短期嚴(yán)重大氣及細(xì)顆粒物污染對大鼠眼后段炎性因子表達(dá)的影響

石圓圓，王 欣，羅 靈，許倩倩，司少艷，聶 闖，石 琳，秦亞亞，宮玉波

戰(zhàn)略支援部隊特色醫(yī)學(xué)中心，北京 100101 1 眼科；2 國家環(huán)境保護(hù)環(huán)境感官應(yīng)激與健康重點實驗室；3 特種醫(yī)學(xué)實驗研究中心

近年來我國霧霾天氣頻發(fā)，大氣污染日益嚴(yán)重。國際癌癥研究機(jī)構(gòu)于2013 年10 月將室外大氣污染列為人類致癌因素之一[1]。2012 年底，著名醫(yī)學(xué)雜志《柳葉刀》發(fā)表的最新全球疾病負(fù)擔(dān)研究結(jié)果表明，細(xì)顆粒物(PM2.5) 污染在健康危險因素中排名第5( 前4 名分別是高血壓、吸煙、高鹽飲食和不良飲食習(xí)慣)[2]。國內(nèi)外多項流行病學(xué)研究表明，大氣污染與呼吸道癥狀增加、肺功能降低、哮喘加重、心血管系統(tǒng)紊亂以及居民提前死亡有關(guān)[3-5]。大氣污染及PM2.5 對眼部也有不良影響，如導(dǎo)致結(jié)膜炎及眼底血管管徑改變[6]。但尚無大氣污染與眼底炎性因子相關(guān)性的研究。2016年 12 月 16 日 20 ：00- 12 月 21 日 24 ：00， 北 京市空氣重污染應(yīng)急指揮部啟動了空氣重污染紅色預(yù)警措施。本實驗收集該時期的大氣，將實驗組大鼠暴露于該環(huán)境下，或暴露于該環(huán)境下并濾除空氣動力學(xué)直徑＞2.5μm 顆粒，檢測大鼠眼后段的炎性因子表達(dá)情況，以探討短期重度污染大氣對眼后段有無急性影響。鼠無意外死亡情況。

表1 暴露期間空氣質(zhì)量數(shù)據(jù)(μg/m2)Tab. 1 Air quality data during exposure (μg/m2)

材料與方法

1 實驗動物與分組 選取36 只體質(zhì)量(200±10) g的健康雌性SPF 級SD 大鼠( 購自北京興隆動物廠)。將SD 大鼠隨機(jī)分為3 組，每組12 只，根據(jù)不同的暴露方法，分別為正常對照組、大氣污染組和細(xì)顆粒大氣污染組。實驗動物的使用和飼養(yǎng)符合國家科學(xué)技術(shù)委員會頒布的《實驗動物管理條例》。

2 暴露方法 采用暴露飼養(yǎng)艙進(jìn)行本次實驗，兩組暴露艙均實時收集外界環(huán)境中的大氣。一組暴露艙無濾膜濾過，其內(nèi)成分與外界大氣完全相同，即大氣污染組；另一組為暴露艙濾過去除空氣動力學(xué)直徑＞2.5μm 的物質(zhì)，其內(nèi)保留PM2.5 及氣體污染物，即細(xì)顆粒大氣污染組。正常對照組大鼠不做任何暴露處理并在原SPF 級環(huán)境中常規(guī)飼養(yǎng)相同時間。兩個實驗組大鼠的共同暴露時間為北京市霧霾紅色預(yù)警時期(2016 年12 月16 日中午-22 日晨)，暴露期間空氣質(zhì)量狀況如表1所示，全部數(shù)據(jù)來自國家環(huán)境監(jiān)測總站。此期間空氣污染最高達(dá)6 級，首要污染物為細(xì)顆粒物(PM2.5)，氣體污染物以NO2、SO2為主。此期間各組大鼠攝食、飲水等生理活動不受干擾，且實驗過程中所有大

3 取材 于 12 月 22 日 8 ：00 終止暴露。3 組大鼠均行眼球取材。主要步驟：按0.4 ml/100 g 行腹腔注射水合氯醛。每組中6 只大鼠以PBS(0.01 mol/L，pH 7.2 ～ 7.3，美國Gibco) 經(jīng)心臟灌洗后，斷頭處死大鼠，摘除眼球，-80℃保存。取每只大鼠的右眼進(jìn)行蛋白濃度測定。左眼用4% 多聚甲醛固定，進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。每組其余6 只大鼠經(jīng)腹主動脈取全血，于離心機(jī)中( 美國Beckman)，4℃下，2 000 r/min 離心20 min 后，取上部血清，-80℃保存。

