拮抗煙草疫霉菌的木霉菌株篩選鑒定及防病促生作用研究

李小杰 李成軍 姚晨虓 宋瑞芳 劉暢 邱睿 陳玉國 白靜科 李淑君

摘 ?要：為了獲得對煙草黑脛病菌具有較好拮抗效果的木霉菌株，從河南省各煙區(qū)煙草根莖類病害發(fā)生較重?zé)熖锝】禑熤甑母H土壤中共分離獲得疑似木霉菌28株，通過平板對峙培養(yǎng)，篩選出菌株XYPQ-1、ZMD-1和XYLS-5對煙草疫霉菌具有較強抑制作用，5 d后抑菌率達90%以上。利用分子生物學(xué)方法分別將其鑒定為綠木霉菌（Trichoderma virens）、擬康寧木霉菌（Trichoderma koningiopsis）和近漸綠木霉菌（Trichoderma paraviridescens）。對其代謝物抑菌活性及防病促生效果進行了初步研究，結(jié)果表明，3種木霉菌產(chǎn)生的揮發(fā)性和非揮發(fā)性代謝物均對疫霉菌具有明顯的抑制作用，其中XYLS-5的抑制效果最好，處理后5 d，其揮發(fā)性和非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的抑菌率分別達61.71%和100.00%。3種木霉菌對煙草黑脛病均具有較好的室內(nèi)防效，其中XYLS-5的防效最高，達80%以上，且具有促進煙草種子萌發(fā)和根系生長的作用，可作為煙草黑脛病生物防治的拮抗菌加以開發(fā)應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：煙草黑脛病;木霉菌;拮抗作用;促生

Abstract： In order to acquire Trichoderma strains with preferable inhibitory effect on tobacco black shank， twenty-eight strains of Trichoderma were isolated from rhizosphere soil of uninfected tobacco plants in Henan province. The strains of XYPQ-1， ZMD-1 and XYLS-5 exhibiting better inhibitory effects on Phytophthora nicotianae were screened out by plate confrontation， with inhibitory rate of more than 90% after five days. Based on molecular biological analysis， the three Trichoderma strains were identified as Trichoderma virens， Trichoderma koningiopsis and Trichoderma paraviridescens， respectively. The antifungal activity of metabolites and the antagonistic effect were also studied. The results showed that both the volatile and non-volatile metabolites of the three Trichoderma spp. had inhibitory effect on P. nicotianae， and the strain XYLS-5 exhibited the optimal inhibitory effect， with its inhibition rate of volatile and non-volatile metabolites achieving 61.71% and 100.00%， respectively. The three Trichoderma strains could control tobacco black shank in greenhouse， among which strain XYLS-5 performed the optimal control efficiency exceeding 80% and could promote seed germination and root growth of tobacco. Results indicated that strain XYLS-5 can be used as antagonist for controlling tobacco black shank.

Keywords： tobacco black shank; Trichoderma; antagonism; growth promotion

由寄生疫霉煙草致病型（Phytophtora parasitica var.nicotianae Tucker）引起的煙草黑脛病是煙草生產(chǎn)上最具毀滅性的病害之一，目前在我國大部分煙區(qū)均有發(fā)生，其中云南、貴州、四川、湖南、湖北、重慶、河南、山東等煙區(qū)較為嚴(yán)重[1-2]。

隨著人們對生態(tài)環(huán)境和食品安全意識的提高，煙草綠色防控理念不斷深入人心，生物防治技術(shù)因其能夠減少化學(xué)農(nóng)藥殘留、降低環(huán)境污染和維護生態(tài)平衡而越來越受到重視。目前對于煙草黑脛病的生物防治，主要是運用生防因子如拮抗微生物、抗生素和植物誘導(dǎo)抗性因子等，其中利用生防菌株預(yù)防煙草黑脛病發(fā)生并減輕危害的報道已有很多。李小杰等[3]篩選出一株多粘芽孢桿菌，對煙草疫霉菌的抑制作用強且效果穩(wěn)定，抑菌率達60.6%。彭閣等[4]篩選出5株對煙草黑脛病菌具有抑制效果的真菌，對煙草黑脛病具有較好防效。徐同偉等[5]篩選出2株芽孢桿菌能有效防治煙草黑脛病，且能促進煙苗的生長與發(fā)育。王靜等[6]從黑脛病煙田健康煙株根際土壤中分離到一株對煙草黑脛病菌具有較強抑制作用的放線菌，室內(nèi)防效達70%以上。

