吉林省西瓜蔓枯病菌對(duì)咪鮮胺和苯醚甲環(huán)唑敏感基線的建立和抗性監(jiān)測(cè)

孫東晗 陳悅 田文學(xué) 白慶榮 趙廷昌

摘要 ：為明確吉林省西瓜蔓枯病菌Stagonosporopsis citrulli對(duì)咪鮮胺和苯醚甲環(huán)唑的抗藥性水平，本試驗(yàn)采用菌絲生長速率法測(cè)定了151株西瓜蔓枯病菌對(duì)這兩種藥劑的敏感性及兩種藥劑對(duì)西瓜蔓枯病菌的MIC值，并測(cè)定了吉林省7個(gè)西瓜主產(chǎn)區(qū)的375株菌株對(duì)這兩種藥劑的抗性水平。結(jié)果表明，供試的151株菌株對(duì)這兩種藥劑的敏感性頻率分布均呈連續(xù)的單峰曲線，接近正態(tài)分布;對(duì)咪鮮胺和苯醚甲環(huán)唑的敏感基線分別為（0.203 0±0.135 3）μg/mL和（0.675 9±0.394 2）μg/mL;兩種藥劑的最低抑制濃度MIC分別為20 μg/mL和40 μg/mL。供試375株菌株對(duì)兩種殺菌劑的抗性頻率均為0。本研究結(jié)果為咪鮮胺和苯醚甲環(huán)唑的合理用藥策略提供了科學(xué)依據(jù)，為后續(xù)其抗性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 ：西瓜蔓枯病菌; 抗藥性; 咪鮮胺; 苯醚甲環(huán)唑

中圖分類號(hào)：

S 482.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2020494

Establishment of baseline sensitivity and monitoring of resistance

of Stagonosporopsis citrulli on watermelon to prochloraz

and difenoconazole in Jilin province

SUN Donghan1， CHEN Yue1， TIAN Wenxue2， BAI Qingrong1*， ZHAO Tingchang3*

（1.College of Plant Protection， Jilin Agricultural University， Changchun 130118， China; 2.Shandong

Sino-Agri United Biotechnology Co.，Ltd.， Jinan 250100， China; 3.Institute of Plant

Protection， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193， China）

Abstract

To evaluate the resistance levels of Stagonosporopsis citrulli causing gummy stem blight of Citrullus lanatus in Jinlin province to prochloraz and difenoconazole， the baseline sensitivities of S.citrulli strains （n=151） to the two fungicides and the minimum inhibitory concentrations （MICs） of the two fungicides to S.citrulli strains were determined by using mycelial growth rate method.The resistance levels of 375 stains from seven main watermelon production areas of Jinlin province to two fungicides were also determined.The results showed that the sensitivity frequency distribution of tested strains（n=151） to prochloraz and difenoconazole presented continuous single peak curves， which were close to normal distribution.The baseline sensitivities of S.citrulli strains to prochloraz and difenoconazole were （0.203 0±0.135 3）μg/mL and （0.675 9±0.394 2）μg/mL， respectively.The MICs of prochloraz and difenoconazole were 20 μg/mL and 40 μg/mL， respectively.The resistance frequencies of 375 tested strains to the two fungicides were both zero.The results provided a scientific basis for rational application of prochloraz and difenoconazole， and laid a foundation for the subsequent study on the resistance risk assessment.

Key words

Stagonosporopsis citrulli; fungicide resistance; prochloraz; difenoconazole

西瓜蔓枯病主要是由Stagonosporopsis citrulli引起的世界性病害，在西瓜整個(gè)生育期均可發(fā)病，危害西瓜葉片、莖稈、藤蔓和果實(shí)[12]。在適宜的溫度和濕度條件下，可迅速發(fā)展蔓延，大田種植時(shí)發(fā)病率可達(dá)20%～40%，溫室種植和連作時(shí)更可達(dá)80%，如管理不當(dāng)常常會(huì)造成毀滅性的損失，嚴(yán)重影響西瓜的品質(zhì)和產(chǎn)量[34]。目前關(guān)于西瓜蔓枯病的防治措施仍是以化學(xué)防治為主，咪鮮胺和苯醚甲環(huán)唑?qū)υ摬『哂幸娦Э?，防治效率高等?yōu)勢(shì)，備受瓜農(nóng)青睞[56]。2019年對(duì)吉林省西瓜蔓枯病菌的優(yōu)勢(shì)種Stagonosporopsis citrulli進(jìn)行了室內(nèi)藥劑敏感性的測(cè)定，試驗(yàn)結(jié)果表明病菌對(duì)咪鮮胺和苯醚甲環(huán)唑表現(xiàn)出了較高的敏感性。

