高頻重復(fù)經(jīng)顱磁刺激對(duì)大鼠工作記憶局部場(chǎng)電位和鋒電位時(shí)頻特征的影響

1.河北工業(yè)大學(xué)電氣工程學(xué)院，a.省部共建電工裝備可靠性與智能化國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；b.天津市生物電工與智能健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津市 300130

經(jīng)顱磁刺激(transcranial magnetic stimulation,TMS)是一種無(wú)創(chuàng)、無(wú)痛、易于操作的非藥物干預(yù)生物刺激技術(shù)，它利用時(shí)變磁場(chǎng)產(chǎn)生感應(yīng)電場(chǎng)，引起生物電流在組織中傳導(dǎo)，改變大腦皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞的動(dòng)作電位，從而影響腦內(nèi)代謝和神經(jīng)電活動(dòng)[1]。近年來(lái)，TMS在研究神經(jīng)生理學(xué)、認(rèn)知神經(jīng)科學(xué)、神經(jīng)調(diào)控以及各類(lèi)神經(jīng)精神類(lèi)疾病的治療方面被廣泛關(guān)注和應(yīng)用，成為新世紀(jì)腦科學(xué)研究的重要技術(shù)手段之一[2]。不同模式TMS 的刺激效果有所不同，重復(fù)經(jīng)顱磁刺激(repetitive transcranial magnetic stimulation,rTMS)能通過(guò)調(diào)節(jié)頻率、強(qiáng)度、時(shí)長(zhǎng)等刺激參數(shù)進(jìn)行綜合調(diào)控以取得最佳效果，目前已被用于多種精神類(lèi)疾病以及認(rèn)知功能的研究中[3-4]。目前研究表明，rTMS 能改善阿爾茨海默病患者的學(xué)習(xí)記憶障礙和精神行為異常等癥狀[5-6]。rTMS 可分為≤1 Hz 的低頻rTMS 和>1 Hz 的高頻rTMS，不同的刺激頻率對(duì)生物體的影響也不盡相同[7]。向艷平等[8]發(fā)現(xiàn)高頻rTMS 刺激可促進(jìn)不完全性脊髓損傷大鼠運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)。吳越等[9]研究1 Hz 和20 Hz rTMS對(duì)阿爾茨海默病患者認(rèn)知功能的影響，也證明高頻組療效優(yōu)于低頻組。以上研究初步證明高頻rTMS調(diào)控神經(jīng)的有效性，但目前關(guān)于高頻rTMS對(duì)神經(jīng)電生理機(jī)制調(diào)控的研究較少。

工作記憶(working memory)是指在執(zhí)行學(xué)習(xí)、理解、問(wèn)題解決等復(fù)雜認(rèn)知任務(wù)過(guò)程中，短時(shí)間內(nèi)保存和處理信息的系統(tǒng)[10]。前額葉皮質(zhì)(prefrontal cortex,PFC)的損傷會(huì)削弱各種哺乳動(dòng)物執(zhí)行工作記憶任務(wù)時(shí)的表現(xiàn)，表明PFC 在工作記憶中起著重要作用?，F(xiàn)有的研究證明PFC 中持續(xù)的神經(jīng)元活動(dòng)在調(diào)節(jié)工作記憶中起著重要作用[11-15]。工作記憶障礙是阿爾茨海默病的常見(jiàn)癥狀之一，高頻rTMS 能提高神經(jīng)興奮性，在一定程度上調(diào)節(jié)大腦神經(jīng)元電活動(dòng)，達(dá)到改善腦功能的目的[16-17]，將其用于治療工作記憶障礙能取得一定的效果，但TMS 調(diào)控具體腦區(qū)神經(jīng)電活動(dòng)的機(jī)理仍不清楚。因此，針對(duì)不同的刺激條件，研究神經(jīng)系統(tǒng)功能實(shí)現(xiàn)過(guò)程中神經(jīng)元電活動(dòng)特征模式發(fā)生的變化對(duì)研究神經(jīng)調(diào)控機(jī)理具有重要意義[18]。通過(guò)在體植入式微電極陣列可以采集到清醒動(dòng)物在認(rèn)知活動(dòng)過(guò)程中相關(guān)腦區(qū)的兩種電活動(dòng)信號(hào)：局部場(chǎng)電位(local field po-tentials,LFPs)和鋒電位(spike)。對(duì)LFPs 和spike 進(jìn)行分析能將神經(jīng)活動(dòng)與認(rèn)知行為聯(lián)系起來(lái)，包括感覺(jué)刺激編碼、知覺(jué)結(jié)合、注意力和工作記憶[19-22]。