木霉屬（Trichoderma spp.）是一種分布廣泛、環(huán)境適應(yīng)性強和抑菌譜廣的絲狀真菌，也是目前國內(nèi)外研究應(yīng)用最廣泛的一類生防真菌，已被報道對多種植物病原真菌具有較好的拮抗效果[7-11]，在生物防治煙草黑脛病方面也有諸多報道[4，12-14]，但有關(guān)河南省防治煙草黑脛病高效木霉菌篩選鑒定及其拮抗機理研究的報道還不多[15]。

本研究從河南省各主產(chǎn)煙區(qū)根莖類病害發(fā)生較重?zé)熖锝】禑熤甑母H土壤中分離篩選出對煙草疫霉菌具有較好抑制作用的木霉菌株，并對其進行分子鑒定，初步分析其代謝物抑菌活性及對煙草黑脛病的防控和促生長效果，以期為開發(fā)微生物制劑和生物農(nóng)藥提供理論依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?試驗材料

1.1.1 ?供試菌株 ?煙草黑脛病病原為煙草疫霉菌（Phytophthora nicotianae），由本實驗室（煙草行業(yè)黃淮煙區(qū)煙草病蟲害綠色防控重點實驗室）分離保存。

1.1.2 ?培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件 ?煙草疫霉菌采用燕麥培養(yǎng)基（OA），在25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)14～21 d，每皿加入滅菌的0.1%硝酸鉀和1%葡萄糖溶液20 mL，繼續(xù)培養(yǎng)3 d，誘導(dǎo)孢子囊產(chǎn)生。將培養(yǎng)皿放到4 ℃冰箱中30 min，促使孢子囊釋放游動孢子，25 ℃放置20 min，用無菌水調(diào)整游動孢子濃度為1×104個/mL備用。木霉菌分離純化采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）;發(fā)酵培養(yǎng)采用馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（PDB），培養(yǎng)溫度27 ℃，初始pH 6.0、轉(zhuǎn)速180 r/min、裝瓶量150 mL，發(fā)酵時間為9 d，用無菌水調(diào)整孢子濃度為1×105個/mL。

1.2 ?試驗方法

1.2.1 ?煙田土壤中對煙草疫霉菌有拮抗作用的木

霉菌的分離篩選 ?從河南省各主產(chǎn)煙區(qū)煙草根莖類病害發(fā)病較重的煙田采集健康煙株根際土壤樣品，參照文獻[14-15]，采用平板梯度稀釋法，用無菌水制成10?3、10?4、10?5、10?6梯度土壤懸浮液，分別取200 μL涂布于PDA培養(yǎng)基上，于25 ℃培養(yǎng)2 d后挑取菌落邊緣的菌絲，得到純化的木霉菌，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

采用平板對峙培養(yǎng)法[15]，取活化后直徑約為5 mm的煙草疫霉菌菌餅，接種至OA培養(yǎng)基上，在距離疫霉菌菌餅約5 cm處放置分離木霉菌菌餅，以不接種木霉菌為對照，每處理設(shè)3次重復(fù)。25 ℃恒溫培養(yǎng)，每日測量病原菌落生長半徑，觀察記錄木霉菌與病原菌落的相互作用情況，5 d后計算抑菌率。抑菌率（%）=（對照菌落的半徑?對峙培養(yǎng)煙草疫霉菌落的半徑）/對照菌落的半徑×100%。

1.2.2 ?分離獲得的木霉菌分子生物學(xué)鑒定 ?參照Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒（上海生工）說明書，提取霉菌基因組DNA作為模板，應(yīng)用真菌鑒定通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGA ACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTT ATTGATATGC-3′）進行PCR擴增。擴增體系（25 μL）為：2×PCR Taq MasterMix 15 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，DNA模板1 μL，雙蒸水補足到25 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min;95 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，28個循環(huán);72 ℃延伸8 min。將PCR產(chǎn)物進行1.0%瓊脂糖凝膠電泳，觀察擴增條帶明亮單一后送上海英濰捷基貿(mào)易有限公司進行測序，應(yīng)用NCBI（https：//blast.ncbi.nlm. nih.gov/Blast.cgi）進行在線序列比對分析。選擇同源性較高的序列用MEGA軟件的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 ?木霉菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對煙草疫霉菌的抑制作用測定 ?采用對扣培養(yǎng)法[16-17]，將木霉菌菌餅接種于PDA培養(yǎng)基中央，疫霉菌菌塊接種到另一個PDA平板中央，兩皿中間隔一層滅菌濾膜對扣，用封口膜密封后木霉平板正面朝上放入培養(yǎng)箱，以不接木霉只接疫霉菌菌塊對扣作為對照。3次重復(fù)，25 ℃恒溫培養(yǎng)，每天觀察菌落生長情況，5 d后測量疫霉菌落直徑并計算抑菌率。

