湖南煙草病毒病種類檢測與系統(tǒng)進化分析

董鵬 朱三榮 蔡海林 周向平 滕凱 匡傳富 單雪華 戴良英 唐前君 周志成 劉天波

摘 ?要：為明確湖南煙草病毒病的種類及分布狀況，利用小干擾RNA（siRNA）測序和反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）對湖南煙區(qū)樣品進行檢測，分析主要病毒侵染類型，最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹確定分類地位。結(jié)果表明，湖南煙草受到煙草普通花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）、黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）、馬鈴薯Y病毒（Potato virus Y， PVY）、番茄斑駁花葉病毒（Tomato mottle mosaic virus，ToMMV）、地黃花葉病毒（Rehmannia mosaic virus，ReMV）和辣椒輕斑駁病毒（Pepper mild mottle virus，PMMV）等6種病毒的侵染，其中ToMMV、ReMV、PMMV首次被檢測到，TMV、CMV和PVY是主要病毒，TMV為優(yōu)勢病毒，復合侵染是主要侵染類型，復合侵染率為71.29%;湖南煙草上的TMV分離物形成3個獨立組系，CMV分離物屬群組I的亞組IB，PVY分離物屬PVYNTN-a、PVYE和PVYSYR-I株系。本研究摸清了湖南煙草病毒種類、分布及侵染情況，明確了TMV、CMV、PVY的分類地位，為病毒病的防治提供了理論依據(jù)。

關鍵詞：煙草病毒病;siRNA檢測;侵染類型;系統(tǒng)進化分析

Abstract： Small interfering RNA （siRNA） and RT-PCR were used to detect the samples for determine the species and distribution of tobacco virus diseases in Hunan province， and the main virus infection types and the taxonomic status were clarified. The results showed that there were Tobacco mosaic virus （TMV）， Cucumber mosaic virus （CMV）， Potato virus Y （PVY）， Tomato mottle mosaic virus （TMV）， Rehmannia mosaic virus （ReMV） and Pepper mild mottle virus （PMMV）. Among them， ToMMV， ReMV and PMMV were tested in the first time in Hunan tobacco. TMV， CMV and PVY were the main viruses， and TMV was the dominant virus species， the mix-infection rate was 71.29%. TMV isolates in Hunan tobacco area formed three relatively independent populations， CMV isolates belonged to subgroup IB of group I， and PVY isolates belong to PVYNTN-a， PVYE and PVYSYR-I. In this study， the species， distribution and infection type of tobacco virus in Hunan tobacco area were found out， and the taxonomic status of TMV， CMV and PVY were clarified， which provided a theoretical basis for the prevention and control of tobacco virus diseases.

Keywords： tobacco virus disease; siRNA detection; infection type; phylogenetic analysis

煙草病毒病是煙草上普遍發(fā)生的一類病害，分布廣泛，危害嚴重，直接影響煙葉的產(chǎn)量和品質(zhì)，給煙葉生產(chǎn)帶來較大的損失[1]。目前中國已鑒定的煙草病毒病有近25種，主要有煙草普通花葉病毒?。═obacco mosaic virus， TMV）、黃瓜花葉病毒病（Cucumber mosaic virus， CMV）、馬鈴薯Y病毒?。≒otato virus Y， PVY）、煙草蝕紋病毒?。═obacco etch virus， TEV）和煙草脈帶花葉病毒?。═obacco vein banding mosaic virus， TVBMV）[2-3]。近年來，我國煙草病毒病危害呈日趨嚴重且復雜多變的趨勢，同一煙區(qū)不同年份引起煙草病毒病流行的優(yōu)勢毒原不斷變化，多種病毒復合感染現(xiàn)象日益嚴重，一些新病毒侵染煙草越來越多[4-5]。湖南是我國煙草主產(chǎn)區(qū)，病毒病嚴重影響湖南煙葉產(chǎn)量和質(zhì)量。肖啟明等[6] 在上世紀90年代提出了湖南煙區(qū)病毒主要有CMV、TMV、PVY和煙草環(huán)斑病毒（Tobacco ring spot virus，TRSV）等，CMV為優(yōu)勢病毒。巢進等[7]檢測發(fā)現(xiàn)湖南煙區(qū)的病毒病主要是TMV和CMV，優(yōu)勢病毒已由CMV轉(zhuǎn)變?yōu)門MV。滕躍輝[8]、齊益[9]、劉春如等[10]分別對湖南長沙、永州和衡陽煙草病毒進行檢測，發(fā)現(xiàn)主要病毒是TMV、CMV和PVY，三者復合侵染現(xiàn)象普遍。隨著氣候、耕作制度、種植品種、產(chǎn)區(qū)調(diào)整等變化，湖南煙草病毒病種類是否發(fā)生變化尚不清楚。因此，重新調(diào)查湖南煙草病毒病種類，明確優(yōu)勢種類及侵染情況，對指導煙草病毒病防控具有重要意義。本研究從湖南煙區(qū)取樣，利用小干擾RNA（siRNA）測序和RT-PCR檢測，分析湖南煙草TMV、CMV和PVY的分布、侵染類型和分類地位，旨在明確目前湖南煙草病毒病的種類和分布情況，為病毒病的防治提供依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?試驗材料

