調(diào)控Runx2 的重力敏感miRNA 的篩選研究

張麗君，王 可，王藝璇，胡澤兵，李高志，石 菲，曹新生，張 舒

空軍軍醫(yī)大學(xué) 航空航天生物動(dòng)力學(xué)教研室，航空航天醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西西安 710032

人類在長期進(jìn)化過程中，逐漸形成了與地球重力相適應(yīng)的生理結(jié)構(gòu)和功能，但在航天活動(dòng)中，長期的失重狀態(tài)和航天飛行使航天員骨骼的骨鈣代謝水平發(fā)生進(jìn)行性、累積性的變化[1-2]，進(jìn)而導(dǎo)致骨密度下降和骨礦鹽含量的再分布。正常狀態(tài)下，成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨生成與破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收之間維持平衡[3-4]，但在失重條件下這種平衡狀態(tài)被打破，表現(xiàn)為骨生成減少和骨吸收增多，其中成骨細(xì)胞的功能障礙成為失重性骨丟失的重要原因[5]。

miRNA 是一組長度為20 ～ 24 個(gè)核苷酸的非編碼RNA，可調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄后的沉默，對細(xì)胞的分化、凋亡等功能至關(guān)重要。Runx2(Runt-related transcription factors 2) 是成骨譜系的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，其表觀遺傳功能可調(diào)節(jié)骨相關(guān)基因的表達(dá)，研究已證實(shí)失重或模擬失重條件下Runx2 的表達(dá)明顯受抑制[6-7]，但其詳細(xì)機(jī)制仍未完全闡明。雖然已有研究報(bào)道模擬失重條件下多個(gè)miRNA 通過作用于不同的靶基因可調(diào)控成骨分化[8-11]，部分miRNA 也已通過小鼠在體成骨細(xì)胞靶向干預(yù)技術(shù)被證實(shí)可部分對抗失重性骨丟失，但以Runx2 為直接靶基因的miRNA 在模擬失重條件下的作用仍未見報(bào)道。利用生物信息學(xué)技術(shù)，在MC3T3-E1細(xì)胞中預(yù)測可能靶向調(diào)控Runx2 的miRNA 中篩選出重力敏感的miRNA，并以此miRNA 為干預(yù)靶點(diǎn)，有助于更直接地干預(yù)和緩解失重性骨丟失的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)通過RAID 等數(shù)據(jù)庫預(yù)測出以Runx2 為靶向 的 4 條 miRNA， 即 miR-135a-5p、miR-137-3p、miR-205-5p 和miR-217-5p，并檢測了其在模擬失重條件下的變化。結(jié)果表明模擬失重條件下，在前成骨細(xì)胞MC3T3-E1 中miR-135a-5p 的表達(dá)明顯升高，且在失重72 h 之內(nèi)與Runx2 的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，發(fā)現(xiàn)miR-135a-5p 可抑制Runx2 的表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)了抑制miR-135a-5p 表達(dá)可部分緩解模擬失重對Runx2 的抑制作用，這為確定miR-135a-5p 為失重性骨丟失的小鼠在體靶向干預(yù)靶點(diǎn)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料與方法

1 材料 前成骨細(xì)胞系MC3T3-E1(ATCC 細(xì)胞庫)，α-mem 培養(yǎng)基(Gibco 公司)，胎牛血清( 四季青公司)，雙抗(Hyclone 公司)，胰蛋白酶(Millipore公司 )，miR-135a-5p mimic、inhibitor 和對照 ( 上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)，RNAiso 細(xì)胞裂解液，SYBR?Premix Ex TaqTM(TaKaRa 公 司 )，Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit、Prime Script?RT reagent Kit，PCR 引物( 上海生工生物工程股份有限公司)，RIPA 細(xì)胞裂解液，PSMF，預(yù)制膠( 美國Invitrogen 公司)，電泳緩沖液( 美國Invitrogen公司 )， 轉(zhuǎn)膜緩沖液 ( 美國 Invitrogen 公司 )， 一抗稀釋液 ( 碧云天 )，PVDF 膜 ( 美國 Invitrogen 公司 )，BCA 蛋白定量試劑盒 ( 美國 Sigma 公司 )，堿性磷酸酶測試盒( 南京建成生物工程研究所)，2D-RWVs 回轉(zhuǎn)器( 中國航天員科研訓(xùn)練中心)，超凈工作臺( 天津泰斯特儀器有限公司)，qRT-PCR儀 ( 美國 Bio-Rad 公司 )。

