張強(qiáng),張維維,丁勇,王佳雪,方春秋,齊偉辰*
1.長春中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院,吉林 長春 130117;2.吉林省長白山中藥資源工程研究中心,吉林 長春 130117
龍膽GentianascabraBunge為龍膽科多年生草本植物,為我國常用藥用植物,其根及根莖入藥,有極其重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和藥用價(jià)值。龍膽主產(chǎn)東北地區(qū),春、秋二季均可采收,以秋采者質(zhì)量最佳。龍膽含有多種化學(xué)成分且藥理活性顯著,能夠保肝、健胃、抗炎、抗菌、調(diào)節(jié)免疫力等[1]。《中華人民共和國藥典》2015年版記載中藥龍膽的基原植物包括龍膽、三花龍膽G.trifloraPall.、條葉龍膽G.manshuricaKitag.或者堅(jiān)龍膽G.rigescensFranch.,前3種習(xí)稱為“龍膽”,后一種習(xí)稱為“堅(jiān)龍膽”[2]。龍膽是近200種中成藥的重要原料[3],如龍膽瀉肝湯等[4]。
DNA條形碼分子鑒定法是利用基因組中一段公認(rèn)的、相對較短的序列來進(jìn)行物種鑒定的一種分子生物學(xué)技術(shù)。在藥用植物的物種鑒定領(lǐng)域,DNA條形碼鑒定技術(shù)最實(shí)際的用途即是對未知樣品進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定,采用標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)流程獲得未知樣品DNA條形碼序列,應(yīng)用Blast分析、序列比對、建樹法、距離法等標(biāo)準(zhǔn)化鑒定流程確保未知樣品鑒定的準(zhǔn)確性[5-6]。龍膽植物分類復(fù)雜,由于不同類群的特征性狀交叉重疊,各類型界限模糊不清,給其鑒定帶來非常大的困難。目前國內(nèi)外對龍膽質(zhì)量、藥用價(jià)值、藥理作用、生物分子遺傳多樣性等不同領(lǐng)域均有研究。本實(shí)驗(yàn)采用DNA條形碼技術(shù),對長白山不同地區(qū)龍膽植物和藥材進(jìn)行鑒定研究,以期為規(guī)范龍膽藥材市場、準(zhǔn)確鑒別藥材來源和資源評價(jià)提供參考。
龍膽GentianascabraBunge植株采集于吉林省長白山10個(gè)不同地區(qū),共31份,由長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院齊偉辰副教授鑒定,來源見表1。GenBank下載同屬植物ITS2序列10份,見表2。
表1 龍膽樣本來源
表2 龍膽屬植物ITS2序列
無水乙醇、三氯甲烷、氯化鈉、鹽酸(北京化工廠);異丙醇、氫氧化鈉(天津市興復(fù)科技發(fā)展有限公司);RNase A溶液(10 mg·mL-1,康為世紀(jì)生物科技股份有限公司);溴化十六烷基三甲胺(CTAB)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、乙二胺四乙二鈉鹽(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司);溴化乙錠(EB)溶液(上海捷瑞生物工程有限公司);石蠟油[生工生物工程(上海)股份有限公司]。
DK-S26型電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);WD-2105A型微型離心機(jī)、DYY-10C型電泳儀、WD-9403F型紫外儀(北京市六一儀器廠);ETC811型基因擴(kuò)增儀(蘇州東聯(lián)興業(yè)科學(xué)儀器有限公司);JX-FSTPRP型全自動樣品冷凍研磨儀(上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司)。
龍膽基因組DNA提取使用冷凍保存的葉片和根,采用改良的CTAB法提取DNA[7]。使用瓊脂糖凝膠電泳法及紫外分光光度計(jì)檢測DNA純度和濃度,提取DNA的A260 nm/A280 nm值為1.8~1.9(A表示吸光度),質(zhì)量濃度為4.85~6.50 μg·μL-1。
正向引物為5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′,反向引物為5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)體系為20 μL,含PremixTaq10 μL、ddH2O 8 μL、FP(10 μmol·L-1)0.5 μL、RP(10 μmol·L-1)0.5 μL、DNA模板(100 ng·L-1)1 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)步驟為95 ℃,5 min;95 ℃,15 s,55 ℃,15 s,72 ℃,1 min,40個(gè)循環(huán);72 ℃,5 min;40 ℃保存[5]。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后進(jìn)行雙向測序,測序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