2017—2018年從湖南郴州、永州、長沙、衡陽、湘西州等5個煙區(qū)采集表型為花葉、畸形、閃電紋、脈壞死、蝕刻、環(huán)斑、皺縮等煙草樣品303份，樣品經(jīng)液氮速凍后于?80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 ?煙草總RNA的提取

取1 g煙葉樣品，使用TransGen Biotech公司的EasyPure? Plant RNA Kit試劑盒提取總RNA，具體方法參照試劑使用說明。提取的RNA于?80 ℃保存。

1.3 ?siRNA測序

小RNA文庫構(gòu)建及測序均由測序公司完成。siRNA測序文庫制備采用TruSeqTM Small RNA Sample Prep Kits（Illumina， San Diego， USA）試劑盒，測序平臺為Illumina Hiseq 2000/2500。

1.4 ?樣品siRNA測序病毒分析

參照王浩軍等[11]的方法去除低質(zhì)量、未插入3'接頭和5'接頭的reads，選取不小于18 nt的reads。所得序列去除3'接頭，處理后的序列用軟件velvet version 1.1.06 進行短序列組裝，組裝的重疊群分別尋找高度同源序列（同源性大于90%）和部分同源序列（同源性低于90%），篩選與已知病毒序列具有同源性的重疊群。

1.5 ?病毒RT-PCR驗證

以siRNA測序分析獲得的病毒重疊群為參考序列，根據(jù)文獻報道合成不同病毒的特異檢測引物（表1），采用RT-PCR方法驗證測序結(jié)果，進一步確定樣品中病毒種類。

1.6 ?TMV、CMV和PVY的檢測

參照楊金廣等[12]報道的TMV、CMV和PVY檢測引物和體系，進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物送測序公司測序，計算檢出率。

1.7 ?TMV、CMV和PVY 系統(tǒng)發(fā)育分析

以檢測獲得的湖南煙區(qū)部分TMV、CMV和PVY的分離物CP基因序列為對象，結(jié)合NCBI上下載的不同國家或地區(qū)侵染煙草TMV、CMV和PVY CP基因序列，分別選取近緣物種番茄花葉病毒（Tomato mosaic virus， ToMV）、花生矮化病毒（Peanut stunt virus， PSV）和馬鈴薯X 病毒（Potato virus X， PVX）分離物作為外群，樣品編號或登記號和來源地區(qū)或報道國家見表2。采用MEGA 5.0中的Clustral W[17]軟件進行序列比對，利用最大似然法（Maximum likelihood， ML）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，明確TMV，PVY和CMV的分類地位。

2 ?結(jié) ?果

2.1 ?siRNA測序檢測病毒種類

2.1.1 ?siRNA測序結(jié)果 ?siRNA測序得到21047020個reads （共組裝成4083條重疊群），對獲得的序列進行短序列組裝，從組裝的重疊群中尋找高度同源序列和部分同源序列，篩選與病毒同源的重疊群。從比對結(jié)果看，4083條重疊群中有4057個高度重疊群，與TMV、PVY、CMV、番茄斑駁花葉病毒（Tomato mottle mosaic virus， ToMMV）、地黃花葉病毒（Rehmannia mosaic virus， ReMV）、辣椒輕斑駁病毒（Pepper mild mottle virus， PMMV）和甜椒斑駁病毒（Bell pepper mottle virus， BPeMV）等7種病毒高度同源，TMV、PVY、CMV居前3位（圖1）。

不同煙區(qū)的測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)（表3），長沙、衡陽和永州等3個煙區(qū)TMV和PVY同源重疊數(shù)居前二位，郴州和湘西煙區(qū)TMV和CMV居前二位，說明TMV、PVY和CMV是湖南煙區(qū)主要病毒。在永州、郴州樣本中還檢測到了20個重疊群與番茄花葉病毒（Tomato mosaic virus，ToMV），6個重疊群與BPeMV部分同源的病毒。

2.1.2 ?siRNA測序結(jié)果驗證 ?采用RT-PCR方法對siRNA測序得到的可能存在的8種病毒進行驗證，結(jié)果顯示，能夠檢測到TMV、CMV、PVY、ReMV、ToMMV、PMMV等6種病毒目的條帶（圖2），沒有檢測到ToMV和BPeMV，RT-PCR產(chǎn)物測序的結(jié)果與目的片段序列一致，確證煙草樣品中存在這6種病毒，而ToMV和BPeMV可能不存在。