自2005年首次報(bào)道水稻惡苗病菌對(duì)咪鮮胺出現(xiàn)抗性菌株，且抗性頻率為1.46%[7]，至今一些地區(qū)因不科學(xué)地使用咪鮮胺，使得水稻稻瘟病菌Magnaporthe oryzae [8]、菜心炭疽病菌Colletotrichum higginsianum [9]、小麥赤霉病菌Fusarium graminearum [10]和玉米小斑病菌Bipolaris maydis [11]等已對(duì)其產(chǎn)生抗藥性，但其中未有西瓜蔓枯病菌對(duì)咪鮮胺抗藥性方面的相關(guān)報(bào)道。劉順濤等對(duì)重慶、貴州地區(qū)西瓜蔓枯病菌對(duì)苯醚甲環(huán)唑的抗性研究結(jié)果表明，該地區(qū)仍以敏感菌株為主，但在重慶武隆和貴州息烽發(fā)現(xiàn)6株抗性菌株，抗性頻率為2.88%[12]。

咪鮮胺和苯醚甲環(huán)唑目前廣泛用于吉林省西瓜蔓枯病的防治，且用藥量較大，因此本研究對(duì)吉林省西瓜蔓枯病菌優(yōu)勢(shì)菌株對(duì)咪鮮胺和苯醚甲環(huán)唑抗藥性進(jìn)行監(jiān)測(cè)，為制定合理的用藥策略提供科學(xué)依據(jù)，也為后續(xù)研究西瓜蔓枯病菌對(duì)上述兩種藥劑的抗性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株

2018年-2019年連續(xù)兩年，在吉林省農(nóng)安縣、乾安縣、長嶺縣、通榆縣、洮南市、梨樹縣和雙遼市7個(gè)西瓜主產(chǎn)區(qū)采集具有西瓜蔓枯病癥狀的樣本，通過組織分離法共獲得526株菌株，經(jīng)三重PCR鑒定確認(rèn)為西瓜蔓枯病菌優(yōu)勢(shì)種S.citrulli。從中隨機(jī)挑選151株用于敏感基線的建立以及MIC值的確定，其余375株用于抗藥性監(jiān)測(cè)。

1.1.2 供試藥劑

98%咪鮮胺原藥（江蘇輝豐股份有限公司）和96%苯醚甲環(huán)唑原藥（山東省聯(lián)合農(nóng)藥工業(yè)有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 含藥培養(yǎng)基的配制

將供試藥劑均溶于丙酮，配制成1×104μg/mL的母液，于4℃冰箱貯存，備用[13]。

將母液用無菌水以10倍為梯度，依次稀釋成1×103、1×102、1×101、1、1×10-1μg/mL的藥液。再將PDA培養(yǎng)基與制好的藥液按體積比9∶1混合均勻制成不同濃度的含藥平板。

1.2.2 西瓜蔓枯病菌對(duì)咪鮮胺和苯醚甲環(huán)唑的敏感性測(cè)定

將供試菌株在PDA平板上培養(yǎng)4 d后，用滅菌的移液槍槍頭在菌落邊緣打取8 mm的菌餅移至含藥濃度分別為1×102、1×101、1、1×10-1、1×10-2μg/mL的PDA培養(yǎng)基中央，每個(gè)濃度處理重復(fù)3次，以加等量無菌水的正常PDA培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，在25℃恒溫、全光照、30% RH條件下培養(yǎng)至對(duì)照菌落直徑為培養(yǎng)皿直徑的2/3時(shí)，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑。

利用VBA軟件計(jì)算出藥劑對(duì)病原菌的毒力回歸方程y=a+bx，相關(guān)系數(shù)（r）以及有效抑制中濃度（EC 50）值。

用SPSS軟件繪制西瓜蔓枯病菌對(duì)咪鮮胺和苯醚甲環(huán)唑的敏感性頻率分布圖，根據(jù)野生敏感型病原群體對(duì)藥劑敏感性為正態(tài)分布的原理，確認(rèn)病原菌群體EC 50敏感性頻率分布是否呈正態(tài)分布或連續(xù)的單峰曲線，如果呈正態(tài)分布或連續(xù)的單峰曲線，就可將其群體EC 50均值作為病原菌對(duì)藥劑的敏感基線[14]。

1.2.3 咪鮮胺和苯醚甲環(huán)唑?qū)ξ鞴下莶【鶰IC值的確定及抗性監(jiān)測(cè)

將1.2.2中測(cè)定過EC 50的151株敏感菌株按相同方法制成8 mm菌餅，移至含咪鮮胺和苯醚甲環(huán)唑濃度均為10、20、30、40、50 μg/mL的PDA培養(yǎng)基中央，于25℃恒溫，全光照，30%RH培養(yǎng)，每個(gè)濃度處理均設(shè)3次重復(fù)。培養(yǎng)4 d后，觀察菌絲生長情況，將所有菌株均不能生長的最低濃度確認(rèn)為咪鮮胺和苯醚甲環(huán)唑?qū)ξ鞴下莶【舾芯甑淖畹鸵种茲舛燃碝IC（minimal inhibition concentration）。