2 細(xì)胞培養(yǎng) 將前成骨細(xì)胞系MC3T3-E1 在含有10% 血清和1% 雙抗的α-mem 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并置于37℃，5% CO2的孵箱中，2 d 換1 次液，待細(xì)胞匯合度到達(dá)90% 時(shí)，使用胰蛋白酶進(jìn)行傳代培養(yǎng)。選取3 ～ 6 代呈對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

3 模擬失重 在超凈臺中將細(xì)胞匯合度達(dá)90% 的細(xì)胞傳代至回轉(zhuǎn)瓶中，并置于37℃孵箱中培養(yǎng)。待6 ～ 8 h 細(xì)胞貼壁后，用含有10% 血清和1% 雙抗的α-mem 培養(yǎng)基灌滿回轉(zhuǎn)瓶，直立放入37℃孵箱過夜。然后將回轉(zhuǎn)瓶中的氣泡完全排盡，放回轉(zhuǎn)器上進(jìn)行回轉(zhuǎn)，回轉(zhuǎn)半徑為1.5 cm，轉(zhuǎn)速為24 r/min，獲得的細(xì)胞為失重組(MG)。對照組(CON)置入37℃孵箱中普通培養(yǎng)。

4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 采用Lipofectamine 2000 脂質(zhì)體進(jìn)行轉(zhuǎn)染。在超凈臺中將miR-135a-5p 的mimic 或inhibitor 的凍干粉加雙蒸水進(jìn)行稀釋，并分裝備用。在超凈臺中將細(xì)胞匯合度達(dá)90% 的細(xì)胞傳代至六孔板中，并使用含10% 血清，無雙抗的α-mem培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度達(dá)60% ～ 70% 時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。吸取250 μl Opti-MEM 培養(yǎng)基，在其中加入4 μl Lipofectamine 2000 脂質(zhì)體，再次吸取250 μl Opti-MEM 培養(yǎng)基，分別加入各4 μl mimic、mimic-NC 稀釋存儲液及 10 μl inhibitor、inhibitor-NC 稀釋存儲液，靜置5 min，將兩者混合均勻并靜置20 min。然后將混合后的溶液隨機(jī)加入六孔板中，并在每個(gè)孔中加入2 ml 無血清無雙抗的α-mem培養(yǎng)基，于37℃孵箱中培養(yǎng)。6 h 后，換含10%血清，無雙抗的α-mem 普通培養(yǎng)基，待細(xì)胞匯合度達(dá)90% 時(shí)換誘導(dǎo)培養(yǎng)基，48 h 后提取所需材料。

5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 使用RNAiso 裂解細(xì)胞提取細(xì)胞總RNA，采用SYBR Green 熒光染料法進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。miRNA 檢測：采用Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以U6 為內(nèi)參擴(kuò)增 miRNA。mRNA 檢測 ：采用 PrimeScript?RT Master Mix reagent Kit 逆轉(zhuǎn)錄合成 cDNA， 以GAPDH 為內(nèi)參擴(kuò)增mRNA。數(shù)據(jù)采用2-△△Ct法進(jìn)行相對定量分析。PCR 引物序列見表1。

