.001%兩種閾值下檢測到小管福壽螺序列的樣點數(shù)一致。其中，環(huán)境DNA技術(shù)檢測到小管福壽螺COⅠ序列的樣點數(shù)為35個，占總調(diào)查樣點的92.11%，在14個現(xiàn)場調(diào)查到福壽螺個體的樣點中有13個檢測到小管福壽螺COⅠ序列。但隨著序列豐度閾值和相對豐度閾值的提高，檢出率隨之下降。當序列豐度閾值n≥15時，小管福壽螺COⅠ序列的檢出率僅為57.89%，14個調(diào)查到福壽螺個體樣點中僅有7個樣點（50%）檢測到小管福壽螺序列;而序列相對豐度閾值m≥0.030%時，小管福壽螺COⅠ序列的檢出率僅為47.37%，14個調(diào)查到福壽螺個體樣點中僅有5個樣點（35.71%）檢測到小管福壽螺COⅠ序列。

基于38個樣點及對照組共44個樣本的總序列數(shù)及小管福壽螺序列數(shù)的線性擬合結(jié)果顯示，總序列數(shù)與小管福壽螺序列數(shù)間不存在線性關(guān)系（P>0.05，圖2），這表明基于序列相對豐度閾值m檢測到的小管福壽螺發(fā)生率不能夠真實地反映福壽螺的實際發(fā)生情況。結(jié)合表3的結(jié)果，本文在后續(xù)分析中，以序列豐度閾值n作為環(huán)境DNA技術(shù)檢測小管福壽螺發(fā)生的指標。

2.3 不同水體類型中小管福壽螺的檢測結(jié)果

當序列豐度閾值n≥2與n≥3時，從環(huán)境DNA中檢測到小管福壽螺的結(jié)果與現(xiàn)場觀察的結(jié)果一致（表3），且此時兩種方法檢測到小管福壽螺的樣點數(shù)均最多，現(xiàn)以序列豐度閾值n≥3作為小管福壽螺COⅠ條形碼檢出的閾值來計算其在不同水體類型中的檢出率（表4）。結(jié)果表明，湖泊中小管福壽螺檢出率最高，達到100%，河流和運河檢出率分別為91.67%和87.50%。但是，現(xiàn)場觀察法并未在6個湖泊樣點中調(diào)查到小管福壽螺，而24個河流樣點中有12個樣點（50%）調(diào)查到小管福壽螺，8個運河樣點中有2個樣點（25%）調(diào)查到小管福壽螺。綜上所述，38個調(diào)查樣點中，現(xiàn)場觀察法成功調(diào)查到小管福壽螺的共14個樣點（36.84%），遠低于從環(huán)境DNA中檢測出小管福壽螺的35個樣點（92.11%）。

3 討論

目前我國報道有3種外來入侵福壽螺，即小管福壽螺、斑點福壽螺Pomacea maculata和Pomacea sp.，其中小管福壽螺與斑點福壽螺親緣關(guān)系近，形態(tài)與生活習(xí)性也相近，利用傳統(tǒng)分類方法很難區(qū)分二者[4]?；贒NA條形碼技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，云南省、浙江省均已監(jiān)測到斑點福壽螺的入侵[4，23]。然而，此前的研究中，蘇州地區(qū)僅發(fā)現(xiàn)小管福壽螺，尚不確定是否有其他福壽螺入侵物種存在[24]。本文通過分子技術(shù)驗證了蘇州地區(qū)現(xiàn)階段僅有小管福壽螺一種入侵物種存在。

針對入侵物種小管福壽螺的檢測，環(huán)境DNA-宏條形碼技術(shù)相比傳統(tǒng)觀察法更加靈敏。在38個樣點中環(huán)境DNA技術(shù)在序列豐度閾值n≥1時檢測到小管福壽螺的樣點數(shù)有36個，明顯高于現(xiàn)場觀察法（14個）。當序列豐度閾值設(shè)置為n≥3，環(huán)境DNA技術(shù)檢測到小管福壽螺的發(fā)生率（92.11%）遠高于傳統(tǒng)觀察法（36.84%）。然而，利用環(huán)境DNA技術(shù)檢測也存在假陰性結(jié)果?，F(xiàn)場觀察到小管福壽螺的14個樣點中S21樣點在現(xiàn)場觀察到福壽螺卵塊及空殼，但環(huán)境DNA技術(shù)并未檢測出，這可能與其在環(huán)境中的DNA含量少有關(guān)，處于不同發(fā)育階段的生物其環(huán)境DNA釋放量存在差異[25]，也有可能是生物信息分析過程中由于篩選標準高，序列被刪除而造成的假陰性結(jié)果[26]。