4 提取眼后段蛋白及BCA 測定總蛋白濃度 仔細(xì)剔除眼球表面的肌肉及筋膜組織，于角鞏膜緣處剪除角膜，去除晶狀體及玻璃體，制作成眼杯。將眼杯按照裂解液試劑盒( 北京雷根生物) 說明提取蛋白。主要步驟：將眼杯用300μl 裂解液于1.5 ml EP 管中勻漿裂解，其后加入200μl 裂解液，冰上靜置10 min。置離心機(jī)中( 美國Beckman)，于4℃下，15 000 r/min 離心15 min 后，取上清。按照BCA 試劑盒( 北京雷根生物) 方法，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。將上述上清液稀釋2 倍后加入96 孔板中，各孔加入BCA 工作液后，37℃下溫浴30 min。用酶標(biāo)儀( 美國Bio-Rad) 測定各樣品孔在540 nm 處的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各孔蛋白濃度。各吸光度值根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算蛋白濃度值。將各樣本上清液分別按照樣本中最低蛋白濃度值稀釋，將稀釋為同一濃度的樣本進(jìn)行多因子芯片分析。

5 多因子芯片分析 將眼后段蛋白液樣本按照Milliplex 多因子檢測試劑盒( 德國默克公司，貨號：PECYTMAG-65K) 操作流程進(jìn)行制備，利用多功能液態(tài)芯片系統(tǒng)( 德國默克公司) 對眼后段蛋白液樣本檢測 IL-1β、IL-5、IL-18 及 MCP-1 的蛋白濃度。

6 血清IL-1β 測定 將血清標(biāo)本按照試劑盒( 武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司) 說明書進(jìn)行，采用酶標(biāo)儀( 美國Bio-Rad) 于450 nm 波長下測定吸光度值，計算樣本濃度。每樣本復(fù)孔數(shù)為2，每孔重復(fù)檢測3 次，結(jié)果取均值。

7 組織形態(tài)學(xué)觀察 蘇木精-伊紅染色觀察，主要步驟：固定于4% 多聚甲醛溶液中的組織24 h后行脫水、石蠟包埋，制成5μm 石蠟切片。石蠟切片置70℃烤箱烘烤后放入3 缸二甲苯溶液中進(jìn)行脫蠟，各8 min ；之后依次放入梯度乙醇溶液中進(jìn)行水化，各2 min，后流水沖洗；切片置于蘇木精染色2 ～ 3 min 后流水沖洗，于鹽酸乙醇溶液中4 s 后流水沖洗，再置于氨水中4 s 后流水沖洗，置于伊紅溶液中1 min 后流水沖洗；再依次放入梯度乙醇溶液中各2 min，二甲苯溶液中10 min ；切片風(fēng)干后以中性樹脂膠封片，在倒置顯微鏡下( 重慶奧特) 觀察、拍照。

8 統(tǒng)計學(xué)分析 使用SPSS23.0進(jìn)行研究資料分析。觀測資料中的計量數(shù)據(jù)，正態(tài)資料以-x±s表示，多組間比較為單因素方差分析+ 兩兩比較LSD-t檢驗。偏態(tài)資料以中位數(shù)Md(IQR) 描述，多組間的比較為Kruskal-Wallis 秩和檢驗。統(tǒng)計推斷的檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

結(jié) 果

1 三組炎性因子水平比較 三組間蛋白中炎性因子比較發(fā)現(xiàn)，IL-1β 濃度差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，IL-5、IL-18 和 MCP-1 濃度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。組間兩兩比較發(fā)現(xiàn)，大氣污染組和細(xì)顆粒大氣污染組IL-1β 濃度高于對照組(P＜0.05)，細(xì)顆粒大氣污染組IL-1β 濃度高于大氣污染組(P＜0.05)。見表2。

2 三組血清IL-1β 濃度比較 對照組、大氣污染組及細(xì)顆粒大氣污染組血清IL-1β 濃度分別為(69.26±19.93) pg/ml、(61.08±16.92) pg/ml、(64.34±21.42) pg/ml。三組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=0.336，P=0.719)。見圖 1。

3 三組眼后段組織病理學(xué)表現(xiàn) 眼后段切片行HE染色檢查顯示，各組視網(wǎng)膜各層次未見明顯結(jié)構(gòu)破壞或明顯炎癥細(xì)胞浸潤。見圖2。

圖 1 三組血清IL-1β濃度比較(組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義)Fig. 1 Comparison of serum IL-1β concentration among the three groups (There was no statistically significant difference between these groups)

表2 三組眼后段炎性因子水平比較 [Md(IQR)]Tab. 2 Comparison of levels of inflammatory factors in the posterior segments in the three groups (pg/ml, Md[IQR])