表 1 引物序列Tab. 1 Primer sequences

6 Western blot檢測 提取MC3T3-E1細(xì)胞總蛋白，加入RIPA 細(xì)胞裂解液和蛋白酶抑制劑，超聲粉碎細(xì)胞，通過BCA 法測定蛋白質(zhì)濃度，并加入上樣緩沖液95℃加熱10 min。電泳時(shí)使用預(yù)制膠，每孔上樣量為30 μl，先恒壓90 V 電泳30 min，后恒壓120 V 電泳90 min，常規(guī)轉(zhuǎn)膜，5% 的脫脂牛奶封閉 4 h，分別加入 Runx2 和 GAPDH 抗體 (1 ：1 000)4℃孵育過夜。第2 天用TBST 在搖床上洗膜3 次，每次10 min。然后將膜放入羊抗兔二抗(1 ：5 000)中孵育60 min，使用TBST 在搖床上洗膜3 次，每次10 min。通過使用ECL 發(fā)光液進(jìn)行發(fā)光并拍攝照片，用Image J 軟件分析所拍攝條帶灰度值并計(jì)算蛋白相對含量。

7 生物信息學(xué)方法 通過RNAinter 網(wǎng)站預(yù)測出與Runx2 相關(guān)的miRNA，并根據(jù)分?jǐn)?shù)的大小從高到低排序，選取分?jǐn)?shù)大于0.95 且文獻(xiàn)中未被報(bào)道過的miRNA 進(jìn)行下一步研究。

8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 全部數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行分析，兩樣本間的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多樣本比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 生物信息學(xué)預(yù)測與Runx2 具有結(jié)合位點(diǎn)的4 條miRNA 為篩選可直接調(diào)控Runx2 的miRNA，以便以此miRNA 作為失重性骨丟失的小鼠在體靶向干預(yù)靶點(diǎn)，我們使用RNAinter 網(wǎng)站預(yù)測出與Runx2 相關(guān)分?jǐn)?shù)大于 0.95 的 miRNA， 通過閱讀文獻(xiàn)和PCR 檢測，篩選出目前無明確報(bào)道且在MC3T3-E1 細(xì)胞中表達(dá)量較高的4 條miRNA，即miR-135a-5p、miR-137-3p、miR-205-5p 和 miR-217-5p( 表 2)。

2 模擬失重條件下MC3T3-E1 細(xì)胞miRNA 的表達(dá)變化 為了檢測這4 條miRNA 是否對重力變化敏感，我們將前成骨細(xì)胞MC3T3-E1 放入2D 回轉(zhuǎn)器中模擬失重培養(yǎng)48 h，采用PCR 方法檢測miR-135a-5p、miR-137-3p、miR-205-5p 和 miR-217-5p 的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與對照組相比，模擬失重組miR-135a-5p 表達(dá)顯著上調(diào)(P＜0.05)，而miR-137-3p、miR-205-5p 和 miR-217-5p 的表達(dá)無顯著變化( 圖1)。

3 模擬失重72 h 內(nèi)MC3T3-E1 細(xì)胞miR-135a-5p 表達(dá)變化 為了進(jìn)一步了解對重力變化敏感的miR-135a-5p 在模擬失重條件下的變化特點(diǎn)，我們分別檢測了模擬失重24 h、48 h 和72 h 后miR-135a-5p 的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，與對照組相比，miR-135a-5p 在模擬失重24 h 即出現(xiàn)上調(diào)，且顯著上調(diào)可持續(xù)到72 h(P＜0.05 或P＜0.01)( 圖2)。

表 2 miRNA 序列Tab. 2 miRNA sequences

圖 1 模擬失重48 h后MC3T3-E1細(xì)胞miRNA的表達(dá)Fig.1 Expression levels of miRNAs in MC3T3-E1 cells cultured in simulated microgravity for 48 h (aP ＜0.05, vs CON group)

圖 2 模擬失重72 h MC3T3-E1細(xì)胞miR-135a-5p的表達(dá)變化Fig.2 Expression levels of miR-135a-5p in MC3T3-E1 cells cultured in simulated microgravity for 72 h (aP ＜ 0.05, bP ＜ 0.01, vs CON group)

