CRISPR/Cas9技術在作物中的研究及應用進展

羅 銀，劉 峰

（湖南大學研究生院隆平分院/湖南省蔬菜研究所，長沙 410125）

隨著時代的發(fā)展，DNA測序技術（DNA sequencing）正不斷進步與完善，水稻、玉米、番茄等多種作物已完成基因組測序［1～3］。如今科研工作者們將目光更多地集中在該怎么去解讀大量的基因組信息、功能以及該如何對基因組進行精準而又高效的修飾，因此當基因組編輯技術問世時便舉世矚目。基因組編輯技術（Genome editing）是一種借助序列特異核酸酶（Sequence-specific nucleases，SSNs）對目標基因進行精確定點修飾的技術，可以使靶位點的堿基發(fā)生替換、缺失、插入等的改變。目前SSNs主要有4種類型，即歸巢核酸酶（Mega nucleases，MNs）、鋅指核酸酶（Zinc finger nucleases，ZFNs）、類轉錄激活因子效應物核酸酶（Transcription activator-like effect or nucleases，TALENs）和成簇的規(guī)律間隔的短回文重復序列及其相關系統(tǒng)（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated 9，CRISPR/Cas9 system）［4～12］。這些SSNs可以在靶位點切割序列，產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂（Double strand breaks，DSBs），激活細胞內的兩種DNA損傷修復途徑：非同源末端連接（Non-homologous ending-joining，NHEJ）及同源重組（Homologous recombination，HR）［10］，從而實現(xiàn)精確的基因組編輯。本文對CRISPR/Cas9的基本概況、優(yōu)化及其應用等方面進行闡述。

1 CRISPR/Cas9的基本概況

1.1 基本結構與作用原理

CRISPR/Cas系統(tǒng)的組成部分是CRISPR序列與Cas基因家族。CRISPR序列由高度保守的順向重復序列和長度相近的間隔序列組成，在第1個重復序列的上游存在一個先導序列（leader sequence），它是CRISPR序列轉錄的啟動子，轉錄產(chǎn)生的非編碼RNA（CRISPR RNAs，crRNAs）與Cas蛋白一起參與細胞內CRISPR/Cas系統(tǒng)的免疫作用?？茖W家們在CRISPR序列位點附近發(fā)現(xiàn)了CRISPR相關基因（CRISPR-associated gene，Cas gene），并發(fā)現(xiàn)其核心元件序列不一樣，因此，學者們將CRISPR/Cas系統(tǒng)分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型（表1）［13］。Cas蛋白具有核酸酶功能，可以對DNA序列進行特異性切割，在Ⅰ型、Ⅲ型系統(tǒng)中，負責切割的是由多個Cas蛋白形成的復合物，在Ⅱ型系統(tǒng)中只用1個Cas9蛋白可切割DNA雙鏈。Cas9蛋白有兩個結構域：具有氨基末端的RuvC-like及HNH核酸酶結構域，每個結構域都與DNA的一條鏈結合，在單向導RNA（Single guide RNA，sgRNA）的引導下，通過對前間隔序列臨近基序（protospacer adjacent motif，PAM）的識別來靶定目標DNA序列并對其進行切割，形成DSBs。

表1 CRISPR/Cas系統(tǒng)的類型Table 1 The types of CRISPR/Cas system

CRISPR/Cas系統(tǒng)源于細菌和古生菌的適應性防御，其免疫應答反應分為3個階段。第一是獲得階段，噬菌體與外源DNA進入細菌后被識別結合到CRISPR陣列中產(chǎn)生免疫記憶后進入第二階段——表達階段，Cas蛋白被表達，CRISPR陣列被轉錄產(chǎn)生crRNA前體（Pre CRISPR RNA，Pre-crRNA），PrecrRNA經(jīng)過反式激活CRISPR RNA（Trans-activating crRNA，tracrRNA）和核糖核酸酶Ⅲ（RibonucleaseⅢ，RNaseⅢ）加工成為成熟的crRNA，最后是干擾階段，當噬菌體再次入侵時，CRISPR/Cas系統(tǒng)在crRNA的引導下Cas蛋白對噬菌體的基因組和質?；蚪M切割形成DSBs。