本文主要研究高頻rTMS 對(duì)大鼠工作記憶行為學(xué)和神經(jīng)電活動(dòng)的影響，通過(guò)運(yùn)用在體植入式微電極陣列記錄技術(shù)，采集執(zhí)行工作記憶任務(wù)的大鼠PFC 腦區(qū)中的LFPs 信號(hào)和spike 信號(hào)，對(duì)比分析高頻rTMS 對(duì)大鼠行為學(xué)及神經(jīng)電生理信號(hào)LFPs 和spike 的影響，為深入探究TMS調(diào)控神經(jīng)活動(dòng)的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

成年雄性Wistar 大鼠8 只，體質(zhì)量250～300 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(京)2016-0006。準(zhǔn)備10%水合氯醛溶液、鑷子、剪刀、義齒基托樹(shù)脂粉、義齒基托樹(shù)脂液、棉球、消毒酒精等實(shí)驗(yàn)用品。

本研究經(jīng)河北工業(yè)大學(xué)生物醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通過(guò)(No.HEBUTaCUC2019004)。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

Rapid2 磁刺激設(shè)備，選用“8”字形線圈：英國(guó)MAGSTIM 公司。51670 腦立體定位儀： 美國(guó)STOELTING 公司。16 通道微電極陣列(2×8)、OmniP-lex/128在體多通道神經(jīng)信號(hào)采集系統(tǒng)：美國(guó)PLEXON公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取Wistar 大鼠PFC 作為目標(biāo)腦區(qū)，基于磁刺激儀等動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的刺激系統(tǒng)制備rTMS 刺激組大鼠，通過(guò)手術(shù)植入16 通道微電極陣列，然后利用“T”形迷宮進(jìn)行工作記憶行為學(xué)訓(xùn)練。通過(guò)記錄電極采集rT-MS刺激組和對(duì)照組在執(zhí)行工作記憶任務(wù)時(shí)PFC中LF-Ps 信號(hào)和spike 信號(hào)的變化情況，初步探討高頻rTMS對(duì)大鼠工作記憶過(guò)程中神經(jīng)電活動(dòng)的調(diào)控作用效果。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 動(dòng)物準(zhǔn)備

將8 只Wistar 大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和刺激組，每組4只。刺激組固定在大鼠限制器中，將“8”字形線圈放置在大鼠頭皮上，利用腦立體定位儀標(biāo)定PFC 大致區(qū)域，將線圈刺激點(diǎn)定位在該點(diǎn)。調(diào)節(jié)磁刺激設(shè)備的刺激頻率為5 Hz、強(qiáng)度為100%運(yùn)動(dòng)閾值。rTMS共持續(xù)14 d，每天600 個(gè)脈沖刺激。600 個(gè)脈沖分為24串，串間隔2 s，每串包括25 個(gè)5 Hz 的單脈沖刺激。對(duì)照組未進(jìn)行rTMS。