圖 3 模擬失重72 h MC3T3-E1細(xì)胞中Runx2的表達(dá)變化A：qRT-PCR檢測模擬失重后 Runx2 mRNA水平的表達(dá)；B：Western blot檢測模擬失重后Runx2蛋白水平的表達(dá)Fig.3 Expression levels of Runx2 in MC3T3-E1 cells cultured under microgravity for 72 h A: mRNA expression of Runx2 by qRT-PCR under microgravity; B: Protein levels of Runx2 by Western blotting under microgravity (bP ＜0.01, vs CON group)

4 模擬失重 72 h 內(nèi) miR-135a-5p 與 Runx2 的表達(dá)呈負(fù)相關(guān) 為了進(jìn)一步探討模擬失重條件下重力敏感的miR-135a-5p 是否與Runx2 的表達(dá)呈相關(guān)性。我們檢測了模擬失重72 h 內(nèi)Runx2 的mRNA表達(dá)及蛋白水平。結(jié)果顯示，與對照組相比，Runx2 在模擬失重24 h 即出現(xiàn)mRNA 和蛋白水平的明顯下調(diào)，且顯著下調(diào)可持續(xù)到72 h(P＜0.05或P＜0.01)。提示模擬失重72 h 內(nèi)miR-135a-5p與Runx2 的表達(dá)呈負(fù)向關(guān)聯(lián)關(guān)系( 圖3)。

圖 4 轉(zhuǎn)染miR-135a-5p mimic或inhibitor后Runx2的表達(dá)變化A：qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染miR-135a-5p對Runx2 mRNA表達(dá)的影響； B：Western blot檢測轉(zhuǎn)染miR-135-5p對Runx2蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Expression levels of Runx2 in MC3T3-E1 cells transfected with miR-135a-5p mimic, inhibitor and negative control A: mRNA expression of Runx2 by qRT-PCR after transfection; B: Protein levels of Runx2 by Western blotting after transfection (bP ＜0.01, vs CON group)

5 miR-135a-5p 可 調(diào) 控 Runx2 的 蛋 白 表 達(dá)MC3T3-E1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 mimic 或 inhibitor 后 Runx2 的mRNA 水平未發(fā)生明顯變化，Western blot 結(jié)果顯示Runx2 蛋白表達(dá)分別顯著降低或升高(P＜0.01)。驗(yàn)證了miR-135a-5p 可通過抑制Runx2 的蛋白翻譯過程調(diào)控Runx2 的表達(dá)( 圖4)。

6 miR-135a-5p 可部分緩解模擬失重條件Runx2 的 表 達(dá) 降 低 miR-135a-5p inhibitor 轉(zhuǎn) 染MC3T3-E1 細(xì)胞，并在模擬失重條件下培養(yǎng)48 h，通過PCR結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-135a-5p inhibitor后，qRT-PCR 技術(shù)結(jié)果顯示Runx2 的mRNA 表達(dá)水平未發(fā)生明顯變化，Western blot 檢測發(fā)現(xiàn)Runx2 的蛋白表達(dá)分別顯著降低或升高(P ＜0.01)。提示抑制內(nèi)源性miR-135a-5p 的表達(dá)部分緩解了模擬失重對Runx2 蛋白表達(dá)的抑制作用( 圖5)。

圖 5 轉(zhuǎn)染miR-135a-5p mimic 或inhibitor 后模擬失重48 h MC3T3-E1細(xì)胞中Runx2的表達(dá)變化A：qRT-PCR檢測模擬失重后 Runx2 mRNA水平的表達(dá)；B：Western blot檢測模擬失重后Runx2蛋白水平的表達(dá)Fig.5 Expression levels of Runx2 in MC3T3-E1 cells transfected with miR-135a-5p mimic, inhibitor and negative control under microgravity for 48 h A: mRNA expression of Runx2 by qRT-PCR under microgravity; B: Protein levels of Runx2 by Western blotting under microgravity (bP ＜0.01, vs CON group)