最初，CRISPR/Cas系統(tǒng)是由Cas蛋白、crRNA和tracrRNA三部分構成，主要由crRNA對靶位點進行特異性識別。2012年，Jinek等［14］報道了Ⅱ型系統(tǒng)切割DNA雙鏈的機制，對CRISPR/Cas9系統(tǒng)進行了優(yōu)化，使crRNA與tracrRNA整合成一條sgRNA，由此CRISPR/Cas9系統(tǒng)只有sgRNA、Cas9蛋白兩部分。在基因組編輯中，sgRNA與Cas9蛋白結合后與PAM序列進行匹配，從而識別目標基因序列，隨后Cas9蛋白對靶序列進行切割，形成DSBs，誘發(fā)細胞內的NHEJ或HR途徑對DSBs進行修復，高效地對基因組進行定點編輯與修飾（圖1）。

圖1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)模式圖Fig.1 CRISPR/Cas9 system pattern diagram

1.2 發(fā)展歷史

CRISPR/Cas系統(tǒng)始于1987年CRISPR序列的發(fā)現(xiàn)。1987年，Ishino等［15］科學家在E.coli中發(fā)現(xiàn)串聯(lián)間隔重復序列，Horvath等［16］在2002年對嗜熱鏈球菌全基因序列測序后提出了CRISPR的概念，然而那時他們并不了解它的功能，猜測它可能與噬菌體感染的免疫反應有關。到2007年，Barrangou等人［17］最先證明CRISPR序列確實能夠抵御外來噬菌體的入侵。隨著研究的深入，CRISPR系統(tǒng)的神秘面紗慢慢被揭開。Jinek等［14］在2012年取得重大進展，他們將crRNA與tracrRNA整合后形成一條sgRNA以切割DNA，使CRISPR/Cas9系統(tǒng)的構建更加簡單，到此CRISPR/Cas9系統(tǒng)基本成型［18］。2013年Cong等［19］利用特異性RNA將Cas9帶到靶位點進行切割，再加上Mali等［20］發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas9經(jīng)過改造后可對人類細胞進行切割，能使目標基因發(fā)生定點突變、定點插入外源基因，基因組的定向編輯技術進一步發(fā)展，同年11月張鋒與珍妮佛·杜德娜聯(lián)合創(chuàng)建了Editas Medicine（EDIT）公司，CRISPR/Cas技術開始走向市場。2014年，比爾·蓋茨基金會投資Editas Medicine公司，從此開始了CRISPR研究高潮。

1.3 修復DSBs的途徑

圖2 DNA修復途徑Fig.2 DNA repair pathway

修復DSBs途徑主要有兩種：NHEJ和HR（圖2）。在發(fā)生頻率上，發(fā)生頻率高的是NHEJ途徑，基本上所有的細胞及G1、S、G2期都能發(fā)生，而HR途徑的發(fā)生頻率極低，主要在S、G2期［21］；但在編輯精確度上，HR途徑比NHEJ途徑高。通過NHEJ途徑，DNA雙鏈重新黏合，在DSB處會有少量的核苷酸（Nucleotide）插入或刪除（Insertions/Deletions，Indels）。在人工提供同源序列時，修復DSBs便是HR途徑，它以同源序列為模板，會產(chǎn)生精確的定點替換或插入突變體［22］。