將2018年-2019年采自吉林省7個(gè)縣市的375株西瓜蔓枯病菌菌株活化培養(yǎng)后，按1.2.2中方法制成菌餅分別移至含最低抑制濃度20 μg/mL咪鮮胺和40 μg/mL苯醚甲環(huán)唑的PDA培養(yǎng)基上，以含等量無菌水的PDA培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，均設(shè)3次重復(fù)，在25℃恒溫，全光照，30%RH條件下培養(yǎng)4 d后，觀察菌絲生長情況劃分抗性類型，并計(jì)算其抗性頻率。

抗性頻率=（抗性菌株數(shù)/總菌株數(shù)）×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 吉林省西瓜蔓枯病菌對(duì)咪鮮胺的敏感基線及抗性監(jiān)測(cè)

2.1.1 西瓜蔓枯病菌對(duì)咪鮮胺的敏感基線

咪鮮胺對(duì)吉林省西瓜主產(chǎn)區(qū)西瓜蔓枯病菌S.citrulli的EC 50范圍為0.059 3～0.590 7 μg/mL（表1）。不同地點(diǎn)的EC 50范圍：松原市乾安縣0.086 9～0.578 4 μg/mL，長嶺縣0.077 0～0.590 7 μg/mL;白城市洮南市0.064 7～0.535 8 μg/mL，通榆縣0.066 9～0.543 4 μg/mL;四平市雙遼市0.059 3～0.503 5 μg/mL，梨樹縣0.079 3～0.536 6 μg/mL;長春市農(nóng)安縣0.072 0～0.469 0 μg/mL。咪鮮胺對(duì)7個(gè)縣市西瓜蔓枯病菌的EC 50沒有顯著性差異，其中EC 50最小值為0.059 3 μg/mL，最大值為0.590 7 μg/mL，相差9.96倍。

根據(jù)測(cè)定的151株菌株對(duì)咪鮮胺的敏感性，繪制西瓜蔓枯病菌對(duì)咪鮮胺的敏感性分布圖（圖1）。其平均值為（0.203 0±0.135 3）μg/mL。供試的151株西瓜蔓枯病菌對(duì)咪鮮胺的敏感性頻率分布呈近似正態(tài)的單峰曲線，因此可將其EC 50平均值作為吉林省西瓜蔓枯病菌對(duì)咪鮮胺的敏感基線。

2.1.2 咪鮮胺對(duì)西瓜蔓枯病菌MIC值的確定及抗性監(jiān)測(cè)

通過菌絲生長速率法測(cè)定咪鮮胺對(duì)供試151株菌株的MIC值，確定其范圍在10～20 μg/mL之間。結(jié)合其敏感基線以及測(cè)得的MIC值，將20 μg/mL作為區(qū)分吉林省西瓜蔓枯病菌對(duì)咪鮮胺的抗性或敏感的濃度，即不能在含20 μg/mL咪鮮胺的PDA平板上生長的為敏感菌株。測(cè)定2018年-2019年采自吉林省的375株西瓜蔓枯病菌對(duì)咪鮮胺均敏感，未監(jiān)測(cè)到抗藥性菌株，抗性頻率為0（表2）。

2.2 吉林省西瓜蔓枯病菌對(duì)苯醚甲環(huán)唑的敏感基線及抗性水平

2.2.1 西瓜蔓枯病菌對(duì)苯醚甲環(huán)唑的敏感基線

苯醚甲環(huán)唑?qū)质∥鞴下莶【腅C 50范圍為0.162 2～1.563 0 μg/mL。如表3所示，按地區(qū)劃分其EC 50分別為：松原市乾安縣0.392 8～1.376 5 μg/mL，長嶺縣0.209 6～1.478 5 μg/mL;白城市洮南市0.230 4～1.465 1 μg/mL，

通榆縣0.163 7～1.465 2 μg/mL;四平市雙遼市0.173 9～1.563 0 μg/mL，梨樹縣0.287 8～1.497 6 μg/mL;長春市農(nóng)安縣0.162 2～1.325 8 μg/mL。苯醚甲環(huán)唑?qū)?個(gè)縣市西瓜蔓枯病菌的EC 50沒有顯著性差異，其中EC 50最小值為0.162 2 μg/mL，最大值為1.563 0 μg/mL，相差9.64倍。

根據(jù)測(cè)定的151株供試菌株對(duì)苯醚甲環(huán)唑的敏感性，繪制西瓜蔓枯病菌對(duì)苯醚甲環(huán)唑的敏感性頻率分布圖（圖2），其平均值為（0.675 9±0.394 2）μg/mL。供試的151株西瓜蔓枯病菌對(duì)苯醚甲環(huán)唑的敏感性頻率分布呈近似正態(tài)的單峰曲線，因此可將其EC 50平均值作為吉林省西瓜蔓枯病菌對(duì)咪鮮胺的敏感基線。