1.2.4 ?木霉菌非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對煙草疫霉菌的抑制作用測定 ?參照文獻[17]，在OA平板上平鋪滅菌雙層濾膜（孔徑0.22 μm），用無菌打孔器打取菌落邊緣直徑為0.5 cm的木霉菌塊接入濾膜中央，25 ℃恒溫培養(yǎng)，待木霉菌長滿濾膜前，用鑷子將濾膜連同木霉菌絲揭去，在原位置接入直徑為0.5 cm的疫霉菌菌塊。以在新的OA平板上接種疫霉菌菌塊作為對照。每處理3個重復(fù)，每天觀察菌落生長情況，5 d后測量疫霉菌落直徑并計算抑菌率。

1.2.5 ?試管煙苗室內(nèi)接種試驗 ?將生長20 d的煙苗置于2 mL滅菌離心管中，每管同時加入1.5 mL木霉菌發(fā)酵液（濃度為1×105個孢子/mL）和0.5 mL煙草疫霉菌孢子懸浮液（濃度為1×104個/mL），設(shè)置3個重復(fù)，每個重復(fù)接種10株煙苗，以1.5 mL清水和0.5 mL疫霉菌孢子懸浮液的混合物為接種對照，同時以清水為空白對照。接種后觀察煙株發(fā)病情況，參照國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 23222—2008進行分級，計算發(fā)病率和病情指數(shù)。相對防效按煙草病害藥效試驗方法YC/T 40—1996計算。

1.2.6 ?木霉菌發(fā)酵液促生作用的測定 ?將消毒后的煙草種子先用無菌水浸泡，再用木霉菌發(fā)酵液（濃度為1×105個孢子/mL）浸泡12 h，然后用無菌水沖洗3次，將種子置于培養(yǎng)皿中，脫脂棉和滅菌濾紙保濕，黑暗下催芽，48 h后統(tǒng)計發(fā)芽率，第11天測量煙苗的根長。另以無菌水作對照，每皿20粒種子，3次重復(fù)。

1.3 ?數(shù)據(jù)分析

利用DPS 7.05軟件進行差異顯著性檢驗，采用Duncan新復(fù)極差法進行多重比較。

2 ?結(jié) ?果

2.1 ?煙草黑脛病拮抗木霉菌的分離和篩選

采用平板梯度稀釋法從土壤樣品中共分離出疑似木霉菌28株，通過平板對峙培養(yǎng)篩選出5株對煙草疫霉菌具有明顯拮抗作用的菌株，其中編號XYPQ-1、ZMD-1和XYLS-5的菌株對疫霉菌抑制效果較好，5 d后抑菌率分別為94.81%、96.33%和97.07%（表1），7 d后將病原菌菌落全部覆蓋（圖1）。

2.2 ?木霉菌的分子生物學(xué)鑒定

以ITS1、ITS4為引物對菌株XYPQ-1、ZMD-1和XYLS-5的基因組ITS區(qū)段序列進行PCR擴增，得到大小為600 bp左右的特異性條帶，測序結(jié)果顯示這3個菌株的擴增片段大小分別為591、585和551 bp。通過Blast比對分析，發(fā)現(xiàn)與木霉屬（Trichoderma）的相似性均達100%。構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹可分為3個分支，其中菌株XYPQ-1與綠木霉菌（T. virens）位于同一進化分支，菌株ZMD-1與擬康寧木霉菌（T. koningiopsis）位于同一進化分支，菌株XYLS-5與近漸綠木霉菌（T. paraviridescens）位于同一進化分支（圖2）。

2.3 ?木霉菌代謝產(chǎn)物對煙草疫霉菌的抑制作用

由表2可以看出，3株木霉菌產(chǎn)生的揮發(fā)性和非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對疫霉菌菌絲的生長均具有不同程度的抑制作用。其中木霉菌XYLS-5的抑制效果最好，處理后5 d，其揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的抑菌率達60%以上，非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的抑菌率達到了100.00%，極顯著高于其他兩株木霉菌。木霉菌ZMD-1和XYPQ-1的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物對疫霉菌的抑制率較低，但非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的抑菌率較高，達到50.00%以上。