1.4 CRISPR/Cas9技術的優(yōu)勢

目前通過傳統(tǒng)雜交育種進行遺傳改良周期長，需大量的材料；物理或化學誘變雖能產(chǎn)生大量的突變位點，但很難掌握突變的方向，導致鑒定不易；RNAi能夠使基因沉默，但是不能穩(wěn)定遺傳。與這些方法相比，基因組編輯技術的優(yōu)勢在于：（1）操作簡單，成本較低，適用于任何物種，目前已在酵母、果蠅、人類細胞、擬南芥、煙草、玉米、小麥、水稻等多種模式動、植物中成功應用；（2）效率高，不需要像雜交育種那么長的周期；（3）精確度高，通過設計sgRNA便能特異性識別目標基因的序列，對任意靶位點進行編輯，而T-DNA插入突變等技術則很難從具有特殊結構的基因中獲得突變體；（4）可通過聚合不同基因至同一區(qū)段，使基因能夠穩(wěn)定表達；（5）可同時進行多基因編輯，突變不同的靶位點時只用重新構建與靶序列互補的sgRNA，將其與CAS9亞克隆于同一轉化載體中即可，大大提高了基因編輯的效率。

2 CRISPR/Cas9技術的優(yōu)化

2.1 核心元件的優(yōu)化

CRISPR/Cas9與ZFN、TALEN技術都存在著脫靶效應，目前對已經(jīng)完成全基因組測序的作物可以通過在線工具（CasOFFinder、E-CRISPR、CRISPR-P等）預測發(fā)生脫靶的位點來選擇合適的技術（或sgRNA）對目標基因進行編輯（表2），但還有很多作物的基因組并未完全測序，而且對于某些全基因組中不預測的脫靶效應還不能通過目前的在線工具進行預測［23］。

表2 適用于CRISPR/Cas9技術的在線工具Table 2 The online tools for CRISPR/Cas9 Technology

2.1.1 Cas蛋白的優(yōu)化

對于Cas蛋白而言，Cas9蛋白識別PAM序列為NGG，限制了編輯范圍。針對這點，科學家們在其他生物中進行了Cas蛋白的改造以擴大識別范圍。當RuvC結構域上的氨基酸發(fā)生突變時，如第10位天冬氨酸（Aspartic acid，Asp）突變?yōu)楸彼幔ˋlanine，Ala），會導致結構域失活，不具有切割功能，于是Cas9蛋白只有切口酶的功能，只能切割一條與HNH結構域結合的鏈，當HNH結構域上的氨基酸發(fā)生突變時，如第840位的組氨酸（Histidine，His）突變成丙氨酸（Alanine，Ala），結構域同樣會失活，這時能切割的就是與RuvC結構域結合的一條鏈，可高效介導外源基因的定點插入，大大降低了NHEJ途徑帶來的風險；當兩個結構域都發(fā)生氨基酸突變時，Cas9蛋白就會變成失活的Cas9蛋白（dead Cas9，dCas9），能通過連接激活子或抑制子對基因進行表達調控。經(jīng)過多年的研究，發(fā)現(xiàn)很多SpCas9同源蛋白，如識別“NNAGAA”PAM序列的嗜熱乳鏈球菌Cas9核酸酶（St1Cas9）［23～25］、識別“NNGRRT”PAM序列的金黃色葡萄球菌Cas9核酸酶（SaCas9）［26］，擴大基因組編輯的范圍。Cas12a蛋白，即Cpf1，它與Cas9蛋白相比區(qū)別在于Cas9蛋白切割形成平末端，Cas12a蛋白切割形成粘性末端，有4～5 nt的粘性凸起，使植物更易以HR方式對DSBs進行精確的替換，Cas12a蛋白的sgRNA更短，提高了Cas12a的打靶效率，且它的脫靶率更低，識別序列時TTTN，有利于對AT含量較高的DNA區(qū)域進行打靶。Cas13a蛋白可以在sgRNA引導下識別RNA并進行切割。

2.1.2 sgRNA的優(yōu)化

對于sgRNA而言，理論上較長的靶DNA序列會降低脫靶的概率，然而從Fu等［27］的研究來看，17～19 nt長的sgRNA比20 nt的sgRNA活性更強、脫靶率更低，當sgRNA縮短為15 nt時則會失活。2017年Kweon等［28］通過開發(fā)融合向導RNA（fgRNA）與Cas9和Cas12a蛋白共同作用以減輕脫靶效應，而fgRNA并不會降低編輯效率。