討 論

為了篩選靶向Runx2 的具有重力敏感性的miRNA，為失重性骨丟失的在體靶向干預(yù)提供研究靶點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)通過RNAinter 預(yù)測出4 條與重要的成骨調(diào)節(jié)因子Runx2 具有結(jié)合位點(diǎn)的miRNA，并通過2D 回轉(zhuǎn)器模擬失重處理MC3T3-E1 細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)4 條miRNA 中miR-135a-5p 表達(dá)上調(diào)，并且進(jìn)一步證實(shí)了miR-135a-5p 在模擬失重72 h內(nèi)穩(wěn)定上調(diào)，且與Runx2 的表達(dá)呈負(fù)向關(guān)聯(lián)關(guān)系。已有文獻(xiàn)報(bào)道，miR-135a-5p 可直接作用于Runx2的3’UTR 區(qū)，調(diào)節(jié)Runx2 的表達(dá)[12]。我們的實(shí)驗(yàn)對 MC3T3-E1 細(xì) 胞中 miR-135a-5p 與 Runx2 的調(diào)控關(guān)系進(jìn)行了驗(yàn)證，即向MC3T3-E1 中轉(zhuǎn)染了miR-135a-5p mimic 或 inhibitor， 結(jié)果發(fā)現(xiàn) Runx2的mRNA 水平無明顯變化，而蛋白表達(dá)分別下調(diào)和上調(diào)，驗(yàn)證了miR-135a-5p 可通過抑制Runx2的蛋白翻譯調(diào)控Runx2 的表達(dá)，并進(jìn)一步證實(shí)抑制miR-135a-5p 的表達(dá)可部分緩解模擬失重條件下Runx2 蛋白水平的下調(diào)，提示模擬失重條件下miR-135a-5p 可部分調(diào)控Runx2 的表達(dá)，但Runx2可能還受到其他機(jī)制的調(diào)控。

骨對力學(xué)刺激十分敏感，其結(jié)構(gòu)和功能都與力學(xué)變化密切相關(guān)[13-14]。骨骼除承受包括肌肉收縮在內(nèi)的機(jī)械應(yīng)力直接作用外，骨骼細(xì)胞還受到通過場力方式直接作用的重力調(diào)控，正常的力學(xué)狀態(tài)對維持骨形成和骨吸收的動(dòng)態(tài)平衡至關(guān)重要。在航天失重環(huán)境中，應(yīng)力和場力作用的顯著減少，使得這種動(dòng)態(tài)平衡被打破，表現(xiàn)為骨形成減少，骨吸收增加，骨小梁變薄，且隨著航天飛行的時(shí)程增加，承重骨的骨鈣代謝水平發(fā)生進(jìn)行性累積性的變化，骨密度以平均每個(gè)月1% ～ 2% 的速率降低[15]，航天失重環(huán)境引起的鈣磷代謝負(fù)平衡在返回地面后也較難恢復(fù)且沒有自限性，這導(dǎo)致失重性骨丟失成為困擾人類長期太空飛行的主要醫(yī)學(xué)問題之一。目前對失重性骨丟失的具體機(jī)制仍未完全闡明，研究表明成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成能力下降在失重性骨丟失中發(fā)揮重要的作用。