2.2 ?TMV、CMV和PVY檢出率及侵染情況

2.2.1 ?TMV、CMV和PVY檢出率 ?利用RT-PCR檢測TMV、CMV、PVY 3種主要病毒（表4），結(jié)果發(fā)現(xiàn)TMV檢出率最高，為83.2%，其次為CMV（63.04%）和PVY（42.9%）。衡陽、郴州、永州、湘西煙區(qū)檢出率趨勢一致，表現(xiàn)為TMV>CMV> PVY，長沙煙區(qū)為TMV>PVY>CMV。5個煙區(qū)TMV檢出率均在80%以上，最高為衡陽（84.85%），CMV檢出率最高為湘西州（67.19%），PVY檢出率最高為長沙（70%）。

2.2.2 ?TMV、CMV和PVY侵染情況分析 ?從侵染

類型看（表5），單一病毒侵染率為28.71%，復合侵染率為71.29%。單一病毒侵染率最高為TMV（15.51%），其次為CMV（7.59%）;復合侵染檢出率最高為TMV+CMV（35.97%），其次為PVY+TMV+ CMV（17.82%）。從地區(qū)分布來看，5個煙區(qū)單一侵染率最高均為TMV，最低有所不同，長沙、衡陽、郴州、永州單一侵染最低為CMV，湘西州最低為PVY;衡陽、郴州、永州復合侵染率最高為TMV+ CMV，最低為CMV+PVY;長沙最高為TMV+CMV+ PVY，最低為CMV+PVY;湘西最高為TMV+CMV，最低為TMV+CMV+PVY。

2.3 ?TMV、CMV和PVY系統(tǒng)進化分析

2.3.1 ?TMV 系統(tǒng)進化分析 ?由圖3看出，不同煙區(qū)TMV分離物屬于不同組系，親緣關系相對較遠，其中湘西花垣分離物與Shanxi-China分離物屬同一個分支，衡陽常寧、衡陽縣和永州寧遠分離物與其親緣關系較近;郴州嘉禾和湘西永順分離物與Yunnan-China分離物親緣關系較近，永州江永、江華和新田分離物，衡陽衡南和耒陽分離物與tNK-Russian和pet-Korea分離物屬同一個分支，長沙瀏陽、郴州永興和湘西龍山分離物與它們的親緣關系較近;郴州桂陽分離物與vulgare-Germany和a-Spain分離物屬于同一個分支，長沙瀏陽和湘西鳳凰分離物與它們的親緣關系相對較近。說明湖南煙草上TMV分離物存在比較廣泛的遺傳多樣性。

2.3.2 ?CMV系統(tǒng)進化樹分析 ?由圖4看出，CMV分離物均處在同一分支，屬于組系I中的亞組IB，可見湖南煙草上CMV分離物變異程度低，遺傳多樣性低。長沙寧鄉(xiāng)分離物與Tfn-Italy-IB株系和NT9-Tai-Wan-IB株系親緣關系最近，其他煙區(qū)分離物與SD-China-IB株系親緣關系近。

2.3.3 ?PVY系統(tǒng)進化樹分析 ?由圖5看出，不同煙區(qū)PVY分離物處于不同分支，分屬不同株系類型，長沙瀏陽和寧鄉(xiāng)分離物，湘西鳳凰和花垣分離物，?郴州嘉禾、永興和宜章分離物，永州寧遠和湘西龍山分離物遺傳距離較近，屬于PVYSYR-I株系;湘西永順分離物屬于PVYNTN-a株系;郴州桂陽和衡陽縣分離物屬于PVYE株系;永州江華、江永和新田分離物，衡陽衡南、常寧和耒陽分離物分別形成獨立分支，可能為新株系類型。表明湖南煙草上PVY分離物存在較大的遺傳差異，可能存在新株系類型。

3 ?討 ?論

病毒病是煙葉生產(chǎn)上的一類重要病害，分布廣泛、類型多樣。利用siRNA測序檢測發(fā)現(xiàn)湖南煙區(qū)有TMV、CMV、PVY、ReMV、ToMMV和PMMV等6種病毒，首次檢測到ToMMV、ReMV、PMMV，但未檢測出馬鈴薯X病毒、煙草蝕紋病毒和煙草環(huán)斑病毒，可能與煙草品種差異或者采樣覆蓋面低有關。因此，為了全面反映湖南煙草病毒的現(xiàn)狀，尚需增加待測病毒取樣范圍和樣品類型。