2.1.3 Cas9蛋白與sgRNA同時優(yōu)化

對Cas9蛋白與sgRNA同時進行優(yōu)化，即基因組編輯技術的新成員——先導編輯（Prime Editing），其同時具有搜索和替換的功能，能夠介導靶向的插入、缺失和替換。該技術通過將Cas9切口酶（SpCas9 H840A）與反轉錄酶（Reverse Transcriptase）融合表達形成Prime Editor（PE），通過使用經(jīng)改造過的gRNA——導向編輯指導RNA（Prime editing guide RNA，pegRNA）實現(xiàn)對目標基因的編輯。

2.1.4 啟動子的選擇

對于啟動子而言，在構建CRISPR載體時通常使用組成型啟動子來啟動Cas蛋白的表達，如35S，但此類啟動子只會造成體細胞基因的編輯，使編輯效率低，因此科研人員研究不同的啟動子，包括在生殖細胞、細胞分裂活躍的組織中特異性表達的啟動子（表3）。

表3 啟動Cas蛋白表達的啟動子Table 3 Promoters that activate the expression of Cas protein

2.2 單堿基編輯系統(tǒng)

NHEJ修復途徑發(fā)生頻率高，但其修復不精確，通常會產(chǎn)生少量的Indels產(chǎn)物，而HR修復途徑雖然比NHEJ途徑精確度高，但是細胞類型、細胞周期對HR途徑的限制很大，而且這兩條途徑相互競爭，導致HR途徑很難高效地產(chǎn)生穩(wěn)定的單堿基突變。在2016年由David Liu課題組開發(fā)了一種新的基因組編輯技術——堿基編輯技術（Base editing），實現(xiàn)了對基因組的精準編輯，使CRISPR/Cas能夠對特定堿基進行修改［29，30］。該技術以CRISPR/Cas系統(tǒng)為基礎，通過dCas蛋白或nCas蛋白與作用于單鏈DNA的脫氨酶結合來實現(xiàn)對靶位點的堿基替換，根據(jù)堿基修飾酶的類型分為胞嘧啶堿基編輯器（cytosine base editor，CBE）與腺嘌呤堿基編輯器（adenine base editor，ABE）兩種，CBE系統(tǒng)與ABE系統(tǒng)分別利用胞嘧啶脫氨酶（Cytosine deaminase，CD）、腺嘌呤脫氨酶（Adenine deaminase，AD）能夠實現(xiàn)C-T或A-G的堿基替換（圖3）。單堿基編輯系統(tǒng)的優(yōu)勢主要表現(xiàn)在三個方面：（1）不需要引入DSBs。BE技術只需dCas蛋白或nCas蛋白即可實現(xiàn)對堿基定點替換；（2）與HR途徑相比，BE系統(tǒng)不需提供模板DNA。HR途徑必須在存在同源序列的情況下才能進行基因的定點編輯，最重要的是目前很難統(tǒng)一供體DNA的形式以及同源序列的長度，對于該怎么將足夠的供體DNA有效地運送到細胞中這一難題也尚未完全解決［31］，因此HR途徑有很多不確定性。但BE系統(tǒng)可直接利用CD或AD通過sgRNA的引導高效實現(xiàn)C-T或A-G的替換；（3）BE系統(tǒng)的編輯效率高，適用于多種物種上。目前BE系統(tǒng)已經(jīng)在動物細胞、人類細胞、植物、細菌等中被廣泛使用［32～35］。