所有大鼠在進(jìn)行“T”形迷宮訓(xùn)練之前手術(shù)植入16通道微型電極。根據(jù)大鼠腦立體定位圖譜，將電極植入前囟前2.5～4.5 mm、旁開(kāi)0.2～1.0 mm、深2.5～3.5 mm處的目標(biāo)腦區(qū)，在微電極陣列推進(jìn)至腦組織過(guò)程中，對(duì)神經(jīng)元電活動(dòng)信號(hào)進(jìn)行持續(xù)監(jiān)控。手術(shù)完成后，大鼠單獨(dú)飼養(yǎng)3 d 使其身體恢復(fù)，然后進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。

1.4.2 “T”形迷宮工作記憶訓(xùn)練過(guò)程

“T”形迷宮見(jiàn)圖1。將大鼠放置在起始位置A 點(diǎn)，同時(shí)在B、C 食槽上放入獎(jiǎng)勵(lì)食物。讓大鼠自由選擇到達(dá)B 或C 點(diǎn)，可獲得1 次食物獎(jiǎng)勵(lì)，待其進(jìn)完食又會(huì)回到A 點(diǎn)。經(jīng)過(guò)5 s 延遲后，大鼠重新從A 點(diǎn)出發(fā)，開(kāi)始延時(shí)交替選擇。如果第2 次選擇的方向與第1 次相反，大鼠就能再次得到食物獎(jiǎng)勵(lì)，這兩次選擇構(gòu)成一次完整的工作記憶實(shí)驗(yàn)。在一次工作記憶實(shí)驗(yàn)中，若大鼠能得到2 次食物獎(jiǎng)勵(lì)則記為一次正確實(shí)驗(yàn)，否則記為錯(cuò)誤。完成1 次實(shí)驗(yàn)任務(wù)后，無(wú)論大鼠是否正確執(zhí)行都讓其回到起始點(diǎn)，開(kāi)始下1 次工作記憶任務(wù)實(shí)驗(yàn)。每天對(duì)大鼠進(jìn)行兩組“T”形迷宮工作記憶任務(wù)訓(xùn)練，每組包含10 次實(shí)驗(yàn)。當(dāng)大鼠執(zhí)行“T”形迷宮工作記憶任務(wù)正確率連續(xù)兩天在80%以上時(shí)，認(rèn)為其達(dá)到行為學(xué)正確率標(biāo)準(zhǔn)。

圖1 “T”形迷宮

1.5 數(shù)據(jù)采集及處理

在大鼠執(zhí)行工作記憶任務(wù)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，將大鼠頭部的微型電極陣列與多通道信號(hào)采集系統(tǒng)連接，實(shí)時(shí)記錄PFC 多通道神經(jīng)電信號(hào)。原始數(shù)據(jù)采樣頻率為40 kHz，LFPs 采樣頻率為1 kHz，將所獲取的信號(hào)經(jīng)過(guò)0.3～500 Hz 的低通濾波，得到兩組原始LFPs 信號(hào)。經(jīng)過(guò)300～7.5 kHz 高通濾波、閾值檢測(cè)，再經(jīng)過(guò)主成分分析得到spike 序列。圖2 為實(shí)驗(yàn)中記錄的LFPs 和spike信號(hào)的示例。

1.5.1 工作記憶過(guò)程中LFPs和spike分析

隨機(jī)選取每只大鼠達(dá)到行為學(xué)正確率標(biāo)準(zhǔn)后的20次工作記憶任務(wù)過(guò)程中的LFPs 信號(hào)，進(jìn)行時(shí)頻分析。將采集到的多通道LFPs 信號(hào)導(dǎo)入Matlab R2014a(MathWorks,USA)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。依照選定的行為學(xué)參考點(diǎn)作為每次試驗(yàn)的時(shí)間原點(diǎn)，截取時(shí)間原點(diǎn)前500 ms 和后500 ms 共1000 ms 的LFPs 段，利用Matlab 對(duì)多次實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。由于θ 振蕩(4～12 Hz)與工作記憶等短時(shí)記憶行為密切相關(guān)[23]，而γ振蕩(30～80 Hz)也是與信息的存儲(chǔ)和提取密切相關(guān)的神經(jīng)電活動(dòng)，是工作記憶中呈現(xiàn)的重要神經(jīng)振蕩之一[24]。因此將4 只大鼠共80 次工作記憶任務(wù)過(guò)程中的LFPs信號(hào)進(jìn)行短時(shí)傅里葉變換，然后進(jìn)行時(shí)頻功率譜分析，得到80 個(gè)試驗(yàn)的平均時(shí)頻功率譜，分析其θ 頻段和γ頻段的動(dòng)態(tài)功率變化。

