免疫組織化學(xué)法雙色銀染原位雜交與熒光原位雜交技術(shù)檢測乳腺癌HER-2基因狀態(tài)的應(yīng)用

劉繼英， 陳明光， 韓明其， 龔云輝， 黎 輝

(福建省南平市第一醫(yī)院病理科， 福建 南平 353000)

HER-2是定位于人17號染色體(chromosome 17 centromere locus，CEP17)長臂上的原癌基因，HER-2基因狀態(tài)與腫瘤發(fā)生、進(jìn)展密切相關(guān)，且HER-2也可作為乳腺癌預(yù)后的評估指標(biāo)[1,2]。因此，如何提高病理學(xué)檢查HER-2基因狀態(tài)的準(zhǔn)確性，是當(dāng)前學(xué)者們研究的熱點之一。免疫組織化學(xué)法(immuno-histochemistry，IHC)是檢查HER-2最常用手段之一，而隨著檢查技術(shù)的更新，目前雙色銀染原位雜交(dual-color silver-enhanced in-situ hybridization，DISH)、熒光原位雜交技術(shù)(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)等技術(shù)也被用以檢查HER-2基因狀態(tài)，但各種檢查方式各有優(yōu)缺點，且目前綜合評價3種檢查方式對于HER-2基因狀態(tài)效果的研究并不多[3]。為提高臨床檢查HER-2基因狀態(tài)的準(zhǔn)確性，現(xiàn)選取乳腺癌組織標(biāo)本作為研究對象，觀察IHC、DISH、FISH對于HER-2基因檢查的效果。研究結(jié)果如下。

1 資料與方法

1.1材 料

1.1.1研究對象:回顧性的選取2017年1月至2019年12月我院收治的180例乳腺癌患者作為研究對象，均為女性，年齡28～65歲，平均年齡(45.29±6.18)歲，其中導(dǎo)管癌132例、導(dǎo)管內(nèi)癌48例，均為單側(cè)。所有患者留取組織標(biāo)本前，均未接受放療、化療、靶向治療、免疫治療等治療，且手術(shù)切組織0.5h內(nèi)經(jīng)甲醛固定。

1.1.2試劑與材料:乙二胺四乙酸二鈉抗原修復(fù)液(ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt，EDTA)、檸檬酸鈉緩沖液(sodium citrate-hydrochloric acid buffer solution，SSC)、甲酰胺、二脒基苯基吲哚熒光染料(4,6-siamidino-2-phenylindole,dihydrochloride，DAPI)、二氨基聯(lián)苯胺(3,3-diaminobenzidine，DAB)顯色液均購自北京凱瑞基生物科技有限公司，磷酸緩沖鹽溶液、3%過氧化氫液(A液，自配)、二甲苯均購自上海鈺博生物科技有限公司，非免疫性動物血清封閉液(B液)購自南京森貝伽生物科技有限公司，HER-2抗體免疫組化試劑盒(即用型鼠抗人單克隆抗體)購自北京中杉金橋生物公司，蘇木精由Solarbio提供，羅氏全自動免疫組化儀購自于Roche Benchmark XT，DISH檢測試劑由Ventana提供，PAthena Vysion HER-2 DNA探針試劑盒購自美國雅培公司，BX41光學(xué)顯微鏡、BX51熒光顯微鏡均購自奧林巴斯科學(xué)儀器(中國)有限公司。

1.2方 法

1.2.1IHC:取組織標(biāo)本，常規(guī)脫蠟、洗片，PBS沖洗，加EDTA修復(fù)組織抗原，PBS緩沖液沖洗，加A液，PBS沖洗，加B液，PBS緩沖液沖洗，加一抗(37℃、40min)、PBS沖洗、加DAB顯色液，上鏡觀察3～10min，鏡內(nèi)出現(xiàn)棕黃色，取下流動自來水沖洗，并蘇木精復(fù)染、沖洗返藍(lán)、脫水、二甲苯，封固，鏡檢；并以PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照組，以試劑盒內(nèi)提供的WTX陽性腎組織為陽性對照組。

1.2.2DISH:取組織切片，65℃恒溫箱烤片1～2h，上羅氏BenchMark CX全自動免疫組化染色機(jī)，加DISH檢測試劑，反應(yīng)結(jié)束后取片，蒸餾水沖洗，梯度酒精脫水，加二甲苯浸泡至透明，封固；并以腫瘤周邊內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等非腫瘤細(xì)胞作為內(nèi)對照。

1.2.3FISH:取組織切片，65℃恒溫箱烤片過夜、加二甲苯脫蠟(10min/次、2次)，復(fù)水，加30%酸性亞硫酸鈉(50℃、20～30min)處理、SSC漂洗(5min/次、2次)、酶消化、脫水，浸入丙酮(2min)、干燥，加蓋玻片(56℃、3min)后浸入變性溶液(73℃、5min，以下操作均為避光操作)，取出切片至梯度酒精脫水(-20℃)、預(yù)熱(45～50℃、2～5min)后于探針與42℃環(huán)境中過夜雜交，取玻片甲酰胺洗滌，自然干燥后加DAPI復(fù)染，靜置20～30min后上熒光顯微鏡觀察。