圖 2 各組大鼠眼后節(jié)組織病理學(xué)檢查(各組視網(wǎng)膜各層次未見明顯結(jié)構(gòu)破壞或炎癥細(xì)胞浸潤， HE×100)A：對照組； B：大氣污染組； C：細(xì)顆粒大氣污染組Fig. 2 Histopathological examination of the posterior segment of the rat eyes in each group (The posterior segment of the exposed eyes had no significant difference with the control group in pathological examination)A: control group; B: air pollution group; C: PM2.5 group

討 論

大量流行病學(xué)研究表明，大氣污染及PM2.5可引起機(jī)體呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)疾病[3-5]。且損傷機(jī)制多種，包括炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、免疫損傷、細(xì)胞自噬和凋亡等[5]。普遍認(rèn)為呼吸系統(tǒng)的炎癥是損傷的基本機(jī)制，PM2.5 成分會誘發(fā)促炎因子。Xu 等[7]將小鼠巨噬細(xì)胞暴露于北京提取的PM2.5 樣本，發(fā)現(xiàn)有不同程度的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，其中IL-1β 增高，且與TLR4/NF-κB 通路和NLRP3 炎癥小體激活有關(guān)。周園等[8]采集大氣中可吸入顆粒PM10，并制備混懸液注入氣管，檢測肺泡灌洗液，發(fā)現(xiàn)IL-1、IL-8、IFN-γ 等促炎因子均不同程度升高。范欣等[9]發(fā)現(xiàn)實時細(xì)顆粒及大氣污染條件下，大鼠氣道除病理改變外亦存在IL-1 因子的上調(diào)。

大氣污染及PM2.5 對眼部影響的研究主要集中于眼表。多篇文獻(xiàn)提示其可引起非特異結(jié)膜炎和過敏性結(jié)膜炎[6]。2012 年Chang 等[10]報道空氣污染與臺灣地區(qū)非特異性結(jié)膜炎門診病人數(shù)量呈正相關(guān)，與空氣中 NO2、SO2、O3、PM10 增加相關(guān)。日本的一項流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)PM2.5 在非花粉季節(jié)可增加過敏性結(jié)膜患病率[11]。Hong 等[12]通過回顧性研究發(fā)現(xiàn)環(huán)境中高水平NO2、O3增加了過敏性結(jié)膜炎的門診就診率。Gao 等[13]研究發(fā)現(xiàn)，PM2.5 可通過促進(jìn)氧自由基的生成而導(dǎo)致角膜上皮細(xì)胞DNA 損傷，促進(jìn)細(xì)胞衰老。另一項研究發(fā)現(xiàn)煤塵顆?？纱偈菇Y(jié)膜TNF-α 生物學(xué)活性升高和結(jié)膜上皮NF-κB 的高表達(dá)[14]。

大氣污染對眼后段影響的研究極少，目前已有的研究集中于對視網(wǎng)膜血管影響的觀察。Rozanova等[6]對66 篇相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行了綜述，顯示慢性長期暴露于CS2，可導(dǎo)致視網(wǎng)膜靜脈擴(kuò)張；CO 可造成動靜脈直徑、視網(wǎng)膜血流速度以及眼底血管搏動幅度增加。Provost 等[15]對221 名兒童共進(jìn)行了489次視網(wǎng)膜血管檢查，測量學(xué)校、住所及附近主要道路PM2.5 暴露量，使用混合模型估算與近期和長期暴露相關(guān)的視網(wǎng)膜血管直徑變化，同時調(diào)整其他已知的協(xié)變量，如性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)、血壓和出生體質(zhì)量；測得暴露于PM2.5 濃度每增加10μg/m3，則分別對應(yīng)著 0.35μm(95% CI ：0.09 ～0.61μm) 較窄的視網(wǎng)膜小動脈和 0.35μm(-0.03 ～0.73μm) 較寬的小靜脈；距離主干道路每近100 m，小動脈變窄 0.30μm(0.05 ～ 0.54μm) ；由此認(rèn)為環(huán)境污染可能通過微循環(huán)改變對兒童視網(wǎng)膜血管產(chǎn)生影響，會促進(jìn)年齡相關(guān)性疾病的發(fā)展。另一項實驗研究了空氣污染水平的短期變化與視網(wǎng)膜微脈管系統(tǒng)變化之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜中央小動/靜脈直徑當(dāng)量與PM10 和黑炭濃度相關(guān)，在視網(wǎng)膜檢查前24 h 內(nèi)，平均PM10 每增加10μg/m3，其中央小動脈直徑當(dāng)量降低0.93μm，小靜脈降低0.86μm ；黑炭濃度每增加1μg/m3都會導(dǎo)致視網(wǎng)膜中央小動脈直徑當(dāng)量下降1.84μm[16]。