圖2 LFPs和spike信號(hào)示例

將采集到的16 通道原始信號(hào)導(dǎo)入Offline Sorter軟件進(jìn)行spike 信號(hào)篩選和分類(lèi)，得到具有代表性的發(fā)放神經(jīng)元的spike 信號(hào)，將得到的spike 信號(hào)導(dǎo)入Neu-roExplorer 軟件中，得到執(zhí)行工作記憶任務(wù)時(shí)的spike序列和平均spike 發(fā)放速率圖。已有研究表明，spike發(fā)放速率與行為學(xué)能力之間存在密切聯(lián)系[25]。所以本文采用速率直方圖分析處理兩組大鼠PFC 腦區(qū)spike發(fā)放數(shù)據(jù)。平均發(fā)放速率圖是通過(guò)將多個(gè)速率直方圖疊加平均實(shí)現(xiàn)的。對(duì)每個(gè)數(shù)據(jù)段內(nèi)出現(xiàn)的spike 進(jìn)行計(jì)數(shù)，得到單位時(shí)間內(nèi)的動(dòng)作電位發(fā)放率。以行為學(xué)參考點(diǎn)為時(shí)間原點(diǎn)，[-2,1]為窗長(zhǎng)，將工作記憶實(shí)驗(yàn)中spike 信號(hào)截取出n 個(gè)數(shù)組，即每個(gè)數(shù)組對(duì)應(yīng)δ 時(shí)間內(nèi)spike 信號(hào)，ki為第i 個(gè)時(shí)間窗內(nèi)spike 個(gè)數(shù)，計(jì)算該數(shù)組內(nèi)spike 發(fā)放率r(ⅱ)=ki/δ，可得工作記憶實(shí)驗(yàn)中spike速率直方圖，對(duì)多組速率直方圖疊加平均，對(duì)比兩組中平均spike發(fā)放率。

1.5.2 Multitaper頻譜估計(jì)

有研究表明，LFPs 信號(hào)和spike 信號(hào)在工作記憶過(guò)程中具有協(xié)同編碼的現(xiàn)象[26]，本文應(yīng)用常見(jiàn)時(shí)頻處理方法之一的頻譜相干分析來(lái)對(duì)比不同組別的大鼠在工作記憶過(guò)程中LFPs-spike 信號(hào)同步化的差異。本研究選取的窗函數(shù)是由5 個(gè)帶寬為400 ms、相互正交獨(dú)立的離散正交扁球序列(discrete prolate spheroidal se-quences,DPSS)組合而成(圖3)，選取步長(zhǎng)為50 ms，將窗口滑動(dòng)進(jìn)行計(jì)算，就得到LFPs-spike 信號(hào)動(dòng)態(tài)頻譜相干值。

取時(shí)間長(zhǎng)度[0,T]的LFPs 信號(hào)和spike 信號(hào)序列分別為X={xj}和Y={yj}(j=1,2,…,N)，對(duì)X 進(jìn)行加窗傅里葉變換，如公式(1)所示：

圖3 DPSS窗函數(shù)示意圖

選取典型通道LFPs 信號(hào)和spike 信號(hào)，計(jì)算每次試驗(yàn)的自譜Sx(f)、SY(f)和互譜SXY(f)，然后計(jì)算X和Y在一個(gè)窗口中的頻域相干函數(shù)CXY(f)，移動(dòng)窗口，獲得CXY(f)與時(shí)間之間的函數(shù)，記為：