1.2.4判讀:均由2名病理科醫(yī)師判讀，以最終一致結(jié)果為最終結(jié)果。IHC參照ASCO/CAP HER-2 HER-2檢測指南(2013版)[4]，(-)、(+)為陰性，(++)可疑陽性、(+++)陽性，(-)無著色或<10%癌細(xì)胞膜微弱著色或弱且不完整著色，(+)≥10%癌細(xì)胞弱著色，(+++)>10%癌細(xì)胞強(qiáng)且完整著色，余為(++)。DISH參照ASCO/CAP HER-2指南(2013版)，HER-2基因呈黑色信號、CEP17呈紅色信號，觀察信號清晰的癌細(xì)胞，連續(xù)計量20個細(xì)胞信號，計算HER-2/CEP17(比值a)、平均HER-2拷貝數(shù)/細(xì)胞數(shù)(比值b)，若比值a<2.0、且比值b<4.0為無擴(kuò)增；若比值a<2.0、4.0≤比值b<6為不確定，再計數(shù)20個細(xì)胞信號；比值a≥2.0、比值b>6.0視為有擴(kuò)增，且CEP17拷貝數(shù)/細(xì)胞數(shù)≥3為CEP17多倍體。FISH參照參照指南[4]，HER-2基因呈紅色信號、CEP17呈綠色信號，觀察信號清晰的癌細(xì)胞，計量30個細(xì)胞信號，若比值a<1.8為陰性、比值a>2.2為陽性，1.8≤比值a≤2.2為不確定，則需計數(shù)40個復(fù)測，且CEP17平均數(shù)為1.76～2.25為二倍體、CEP17≥3.0為多倍體。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理:采用統(tǒng)計軟件SPSS22.0處理數(shù)據(jù)，行一致性檢驗，Kappa值表示，且Kappa值取0～1，Kappa≥0.75一致性較好、0.75>Kappa≥0.40一致性一般，Kappa<0.40一致性差，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1一般資料:180例患者中，淋巴轉(zhuǎn)移15%(27/180)，IHC檢查HER-2表達(dá)陰性118例(其中(-)83例、(+)35例)、表達(dá)陽性49例，另有13例標(biāo)本為可疑陽性。

2.2DISH與IHC比較:DISH檢查HER-2擴(kuò)增56例、無擴(kuò)增107例、不確定17例；多倍體17例，占比9.44%，其中IHC陽性檢出58.82%(10/17)、IHC可疑陽性檢出0(0/17)、IHC陰性檢出41.18%(7/17)；且，HER-2/CEP17比值范圍為0.6～17.6，中位數(shù)為2.1。DISH與IHC比較，DISH無擴(kuò)增與IHC陰性表達(dá)符合率為83.05%[(69+29)/(83+35)]、DISH擴(kuò)增與IHC陽性表達(dá)符合率為83.67%(41/49)，去除DISH不確定、IHC可疑陽性，2種檢測方式的Kappa值為0.788(P=0.000)，一致性較好。詳見表1。

表1 DISH與IHC比較n(%)

表2 FISH與IHC比較n(%)

2.3FISH與IHC比較:FISH檢查HER-2擴(kuò)增54例、無擴(kuò)增107例、不確定19例；多倍體16例，占比8.89%，其中IHC陽性檢出62.5%(10/16)、IHC可疑陽性檢出0(0/16)、IHC陰性檢出37.5%(6/16)；且HER-2/CEP17比值范圍為0.8～10.1，中位數(shù)為1.8。FISH與IHC比較，F(xiàn)ISH無擴(kuò)增與IHC陰性表達(dá)符合率為82.20%[(72+25)/(83+35)]、FISH擴(kuò)增與IHC陽性表達(dá)符合率為81.63%(40/49)，去除FISH不確定、IHC可疑陽性，2種檢測方式的Kappa值為0.784(P=0.000)，一致性較好。詳見表2。

2.4DISH與FISH比較:DISH與FISH比較，2種檢查方式在HER-2無擴(kuò)增中的符合率為99.07%(106/107)，而在HER-2擴(kuò)增中的符合率為98.15%(53/54)，且2種檢測方式的Kappa值為0.939(P=0.000)，一致性高；去除DISH不確定、FISH不確定，2種檢查方式的Kappa值為1.000(P=0.000)。詳見表3。

表3 DISH與FISH比較n(%)