miRNA 是一類廣泛存在的，長度約為22 nt 的單鏈內(nèi)源性非編碼RNA，其可以與靶基因的mRNA的3’UTR 區(qū)或編碼區(qū)序列結(jié)合，抑制其翻譯或促進(jìn)mRNA 的降解，進(jìn)而調(diào)控靶基因的表達(dá)[16]。已有多個(gè)研究證實(shí)，miRNA 可調(diào)控成骨細(xì)胞的功能。miR-214 通過靶向ATF4 抑制成骨細(xì)胞活性[17]；miR141 和miR-200 在MC3T3-E1 細(xì)胞中通過抑制成骨轉(zhuǎn)錄因子Dlx5 的表達(dá)，抑制成骨細(xì)胞的分化[18]；miR-218 可抑制Wnt 信號通路負(fù)調(diào)控因子硬化蛋白的表達(dá)，而Wnt 信號通路配體Wnt3a 可誘導(dǎo)miR-218 的形成，miR-218 與Wnt 信號通路形成一個(gè)循環(huán)，刺激Wnt 信號通路的激活，調(diào)控成骨細(xì)胞的分化[19]。Runx2 是成骨細(xì)胞分化過程中的重要的轉(zhuǎn)錄因子[20]，其可受到多個(gè)miRNA 的調(diào)控[21]，如在間充質(zhì)祖細(xì)胞中miR-204 和miR-211 可結(jié)合于 Runx2 的 3’UTR 區(qū)進(jìn)而抑制 Runx2 的表達(dá)，使得間充質(zhì)干細(xì)胞由向成骨細(xì)胞分化轉(zhuǎn)化為向脂肪細(xì)胞的分化[22]。失重對成骨細(xì)胞中Runx2 的抑制作用已成為公認(rèn)事實(shí)，我們課題組的前期研究已證實(shí)模擬失重條件下miR-132-3p、miR-33-5p、miR-103 及miR-139-3p[8-11]可分別通過不同的靶基因調(diào)控成骨細(xì)胞的功能，并通過在體成骨細(xì)胞靶向干預(yù)技術(shù)證實(shí)miR-132-3p、miR-33-5p 及miR-139-3p 可部分對抗小鼠的失重性骨丟失。為了進(jìn)一步提高在體靶向干預(yù)效果，選擇直接靶向Runx2 的miRNA 為干預(yù)靶點(diǎn)值得進(jìn)一步研究。但目前模擬失重條件下與直接調(diào)控Runx2 有關(guān)的miRNA 的研究報(bào)道較少。

本研究中，我們所篩選出的重力敏感性miR-135a-5p 與成骨作用密切相關(guān)。有文獻(xiàn)提出，在成纖維細(xì)胞中成纖維細(xì)胞生長因子18 可通過下調(diào)miR-135a-5p 的表達(dá)促進(jìn)其礦化[23]，miR-135a-5p 也與脂肪源干細(xì)胞的成骨分化有關(guān)[24]，miR-135a-5p 還可直接作用于 Runx2 的 3’UTR 區(qū)調(diào)節(jié)成骨分化[12]。我們的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了miR-135a-5p和Runx2 在MC3T3-E1 細(xì)胞的調(diào)控關(guān)系，并發(fā)現(xiàn)miR-135a-5p 在模擬失重條件下表達(dá)升高并且與Runx2 的蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，轉(zhuǎn)染miR-135a-5p inhibitor 可部分緩解模擬失重下Runx2 的蛋白表達(dá)降低。這些均表明miR-135a-5p 有望作為一個(gè)潛在的細(xì)胞內(nèi)干預(yù)靶點(diǎn)，通過在體靶向研究技術(shù)，直接調(diào)控成骨細(xì)胞Runx2 的表達(dá)對抗失重性骨丟失。

綜上，本實(shí)驗(yàn)通過RNAinter 預(yù)測靶向Runx2的4 條miRNA，并檢測了其在模擬失重條件下的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-135a-5p 在模擬失重72 h 內(nèi)顯著上調(diào)且與Runx2 的蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，驗(yàn)證了在MC3T3-E1 細(xì)胞中miR-135a-5p 可調(diào)控模擬失重條件下Runx2 的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)為確定miR-135a-5p 作為細(xì)胞內(nèi)干預(yù)靶點(diǎn)，開展失重性骨丟失的小鼠在體靶向干預(yù)研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。