2.2.2 苯醚甲環(huán)唑?qū)ξ鞴下莶【鶰IC值的確定及抗性監(jiān)測(cè)

通過菌絲生長速率法測(cè)定苯醚甲環(huán)唑?qū)┰?51個(gè)菌株的MIC值在30～40 μg/mL之間，再結(jié)合其敏感基線，將40 μg/mL作為區(qū)分吉林省西瓜蔓枯病菌對(duì)苯醚甲環(huán)唑的抗性或敏感的濃度，即不能在含40 μg/mL苯醚甲環(huán)唑的PDA平板上生長的為敏感菌株。2018年-2019年采自吉林省的375株西瓜蔓枯病菌對(duì)苯醚甲環(huán)唑均敏感，未監(jiān)測(cè)到田間抗性菌株，田間抗性頻率為0（表4）。

3 結(jié)論與討論

西瓜蔓枯病是西瓜生產(chǎn)上的重要病害之一，目前仍以化學(xué)防治為主。近年來，咪鮮胺與苯醚甲環(huán)唑廣泛用于吉林省西瓜主產(chǎn)區(qū)西瓜蔓枯病的防治。及時(shí)了解西瓜蔓枯病菌對(duì)咪鮮胺和苯醚甲環(huán)唑的抗藥性對(duì)藥劑的合理使用尤為重要。本試驗(yàn)測(cè)定了吉林省7個(gè)西瓜主產(chǎn)區(qū)中151株西瓜蔓枯病菌對(duì)咪鮮胺和苯醚甲環(huán)唑的敏感性。咪鮮胺對(duì)西瓜蔓枯病菌的EC 50為0.059 3～0.590 7 μg/mL，苯醚甲環(huán)唑?qū)ξ鞴下莶【腅C 50為0.162 2～1.563 0 μg/mL，雖然不同菌株之間存在敏感性差異，但EC 50范圍相對(duì)較窄，且最大值與最小值相差倍數(shù)分別為9.96和9.64，說明這兩種殺菌劑對(duì)西瓜蔓枯病菌具有很高的抑制活性。

所測(cè)定的151株西瓜蔓枯病菌對(duì)咪鮮胺和苯醚甲環(huán)唑的敏感性頻率均呈近似正態(tài)分布的單峰曲線，病菌對(duì)咪鮮胺的敏感基線為（0.203 0±0.135 3）μg/mL，對(duì)苯醚甲環(huán)唑的敏感基線為（0.675 9±0.394 2）μg/mL。咪鮮胺和苯醚甲環(huán)唑?qū)?51株西瓜蔓枯病菌的MIC值分別為10～20 μg/mL及30～40 μg/mL，結(jié)合相應(yīng)敏感基線，確定20 μg/mL和40 μg/mL分別作為吉林省西瓜蔓枯病菌對(duì)咪鮮胺和苯醚甲環(huán)唑的抗性監(jiān)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)濃度。監(jiān)測(cè)了吉林省西瓜主產(chǎn)區(qū)375株西瓜蔓枯病菌對(duì)兩種藥劑的抗藥性，均未發(fā)現(xiàn)抗藥性菌株，抗性頻率為0。

劉順濤等報(bào)道重慶武隆、貴州息烽出現(xiàn)少量對(duì)苯醚甲環(huán)唑敏感性下降的亞群體，表現(xiàn)為低抗和中抗[12]。目前吉林省內(nèi)尚未發(fā)現(xiàn)對(duì)苯醚甲環(huán)唑產(chǎn)生抗藥性的西瓜蔓枯病菌菌株，可能與藥劑使用年限較短，用藥水平不高有關(guān)。祁之秋等報(bào)道脫甲基抑制劑（咪鮮胺）抗性發(fā)展緩慢，但長期使用也會(huì)出現(xiàn)抗藥性[15]。因此，應(yīng)加強(qiáng)定期抗性監(jiān)測(cè)工作，及時(shí)了解病原菌敏感性變化動(dòng)態(tài)，科學(xué)應(yīng)用咪鮮胺和苯醚甲環(huán)唑，以延緩病原菌對(duì)其產(chǎn)生抗藥性，從而延長咪鮮胺和苯醚甲環(huán)唑的使用年限且保證高效性。

通過對(duì)吉林省西瓜蔓枯病菌的抗藥性監(jiān)測(cè)來掌握該病原菌對(duì)咪鮮胺和苯醚甲環(huán)唑敏感性的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)及抗藥性，也為西瓜蔓枯病菌對(duì)咪鮮胺和苯醚甲環(huán)唑的抗藥性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估奠定基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：田 喆）