式中的、SX(f,t)、SY(f,t)、SXY(f,t)分別是同一個(gè)通道信號(hào)X和Y的Multitaper 頻譜估計(jì)的自譜和互譜，CXY(f,t)是兩個(gè)信號(hào)在頻率f處、時(shí)間t處的相干值，該值在0 到1 之間。信號(hào)X 和Y 的同步化程度越高，CXY(f,t)的數(shù)值趨向于1。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料呈正態(tài)分布，以()表示，采用配對(duì)t檢驗(yàn)。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 工作記憶行為學(xué)正確率

對(duì)照組達(dá)到正確率標(biāo)準(zhǔn)的時(shí)間分別為6 d、10 d、10 d、10 d，平均(9±1.73)d；刺激組分別為2 d、7 d、7 d、8 d，平均(6±2.34) d，少于對(duì)照組(t=2.51,P=0.046)。

2.2 LFPs時(shí)頻特征和spike發(fā)放率

刺激組θ 頻段能量較對(duì)照組提高，并在工作記憶行為學(xué)參考點(diǎn)前較為集中。見(jiàn)圖4。

對(duì)照組工作記憶實(shí)驗(yàn)過(guò)程中LFPs信號(hào)的θ頻段能量波動(dòng)不大且處于較低水平，刺激組工作記憶實(shí)驗(yàn)LFPs 的θ 頻段能量在行為學(xué)參考點(diǎn)前較高且比較集中。見(jiàn)圖5。對(duì)照組行為學(xué)參考點(diǎn)前后0.5 s 內(nèi)平均能量為(1.4179±0.3371) mV2，刺激組為(2.5619±0.6705)mV2，顯著大于對(duì)照組(t=12.49,P<0.001)。

γ 頻段能量分布較為平均且明顯低于θ 頻段能量，且刺激組LFPs 信號(hào)的γ 頻段整體能量高于對(duì)照組。見(jiàn)圖6。

工作記憶過(guò)程中，兩組LFPs信號(hào)的γ 頻段能量分布都比較均勻，但刺激組能量始終高于對(duì)照組。見(jiàn)圖7。對(duì)照組行為學(xué)參考點(diǎn)前后0.5 s 內(nèi)的平均能量為(0.2674±0.0326) mV2，刺激組為(0.3478±0.0290) mV2，顯著大于對(duì)照組(t=15.23,P<0.001)。

spike信號(hào)在行為學(xué)參考點(diǎn)前密集發(fā)放，推測(cè)此時(shí)PFC 腦區(qū)神經(jīng)元處于活躍狀態(tài)，刺激組工作記憶中發(fā)放神經(jīng)元更加活躍。隨機(jī)選取每只大鼠正確執(zhí)行“T”形迷宮工作記憶實(shí)驗(yàn)時(shí)延遲交替階段spike信號(hào)20段，對(duì)照組和刺激組分別為80 段數(shù)據(jù)。計(jì)算得到80 段對(duì)照組數(shù)據(jù)平均spike發(fā)放率為(21.27±6.37)脈沖/s，刺激組為(31.59±8.10)脈沖/s，刺激組高于對(duì)照組，但無(wú)顯著性差異(t=1.73,P=0.067)。見(jiàn)圖8、圖9。

2.3 LFPs-spike時(shí)變頻譜相干

隨機(jī)選取兩組在80次工作記憶過(guò)程中典型通道的LFPs 信號(hào)和spike 信號(hào)進(jìn)行分析，得到在行為學(xué)參考點(diǎn)前2 s 到后1 s、0～100 Hz，LFPs-spike 的Multitaper頻譜相干的時(shí)頻分布圖(圖10)。兩組相干值在工作記憶行為學(xué)參考點(diǎn)前1 s 開(kāi)始增大，且集中在參考點(diǎn)前后，θ 頻段相干值增加幅度更大，刺激組整體相干值高于對(duì)照組。