圖3 ABE與CBE系統(tǒng)的工作原理Fig.3 Mechanismsof ABE and CBE system

3 CRISPR/Cas技術在作物中的應用

3.1 水稻

針對水稻基因的功能及品種改良科學家們進行了很多研究，已有很大的進展。2013年，Shan等［36］通過利用經(jīng)過優(yōu)化后的Cas9進行原生質體的轉化，發(fā)現(xiàn)OsPDS基因的突變率為14.5%～20.0%，Os-BAHD2、Os02g23823與OsMPK2發(fā)生Indels的比例在26.5%～38.0%，接著對OsPDS-SP1基因進行打靶，用基因槍法對其胚性愈傷組織進行轉化，共獲得96株轉基因植株，其中有9株突變植株，突變率為9.4%，在這9株植株中有3株植株是發(fā)生雙等位基因突變的且具有矮化、白化的特征。Xu等［37］利用兩個35S啟動子與U6-26啟動子分別驅動SpCAS9與sgRNA，針對水稻BEL利用根癌農(nóng)桿菌侵染胚性愈傷組織，獲得90株轉基因植株，其中14例有插入和缺失突變，純合突變體呈現(xiàn)對苯達松敏感的表型。Li等［38］利用CRISPR/Cas9技術特異誘導水稻中Gn1a、DEP1、GS3與IPA1四種基因發(fā)生突變，這些基因分別在籽粒數(shù)、穗結構、粒大小與株型等發(fā)揮調控作用。對T0代轉基因植株的表型與效率分析表明，該系統(tǒng)在誘導目標基因編輯方面具有很高的效率，分別為27.5%（IPA1）、42.5%（Gn1a）、57.5%（GS3）、67.5%（DEP1），Gn1a、GS3與DEP1突變體的T2代分別具有粒數(shù)增加、粒徑增大、直立穗密集的特點。

3.2 小麥

2014年，Wang等［39］利用TALENs和CRISPR/Cas9系統(tǒng)對小麥內源基因進行改造，以獲得新的能穩(wěn)定遺傳的性狀，他們選擇了3個MLO位點（TaMLO-A1、TaMLO-b1、TaMLO-d1），為修改3個TaMLO使用了一對TALENs（T-MLO），從T0代450株轉基因植株中發(fā)現(xiàn)27株突變植株，突變效率為6.0%。接著利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在單個TaMLO等位基因中誘導突變，使用T7內切酶Ⅰ（T7E1）鑒定sgMLO-A1在小麥原生質體、植株中誘導的突變，在T0代的72株轉基因植株中篩選出4個獨立的突變體，突變效率為5.6%，與TALENs獲得的突變效率相似，而且他們還發(fā)現(xiàn)這3個基因都參與了面包小麥對Bgt感染的反應，這3個同源等位基因同時突變使小麥對白粉病具有廣譜抗性。2017年Zhang等［40］利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除TaEDR1基因得到了Taedr1突變體，利用PCRRE鑒定了5個突變株系（T0-1、T0-2、T0-3、T0-4、T0-5），測序結果表明T0-1、T0-2、T0-3三個基因組都存在移碼突變，對207株T1植株進行PCRRE與測序分析，僅鑒定出5個純合T1突變體（3個來自T0-2，2個來自T0-3）具有移碼突變，與野生型相比，其白粉病微菌落少和易感性降低，由此可見其對白粉病的抗性增加。