環(huán)境DNA技術(shù)中的生物信息學(xué)數(shù)據(jù)處理是影響結(jié)果的重要步驟。低豐度序列可能是人為因素或誤差產(chǎn)生的錯誤序列，尤其是單體序列（singleton， n=1）[27]。設(shè)置豐度閾值是降低低豐度序列造成假陽性結(jié)果的一種常用方法[28]。但也不可否認在檢測低豐度物種時，低豐度序列可能反映了物種存在的重要信息[29]。在已有研究中，一般存在兩種篩選方法，一種是根據(jù)序列豐度閾值篩選[30]，一種是根據(jù)序列相對豐度閾值[31]來去除低豐度序列的OTUs。本文研究了上述兩種豐度閾值對小管福壽螺檢測結(jié)果的影響，結(jié)果表明，從單個環(huán)境DNA樣本中檢測出小管福壽螺的序列數(shù)與總序列數(shù)沒有顯著相關(guān)性，而序列相對豐度閾值是基于總序列數(shù)計算得到的，說明基于序列相對豐度閾值m的結(jié)果并不能準確反映小管福壽螺的入侵，針對低豐度生物的檢測時采取序列豐度閾值可能更合適。小管福壽螺序列數(shù)為n=1的樣點只有S22，在該樣點我們并未觀察到其物種存在痕跡，所以我們認為該結(jié)果為假陽性結(jié)果，即與實際不相符。本研究中，序列豐度閾值為n≥3時利用環(huán)境DNA技術(shù)在35個樣點中檢測到小管福壽螺COⅠ條形碼。關(guān)于n值多少為最佳，針對不同物種閾值設(shè)置是否不同，仍需要進一步研究。

環(huán)境DNA技術(shù)和現(xiàn)場觀察法在不同水體類型中的檢測結(jié)果也存在差異。在所有的湖泊樣點中，環(huán)境DNA技術(shù)都檢測到了小管福壽螺，這與我們前期在這些湖泊中發(fā)現(xiàn)有小管福壽螺分布的事實相符，而傳統(tǒng)觀察法在湖泊水體并未觀測到小管福壽螺。湖泊水體在監(jiān)測時受水深、生物習(xí)性等因素影響，而傳統(tǒng)觀察及捕撈多在沿岸區(qū)域進行，底棲性的小管福壽螺在監(jiān)測時，極有可能難以發(fā)現(xiàn)。在運河水體中，利用環(huán)境DNA技術(shù)的檢出率（87.50%）也高于傳統(tǒng)觀察法（25%）。相比傳統(tǒng)觀察法只在河流水體中有較高的檢出率不同，環(huán)境DNA技術(shù)在3種水體類型中都有較高的檢出率，表明該方法受水體類型的影響較小。

本文的研究結(jié)果表明環(huán)境DNA技術(shù)對入侵水生生物的監(jiān)測有重要的應(yīng)用價值，該技術(shù)可以高效敏捷地監(jiān)測小管福壽螺的入侵分布。雖然該技術(shù)仍存在低豐度物種檢出率低，且不能定量的不足[32]，但環(huán)境DNA技術(shù)具有可對大量的混合樣本快速檢測，受時間和環(huán)境因素影響小，對生物和環(huán)境近乎無傷，操作簡單便捷，省時省力靈敏度高等優(yōu)點。相比傳統(tǒng)觀察法，環(huán)境DNA-宏條形碼技術(shù)可在福壽螺入侵初期進行監(jiān)測，且受水體類型影響小。相信隨著環(huán)境DNA的獲取及數(shù)據(jù)分析方法的標準化及優(yōu)化，其必將成為未來入侵水生生物檢測的優(yōu)選方法。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）