圖4 兩組工作記憶實(shí)驗(yàn)時(shí)LFPs信號(hào)中θ頻段平均時(shí)頻分布

圖5 兩組工作記憶實(shí)驗(yàn)中LFPs的θ頻段平均能量

圖6 兩組工作記憶實(shí)驗(yàn)時(shí)LFPs信號(hào)中γ頻段平均時(shí)頻分布

圖7 兩組工作記憶實(shí)驗(yàn)中LFPs的γ頻段平均能量

圖8 spike序列圖

圖9 兩組平均spike速率直方圖

圖10 兩組工作記憶LFPs-spike平均Multitaper頻譜相干分布圖

行為學(xué)參考點(diǎn)前后1 s內(nèi)，刺激組θ頻段平均相干值(0.6809±0.0858)顯著大于對(duì)照組(0.5786±0.0713)(t=8.82,P <0.001)；γ 頻段平均相干值(0.5259±0.0300)顯著大于對(duì)照組(0.4553±0.0394)(t=13.43,P<0.001)。

3 討論

本研究顯示，刺激組較對(duì)照組更快地學(xué)會(huì)“T”形迷宮工作記憶實(shí)驗(yàn)，說(shuō)明高頻rTMS 可有效提升大鼠工作記憶行為學(xué)能力。關(guān)于提升作用的時(shí)效性，以及這種時(shí)效性是否與高頻rTMS 的其他參數(shù)有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

LFPs 信號(hào)的θ 頻段和γ 頻段是工作記憶的重要特征頻段[27]。本研究顯示，θ 頻段在工作記憶過(guò)程中起主要作用，γ 頻段次之。高頻rTMS 能提高LFPs 信號(hào)的θ 頻段和γ 頻段能量，提升工作記憶中行為學(xué)參考點(diǎn)前LFPs信號(hào)θ頻段集中程度，同時(shí)增強(qiáng)大鼠工作記憶中LFPs-spike 信號(hào)的協(xié)同編碼過(guò)程，實(shí)現(xiàn)對(duì)腦功能活動(dòng)的調(diào)控并影響大鼠的行為學(xué)能力。另外，高頻rTMS還能增強(qiáng)工作記憶中的γ振蕩。

Spike 信號(hào)是分析神經(jīng)電活動(dòng)機(jī)制最直接的途徑之一[28]，但目前受限于在體多通道技術(shù)手術(shù)難度、電極質(zhì)量、數(shù)據(jù)采集與分析的困難等因素，直接對(duì)spike信號(hào)的分析并不多見(jiàn)。本文列出一次典型工作記憶中的spike 序列圖和兩組大鼠平均spike 速率直方圖，可以觀察到spike 發(fā)放在工作記憶行為學(xué)參考點(diǎn)前比較集中，且高頻rTMS 后spike 平均發(fā)放率并無(wú)顯著性差異，可能與大鼠數(shù)量過(guò)少有關(guān)，有待進(jìn)一步完善。

為了避免分析單一模態(tài)神經(jīng)信號(hào)的缺陷，本文將采集到的兩種模態(tài)電信號(hào)進(jìn)行Multitaper 頻譜相干分析，結(jié)果顯示高頻rTMS 能在一定程度上提升大鼠工作記憶實(shí)驗(yàn)中θ 頻段和γ 頻段LFPs-spike 的同步化程度，這也印證了前文LFPs信號(hào)的功率譜分析結(jié)果。

本文為探究TMS 作用對(duì)大腦認(rèn)知功能的影響及其機(jī)制提供了參考，后續(xù)的研究將圍繞不同參數(shù)TMS作用后各種神經(jīng)電信號(hào)的聯(lián)合分析展開(kāi)。

利益沖突聲明：本文所有作者聲明不存在利益沖突。