3.3 番茄

2015年，由于缺乏有效的方法將DNA修復模板傳遞給植物細胞，使用HR途徑修飾植物基因組一直是個挑戰(zhàn)?！ermák等［41］使用雙生病毒復制子對番茄基因組進行遺傳修飾，其頻率比傳統(tǒng)的DNA傳遞方法（農(nóng)桿菌）高10倍。他們在番茄的基因組中，在ANT1的啟動子區(qū)和基因編碼區(qū)之間設計了TALEN或CRISPR/Cas9位點，提供模板DNA，包括兩個同源臂，即ANT1的啟動子區(qū)和編碼區(qū)，還添加了Nos的啟動子區(qū)、抗生素基因的編碼區(qū)、35S終止子區(qū)和35S啟動子，因此TALEN或CRISPR進入基因組對其位點進行切割后啟動植物HR修復機制，使模版DNA插入到基因組上，即在表達抗生素基因后還插入了一個35S強啟動子基因，使原本由內源啟動子啟動的ANT1變成由35S啟動，增加了ANT1的表達，得到花青素含量高的果實。2017年，為了研究SlMAPK3基因對干旱脅迫的響應，Wang等［42］使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除該基因獲得slmapk3突變體，在干旱脅迫下，與野生型相比其萎蔫更嚴重、更高的H2O2含量、更低抗氧化酶活性以及更多的膜損傷，此外，敲除基因導致干旱脅迫應答基因Sl-LOX、SlGST、SlDREB的表達上調或下調，證明Sl-MAPK3通過保護細胞膜免受氧化損傷和調節(jié)脅迫相關基因的轉錄參與番茄植株的干旱反應，具有抵抗干旱的能力。2018年，Li等［43］利用CRISPR/Cas9技術對5個基因，即在SP編碼區(qū)、SP5G編碼區(qū)、CLV3啟動子區(qū)、WUS順式調控元件及GGP1開放閱讀框上游進行編輯，這5個基因分別調控植株的株型、開花時間、果實大小及維生素C含量，將理想性狀導入4份耐逆野生番茄材料中，發(fā)現(xiàn)馴化后的番茄植株株型變得緊湊，開花時間提前，果實變大、維生素C含量上升，且保持了親本的抗病性與耐鹽性。

3.4 黃瓜

2016年，Chandrasekaran等［44］利用CRISPR/Cas9技術對黃瓜的病毒抗性進行研究，以elF4E基因的N0與C0末端為靶位點構建了Cas9/sgRNA載體對該基因進行敲除，結果表明純合T3代植株對黃瓜葉脈黃化病毒感染具有免疫力，對西葫蘆黃化花葉病毒、木瓜環(huán)斑鑲嵌病毒具有抗性，而雜合突變體與非突變體對這些病毒高度敏感，說明elF4E基因在黃瓜中具有廣譜的抗病毒能力。2017年，戚晶晶等［45］利用CRISPR/Cas9技術敲除了CsVFB1基因，經(jīng)單克隆測序后在21個有效單克隆中檢測到4個突變，成功獲得轉基因矮生黃瓜T0代植株，突變效率為19.05%。2018年，楊麗等［46］對CRISPR/Cas9載體進行優(yōu)化，對CsVFB1、CsMLO8、CsGAD1基因進行編輯，發(fā)現(xiàn)T0植株編輯效率為100%，提高了黃瓜CRISPR/Cas9系統(tǒng)的編輯效率。利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，將CsWIP1基因敲除，從后代中篩選出純合突變體Cswip1，使雌雄同株轉化為全雌株，創(chuàng)制了黃瓜全雌系種質材料。

4 展望

自SSNs被發(fā)明，在這十多年的時間里基因組編輯技術發(fā)生了翻天覆地的變化，CRISPR/Cas9技術極大地加快了對作物基因功能的研究速度，同時也能作為一種新型育種技術（Newbreedingtechniques，NBTs）對作物品種進行改良，然而CRISPR/Cas9技術還面臨著很多問題亟待解決。

首先是脫靶問題。CRISPR/Cas9技術在植物中發(fā)生的脫靶可以通過后代的分離而消除，若能消除脫靶，對其發(fā)展則有十分深遠的影響。本文中提到了多種方法可以提高其特異性，比如對Cas蛋白進行優(yōu)化等。

第二，提高編輯效率。首先，針對DNA修復途徑來提高編輯效率，不同物種、細胞類型發(fā)生HR途徑頻率有很大的區(qū)別。（1）細胞周期的同步化。HR途徑主要發(fā)生在S、G2期，NHEJ途徑主要發(fā)生在G1、S、G2期，細胞周期不同所選擇的修復方式也不同，可通過對細胞周期同步化后再進行基因組編輯。（2）供體DNA的優(yōu)化。通過優(yōu)化供體DNA的數(shù)量、長度、類型、導入方式，可提高HR途徑效率。如Baltes等［47］利用煙草為研究材料，使用雙生病毒載體表達SSNs與DNA模板，與T-DNA載體相比，HR途徑效率有了很大提高。其次，針對CRISPR/Cas9系統(tǒng)進行優(yōu)化，如核心元件的優(yōu)化。