測序結(jié)果經(jīng)Chromas校正,并將序列運(yùn)用SeqMan軟件進(jìn)行拼接,根據(jù)峰圖基序列對比,去除質(zhì)量差的部分,截取了250 bp長度的序列,并將截取的序列在GenBank核苷酸數(shù)據(jù)庫中Blast檢索并下載相似度高的龍膽、堅(jiān)龍膽、筆龍膽、三花龍膽、高山龍膽、條葉龍膽序列。所有候選序列經(jīng)MEGA 7.0軟件自動比對分析堿基之間的差異,計(jì)算Kimura 2-parameter (K2P)遺傳距離及建立鄰接(NJ)聚類進(jìn)化樹分析。聚類分析檢測選擇Bootstrap方法,重復(fù)1000次,鑒定各樣本。使Kimura 2-參數(shù)型作為氨基酸替代模型。
共10個(gè)地區(qū)31個(gè)龍膽葉片及藥材樣本瓊脂糖凝膠電泳的DNA提取率為100%,ITS2序列擴(kuò)增成功率為100%,測序成功率為100%,由測序后峰圖分析得知,各序列堿基相對分子質(zhì)量>20,經(jīng)Blast比對確定31個(gè)樣本堿基序列為所需鑒定品種。
龍膽屬植物41個(gè)樣本,經(jīng)SeqMan處理后,ITS2序列長度為205~210 bp。應(yīng)用MEGA 7.0軟件做序列對比,41個(gè)樣品中有36個(gè)堿基變異位點(diǎn)。其中采集的龍膽樣品與GenBank下載的筆龍膽有21個(gè)變異位點(diǎn)、與三花龍膽有6個(gè)變異位點(diǎn)、與堅(jiān)龍膽有21個(gè)變異位點(diǎn)、與高山龍膽共有19個(gè)變異位點(diǎn)、與龍膽均無變異位點(diǎn)。10個(gè)不同地區(qū)的龍膽之間也沒有堿基變異位點(diǎn),見表3。
表3 基于ITS2堿基序列各龍膽屬樣本間的堿基變異位點(diǎn)
10個(gè)不同地區(qū)的龍膽及GenBank下載的龍膽種內(nèi)遺傳距離為0,區(qū)分不明顯。筆龍膽與同屬各龍膽的種間遺傳距離為0.09和0.10,三花龍膽與同屬各龍膽的種間遺傳距離為0.03、0.09和0.10,條葉龍膽與除龍膽外的其他同屬龍膽的種間遺傳距離為0.09、0.10及0.03,堅(jiān)龍膽與同屬各龍膽的種間遺傳距離為0.10、0.12和0.09,高山龍膽與同屬各龍膽的種間遺傳距離為0.07和0.11,區(qū)分明顯,見表4。
表4 基于ITS2堿基序列各龍膽屬樣本間的K2P遺傳距離
基于41個(gè)樣本的ITS2序列建立NJ聚類進(jìn)化樹,見圖1,可知采集的31個(gè)樣本和GenBank下載的龍膽及條葉龍膽聚為1支,其他龍膽屬各種植物都自聚為1支,其中筆龍膽為1支,三花龍膽為1支,高山龍膽為1支,堅(jiān)龍膽為1支。可以明顯地區(qū)分出龍膽屬多數(shù)不同種植物,雖然具有一定程度上的親緣關(guān)系,但仍然存在差別;同時(shí)結(jié)合變異位點(diǎn)及K2P遺傳距離可清楚發(fā)現(xiàn),條葉龍膽和龍膽應(yīng)用ITS2堿基序列區(qū)分種間差異較??;吉林省長白山10個(gè)不同地區(qū)的龍膽種內(nèi)幾乎無差異,結(jié)合基于ITS2堿基序列變異位點(diǎn)、K2P遺傳距離比較、NJ聚類進(jìn)化樹顯示得出,吉林省長白山藥用植物龍膽為同一種龍膽,無任何差異,鑒別成功率100%。
圖1 基于各樣本ITS2堿基序列建立的龍膽屬植物NJ聚類樹
吉林省長白山10個(gè)不同地區(qū)龍膽葉片和藥材的ITS2序列沒有顯示出明顯的地區(qū)差異性,這與有效片段長度、取樣地的覆蓋度、道地藥材的性質(zhì)有關(guān)。道地藥材從生物學(xué)內(nèi)涵講是生物學(xué)上的居群,其產(chǎn)生除了與藥材特定的生態(tài)環(huán)境和特殊的采收加工技術(shù)有關(guān)外,還與該道地藥材產(chǎn)區(qū)內(nèi)這一物種的地方種群或居群中遺傳上的特殊性有關(guān)。所以道地藥材的一個(gè)重要特征就是遺傳特征,應(yīng)將其看作一個(gè)具有共同基因庫、由交配和親緣關(guān)系聯(lián)系起來的同一物種的個(gè)體群。因此,應(yīng)用DNA分子遺傳標(biāo)記鑒別方法,結(jié)合現(xiàn)代分子生物學(xué)手段,通過對遺傳信息的分析,能夠作為確定藥材道地性的手段之一[8-10]。本研究的樣本龍膽與從GenBank上下載龍膽的ITS2序列都能較好地區(qū)分,種內(nèi)變異情況幾乎不可見。由此可見,運(yùn)用ITS2序列對龍膽進(jìn)行鑒別是有效可行且成功率較高的一種分子鑒定方法;本研究也為DNA分子鑒別應(yīng)用在龍膽科其他屬或者其他中藥材的鑒別提供了參考。
龍膽屬藥用植物較多,有龍膽、三花龍膽、條葉龍膽、高山龍膽、堅(jiān)龍膽等。本研究主要是對吉林省長白山地區(qū)藥用植物龍膽進(jìn)行鑒別,提取了長白山10個(gè)不同地區(qū)的龍膽作對比,結(jié)果顯示,長白山各地區(qū)龍膽序列無差異,鑒定為龍膽;同時(shí)比較了龍膽與三花龍膽、條葉龍膽、高山龍膽、堅(jiān)龍膽等其他各龍膽屬植物間的種間差異,龍膽屬植物皆有明顯區(qū)別。理想的DNA條形碼要有足夠的種間變異和較小的種內(nèi)差異。DNA分子條形碼鑒別方法可以用于龍膽屬種間及種內(nèi)鑒別。從分子生物學(xué)角度即基因?qū)用孢M(jìn)行研究,比較DNA堿基序列上的差異,不受樣品形態(tài)限制,減少了人為主觀因素影響,使鑒定結(jié)果更加準(zhǔn)確,從而實(shí)現(xiàn)中藥鑒定標(biāo)準(zhǔn)化、自動化。