隨著全球氣候的變化、耕作制度變革和農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整，煙草主要病毒病不斷變化。20世紀60年代前， TMV危害最嚴重，60年代CMV危害日趨嚴重，70年代以TMV、TMV與CMV復合侵染為主;90年代PVY由次要病害上升為主要病害，20世紀末至21世紀初PVX危害逐漸加重[17];2009—2012年，全國煙草病毒已由PVY轉(zhuǎn)為TMV和CMV[18]。就湖南煙區(qū)而言，肖啟明等[6]、巢進等[7]分別在1993年和2008年檢測發(fā)現(xiàn)湖南煙草優(yōu)勢病毒分別是TMV和CMV。本研究發(fā)現(xiàn)湖南煙草TMV檢出率最高，其次為CMV和PVY，TMV為優(yōu)勢病毒?？梢?，湖南煙草優(yōu)勢病毒已由CMV轉(zhuǎn)為TMV，結(jié)果與劉勇等[19]、羅朝鵬等[20]研究結(jié)果一致。

病毒在田間復合侵染發(fā)生普遍，復合侵染已成為病毒危害的主要方式。青玲等[2]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)我國7個主要煙區(qū)5種病毒存在9種復合侵染，復合侵染率為62.26%。羅朝鵬等[20]發(fā)現(xiàn)湖北、云南、貴州等省不同年份主要病毒種類和復合侵染類型不同。劉勇等[19]和巢進等[7]在2006年和2008年檢測發(fā)現(xiàn)湖南煙草病毒復合侵染率分別為28.38%和5.96%。本研究發(fā)現(xiàn)湖南煙草病毒復合侵染率為71.29%，單一侵染率僅為28.71%?？梢姡蠠焻^(qū)病毒復合侵染已成為主要侵染類型，且日益嚴重。推測可能是隨著植煙時間延長，特別是長期的連作，病毒在田間積累日益增多;生產(chǎn)上缺少高抗品種，且品種比較單一，加重了病毒病的發(fā)生，從而也加重了病毒的復合侵染。

我國煙草上TMV的種群遺傳結(jié)構(gòu)相對比較保守，而CMV種群內(nèi)遺傳分化現(xiàn)象明顯，具有豐富的遺傳多樣性，PVY株系分化現(xiàn)象也比較明顯，具有多個株系[21]。宋麗云[22]對我國17個植煙區(qū)TMV分離物分析發(fā)現(xiàn)51個分離物同屬一個種群，來自不同地區(qū)的分離物之間其基因序列表現(xiàn)出一定的差異和分化。劉勇等[19]檢測發(fā)現(xiàn)湖南煙區(qū)CMV株系主要為亞組I，占比94.1%。趙雪君等[23]發(fā)現(xiàn)四川煙區(qū)PVY有著明顯的株系分化現(xiàn)象，PVYN：O、PVYO、PVYN均有發(fā)生。謝思等[24]發(fā)現(xiàn)湖南煙區(qū)PVY優(yōu)勢株系為PVYN，PVYE株系少量發(fā)生，且首次在湖南檢測到PVYNTN株系。本研究發(fā)現(xiàn)湖南煙區(qū)TMV分離物形成3個相對獨立的種群，不同煙區(qū)的TMV分離物親緣關系相對較遠，種群間具有一定的地理特異性;CMV分離物處于同一分支，屬組系I中的亞組IB;PVY分離物屬不同株系類型，大多數(shù)屬PVYSYR-I株系，也有湘西永順分離物屬PVYNTN-a株系，郴州桂陽和衡陽縣分離物屬PVYE株系，永州和衡陽分離物可能為重組新株系。TMV、CMV株系情況與宋麗云[22]、劉勇等[19]研究結(jié)果一致，PVY株系情況與趙雪君等[23]研究結(jié)果稍有不同，與謝思等[24]的結(jié)果差異很大。在研究系統(tǒng)進化上，ML法是較為常用的一種方法。然而，僅僅基于CP基因進行系統(tǒng)分析，也可能導致誤判，還需基于不 ? 同功能基因進一步分析。下一步將綜合應用系統(tǒng)發(fā)育、重組和遺傳進化分析等方法，研究湖南煙草主要病毒變異進化規(guī)律，為病毒病防治提供理論支撐。

4 ?結(jié) ?論

從湖南煙區(qū)采集了303個煙草病毒病樣品，共檢出TMV、CMV、PVY、ToMMV、ReMV、PMMV等6種病毒，其中TMV為優(yōu)勢病毒。病毒復合侵染為主，TMV+CMV復合侵染檢出率最高。TMV分離物形成3個相對獨立的組系，所有CMV分離物屬于群組I的亞組IB，PVY分離物分屬PVYE、PVYNTN-a和PVYSYR-I株系。本研究摸清了湖南煙區(qū)病毒種類、分布及復合侵染情況，為病毒病的防治提供了理論依據(jù)。

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