最后，各國政府對基因編輯作物的監(jiān)管問題。隨著CRISPR/Cas9技術的發(fā)展，越來越多的學者利用其進行品種改良，能夠將需要幾年甚至是幾十年的時間縮短至幾個月，更重要的是CRISPR/Cas9技術能夠獲得理想的特性并將其穩(wěn)定遺傳給后代，但是這樣所獲得的基因編輯作物會給世界帶來什么樣的結果還一無所知，人們對此十分關注。目前各國政府對轉基因生物（Genetically modified organisms，GMOs）主要有兩種監(jiān)管態(tài)度［48］：（1）以歐盟為代表的基于過程的監(jiān)管（Process-based），基因重組技術被認為具有潛在的危險性。無論通過這項技術獲得什么基因或生物，只要有外源DNA轉入，哪怕最終體內不存在外源DNA，都需要進行安全性評估與監(jiān)測；（2）以美國為代表的基于產(chǎn)品的監(jiān)管（Productbased），認為GMOs與非轉基因生物（Non-genetically modified organisms，Non-GMOs）之間沒有本質區(qū)別，需要監(jiān)管的是生物技術的產(chǎn)物，而不是技術本身。相比較而言，過程監(jiān)管要比產(chǎn)品監(jiān)管更嚴格。美國農(nóng)業(yè)監(jiān)管機構認為，基因編輯作物（Genome edited crops，GECs）是通過激活細胞中的DNA修復機制而產(chǎn)生的突變，類似于自然突變、物理化學誘導突變，不屬于GMOs。2016年，楊亦農(nóng)教授通過CRISPR/Cas9技術培育的白蘑菇經(jīng)過批準可不受監(jiān)管，成為第一個脫離監(jiān)管的GEC。到目前為止，美國農(nóng)業(yè)監(jiān)管機構已經(jīng)確定了至少5種GECs不屬于GMOs，包括ZFNs技術創(chuàng)造的低植酸玉米品種、TALEN技術創(chuàng)造的耐冷藏馬鈴薯品種及高油酸、低亞油酸大豆，以及CRISPR/Cas9技術創(chuàng)造的抗褐化雙孢菇和抗除草劑玉米［49］。由于受多種因素的影響，歐盟對待GMOs的態(tài)度十分謹慎，對待轉基因及基因編輯等NBTs的態(tài)度也十分保守，導致其產(chǎn)業(yè)格局以及產(chǎn)品的開發(fā)落后于美國等國家。中國國務院發(fā)布的《農(nóng)業(yè)轉基因生物安全管理條例》明確指出，農(nóng)業(yè)轉基因生物是指利用基因工程技術改變基因組構成，用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)或農(nóng)產(chǎn)品加工的動植物、微生物及其產(chǎn)品。然而目前對于GECs的監(jiān)管標準沒有明確的規(guī)定，對其的監(jiān)管態(tài)度也沒有相關的報道。盡管基因組編輯技術只出現(xiàn)十幾年，但對農(nóng)業(yè)、醫(yī)學的影響十分重大，目前全球基因組編輯技術產(chǎn)業(yè)格局逐漸成形，我國基因組編輯技術位于世界前列，針對我國國情及基因組編輯技術研究進展制定合理的法規(guī)對正確引導我國基因組編輯技術的發(fā)展與應用至關重要。

綜上所述，CRISPR/Cas9技術在基因功能分析、植物分子育種、人類疾病靶向治療等方面具有無限潛力，雖然存在著一些問題，但是隨著更多研究人員對該技術深入研究會使其逐漸完善，希望我國能在夯實現(xiàn)有基礎上再向前一步，形成我國基因組編輯技術應用的優(yōu)勢領域，鼓勵創(chuàng)新，發(fā)展具有自主知識產(chǎn)權的基因組編輯技術，爭取在該領域中的主動權和話語權。