大氣污染是否會引起眼后段的炎癥反應(yīng)國內(nèi)外尚無相關(guān)研究。本實驗觀察了經(jīng)過6 d 重度污染后炎性因子在大鼠眼后段的表達(dá)量，結(jié)果顯示IL-1β 顯著升高。而文獻(xiàn)顯示IL-1β 可影響血管的通透性，亦可能引起血管平滑肌的收縮[17-19]。我們推測文獻(xiàn)所觀察到的大氣污染所致的眼底視網(wǎng)膜血管改變有可能與IL-1β 升高有一定關(guān)系。

IL-1β 升高見于多種眼底疾病。如在糖尿病的視網(wǎng)膜血管中IL-1β 顯著升高，與糖尿病神經(jīng)炎癥有密切關(guān)系。進(jìn)一步研究顯示IL-1β 在血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)，而非視網(wǎng)膜中的小膠質(zhì)細(xì)胞或星形膠質(zhì)細(xì)胞等炎癥細(xì)胞中表達(dá)[20]。嚴(yán)重的增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變患者中玻璃體液中IL-1β 明顯升高[21]。抑制IL-1β 表達(dá)可預(yù)防和穩(wěn)定糖尿病視網(wǎng)膜病變[22]。Il-1β 升高亦存在于年齡相關(guān)性黃斑變性疾病中，主要表達(dá)于視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中[23]。在年齡相關(guān)性黃斑變性及息肉狀脈絡(luò)膜血管病變患者的玻璃體液中IL-1β 升高5 ～ 10 倍，并可能與光感受器的變性和新生血管形成有關(guān)[24]。已知IL-1β 是一個多功能的促炎因子，有廣泛的生物活性，除了其自身的炎癥作用，還有信號放大級聯(lián)作用，促進(jìn)其他炎性因子如IL-6、IL-18和TNF-α 的產(chǎn)生，從而加強(qiáng)放大炎癥反應(yīng)[7,20]。因此我們應(yīng)進(jìn)一步關(guān)注污染大氣及PM2.5 引起眼底IL-1β 改變的量效關(guān)系，并且長期高水平的IL-1β 是否可能引起有臨床意義的眼底改變。

污染大氣是通過何種途徑引起眼底IL-1β 的改變，涉及何種機(jī)制，需要進(jìn)一步研究。我們已知PM2.5 通過氧化應(yīng)激反應(yīng)增加心血管死亡事件，暴露于PM2.5 可引起血管內(nèi)皮的損害[25-26]。既往有文獻(xiàn)通過觀察眼底血流的變化，推測空氣污染的復(fù)雜成分可能減少眼底血流，對視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞產(chǎn)生毒性，或在眼部通過氧化應(yīng)激作用產(chǎn)生影響[6]。此外空氣污染亦可引起全身的炎癥反應(yīng)，如CRP 的升高等[27]；不能除外全身反應(yīng)可能會影響局部的炎性因子水平。因此我們在取眼球標(biāo)本時采用PBS 心臟灌洗，以去除全身血液的影響。此外我們進(jìn)一步檢測了血清中IL-1β 水平，結(jié)果顯示接觸污染后并未見明顯升高。本實驗中未觀察到炎癥細(xì)胞的明顯浸潤增多，推測IL-1β 可能來源于眼底視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜中固有的各種細(xì)胞，如視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、Müller 細(xì)胞以及血管內(nèi)皮細(xì)胞，需進(jìn)一步進(jìn)行體內(nèi)或體外實驗。

本實驗同時觀察了IL-5、IL-18 和MCP-1 表達(dá)的變化，但組間并無明顯差異。其中IL-5 與嗜酸性粒細(xì)胞及過敏性反應(yīng)有密切關(guān)系[28-29]。IL-18亦為重要的促炎因子，并能夠加強(qiáng)炎癥細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用[30]，MCP-1 為單核巨噬細(xì)胞趨化因子。這與我們觀察到的眼底無明顯炎癥細(xì)胞浸潤相符。但同時也應(yīng)考慮到，本實驗并沒有對暴露后各時間點進(jìn)行檢測，并且實驗動物數(shù)量偏少。

此外，本實驗中濾除大顆粒的大氣污染組IL-1β 亦明顯升高，提示本實驗中污染空氣中引起眼底改變的可能主要是PM2.5 和各種污染氣體。但同時我們也注意到與大氣污染組相比，濾除大顆粒的暴露組的IL-1β 升高更加明顯，這一改變尚需要我們擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究。

綜上，本實驗觀察了SD 大鼠暴露于連續(xù)6 d北京的重污染天氣后，眼后段組織中IL-1β 表達(dá)升高，濾除大顆粒仍顯示IL-1β 表達(dá)升高；而對照組IL-5、IL-18、MCP-1 均無顯著升高或降低，提示短期嚴(yán)重空氣污染可能引起眼底的炎癥反應(yīng)，尚需進(jìn)一步研究這一反應(yīng)的量效及時空關(guān)系。