2.4 ?木霉菌發(fā)酵液對煙草黑脛病的室內(nèi)防控效果

試管苗接種試驗結(jié)果表明，接種后15 d，木霉菌XYLS-5、XYPQ-1和ZMD-1發(fā)酵液處理的煙苗明顯比疫霉菌對照處理的煙苗發(fā)病輕（圖3），發(fā)病率和病情指數(shù)均極顯著低于對照處理，防效分別可達80.47%、75.68%和51.58%（表3）。由此表明，上述3株木霉菌對煙草黑脛病具有較好的室內(nèi)防效。

2.5 ?木霉菌發(fā)酵液對煙草種子萌發(fā)和根系生長的影響

促生試驗結(jié)果表明，木霉菌XYLS-5、XYPQ-1和ZMD-1發(fā)酵液處理的煙草種子萌發(fā)率均高于清水對照，其中ZMD-1發(fā)酵液處理與對照處理之間差異達到了顯著水平（圖4）。3株木霉菌發(fā)酵液處理的煙苗根系明顯比清水對照的根系長（圖5），尤其是木霉菌XYLS-5發(fā)酵液處理與對照處理之間達到了極顯著差異水平（圖4）。由此表明，3株木霉菌具有較好的促生長作用。

3 ?討 ?論

木霉屬是一類十分重要的真菌，在植物根際、葉圍，土壤和植物殘體中均可生存。木霉屬真菌種類繁多，目前已發(fā)現(xiàn)有250余種（http：//www. indexfungorum.org）。我國在河北、浙江、云南、遼寧、山東、西藏等地開展了木霉菌資源收集與鑒定工作，鑒定出多種木霉菌，包括頂孢木霉（T. fertile）、鉤狀木霉（T. hamatum）、黃綠木霉（T. aureoviride）、短致木霉（T. brevicompactun）、淡黃木霉（T. cerinum）、綠孢木霉（T. chlorosporum）、桔綠木霉（T. citrinoviride）等[18-19]。在農(nóng)業(yè)方面，哈茨木霉（T. harzianum）、綠木霉（T. virens）、深綠木霉（T. atroviride）、長枝木霉（T. longibrachiatum）、擬康寧木霉（T. koningiopsis）和棘孢木霉（T. asperellum）等常被用作生防菌防治各種作物、蔬菜和水果病害[9，11，20-22]。本研究篩選出的3株對煙草疫霉菌具有較強抑制作用的木霉菌株，分別為綠木霉（T. virens）、擬康寧木霉（T. koningiopsis）和近漸綠木霉菌（T. paraviridescens），其中近漸綠木霉菌XYLS-5對煙草疫霉菌的抑制效果最好，其發(fā)酵液對煙草黑脛病的室內(nèi)防效可達80%以上，且能夠促進煙草種子萌發(fā)和根系生長。雖然近漸綠木霉菌被報道在我國廣泛分布[23-24]，但目前未見其防控植物病害的相關(guān)報道，本研究屬首次報道。

本研究木霉菌的室內(nèi)防效試驗中采用試管苗水培接種法，結(jié)果表明此方法可使煙苗正常發(fā)病，且接種后發(fā)病時間短，影響因素單一，操作性和可重復(fù)性強，能更直觀地反映煙株發(fā)病情況和木霉菌對病原菌的抑制效果，這與其他相關(guān)研究報道中常使用孢子懸浮液灌根接種法[9，21-22]有所不同。

木霉菌具有重寄生、競爭、抗生、誘導(dǎo)抗性和協(xié)同拮抗等多重生防機制[25-26]，其中，抗生作用主要是指生防菌分泌某些次生代謝產(chǎn)物（如木霉素、抗菌肽、抗生素等）抑制病原菌生長。據(jù)報道[27]，已從木霉中分離出具有抗生作用的代謝產(chǎn)物180多種。本研究對篩選出的3種拮抗木霉菌進行了代謝產(chǎn)物抑菌活性分析，初步證明了木霉菌揮發(fā)性和非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物均具有抑菌活性，其中非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的抑菌活性最強。下一步將對非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的抑菌活性物質(zhì)成分進行深入分析，為生防制劑或生物農(nóng)藥的研發(fā)提供新的有利資源。

4 ?結(jié) ?論

本研究篩選出的綠木霉菌（T. virens）XYPQ-1、擬康寧木霉菌（T. koningiopsis）ZMD-1和近漸綠木霉菌（T. paraviridescens）XYLS-5對煙草疫霉菌均具有較強的抑制作用，對峙培養(yǎng)5 d后抑菌率達90%以上。3種木霉菌產(chǎn)生的代謝物均對疫霉菌具有抑制作用，且對煙草黑脛病具有較好防效，其中木霉菌XYLS-5的防效最高，且能夠促進煙草種子萌發(fā)和根系生長，具有較好的生防應(yīng)用前景。

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