3 討 論

隨基因?qū)W、蛋白質(zhì)組學(xué)等學(xué)科在臨床實踐中的發(fā)展，越來越多的學(xué)者、專家意識到分子病理學(xué)在腫瘤的早期診斷、靶向治療、預(yù)后評價中的重要地位，也使得傳統(tǒng)經(jīng)驗診治模式向著個體化治療轉(zhuǎn)變。要進(jìn)行有效的個體化治療，繼續(xù)對乳腺癌進(jìn)行科學(xué)的分型，且乳腺癌分型越準(zhǔn)確其指定的干預(yù)手段能使患者獲益更多[5]。乳腺癌從最初的形態(tài)學(xué)病理分型發(fā)展，至今已演變?yōu)橐怨軤預(yù)/B型、基底樣癌、HER-2過表達(dá)等分型，其中20%～30%的乳腺癌患者存在HER-2過表達(dá)[6]，而HER-2過表達(dá)的患者與HER-2無擴(kuò)增、低擴(kuò)增患者相比，過表達(dá)患者預(yù)后差、生存時間短。盡管HER-2過表達(dá)對傳統(tǒng)CME、他莫昔芬等治療不敏感，但對HER-2過表達(dá)患者應(yīng)用曲妥珠單抗、拉帕替尼、帕妥珠單抗等藥物[7,8]，可有效提高患者無病生存期、改善預(yù)后。不過，針對HER-2的靶向藥物又會增加治療費用和毒副作用，因此，對HER-2過表達(dá)的乳腺癌患者行個體化治療時，既要考慮提高臨床效果，又要避免不必要的治療，而這就有賴于能否準(zhǔn)確評價乳腺癌患者HER-2基因狀態(tài)。

IHC、DISH、FISH均可對HER-2是否過表達(dá)進(jìn)行評價。其中IHC的特異性抗體具有顯色作用，能夠?qū)乖瓲顟B(tài)行定位、定量、定性分析，IHC法可通過檢測HER-2蛋白從而評價HER-2基因狀態(tài)。在本組案例中結(jié)果顯示，IHC檢測HER-2蛋白陽性表達(dá)率為27.22%，這提示IHC具有一定的評價能力。IHC相比于其他檢查手段，其操作簡單、敏感性高等優(yōu)勢，在基層醫(yī)院及大量樣本中評判HER-2中具有良好的應(yīng)用價值。但I(xiàn)HC也有其不足，首先IHC是對HER-2蛋白的評估，并不是直接對HER-2基因狀態(tài)加以分析的，且在檢查過程中的標(biāo)本制作、染色處理、結(jié)果判讀等受操作者影響較大，可能導(dǎo)致標(biāo)本中HER-2蛋白被破壞，其特異性較低，因而需探討更為合適的檢測手段。DISH于2013年被ASCO/CAP HER-2指南推薦為檢查HER-2基因狀態(tài)的檢測手段之一，DISH是通過銀沉淀技術(shù)對HER-2、CEP17拷貝數(shù)顯現(xiàn)不同顏色信號加以分析HER-2基因狀態(tài)，且DISH具有切片保存時間久、無需避光觀察、全自動分析儀操作等優(yōu)勢。本組案例中結(jié)果顯示，DISH檢查HER-2擴(kuò)增56例、無擴(kuò)增107例、不確定17例，且與IHC的一致性較高，Kappa值為0.788。但DISH也有其不足，DISH檢查不是各個院級都可進(jìn)行的，而各種因素導(dǎo)致評判信號的不準(zhǔn)確影響最終結(jié)果；另外，DISH作為評估乳腺癌患者HER-2基因狀態(tài)的新手段，要在臨床廣泛應(yīng)用的基礎(chǔ)也是基于DISH與FISH具有高一致性。FISH是檢測基因的“金標(biāo)準(zhǔn)”，重復(fù)性好、受標(biāo)本處理影響小，在熒光顯微鏡下就可觀察到熒光信號，從而對HER-2基因擴(kuò)增情況加以分析[9]。雖然FISH被視為評價基因的金標(biāo)準(zhǔn)，但FISH也有其不足，首先是FISH操作繁瑣復(fù)雜、耗時長，各操作都需在避光條件下進(jìn)行，且熒光易淬滅、染色切片并不適宜長期保存，最后其成本也高，因此FISH并不適宜在HER-2基因狀態(tài)檢查中應(yīng)用和推廣。本組案例結(jié)果顯示，F(xiàn)ISH與IHC的一致性較好，Kappa值為0.784，這提示IHC在評估HER-2基因狀態(tài)中具有一定的可靠性；而與DISH比較，2種檢查方式的Kappa值為0.939(去除不確定案例，2種檢查手段的符合率高達(dá)100%)，這提示，DISH具有臨床評估乳腺癌HER-2基因狀態(tài)廣泛應(yīng)用的前提。結(jié)合分析3種檢查手段的優(yōu)缺點：臨床要對乳腺癌患者HER-2基因狀態(tài)進(jìn)行評價，其乳腺癌組織標(biāo)本可先行IHC檢測，若IHC報告為陰性、陽性可直接給予報告，并根據(jù)HER-2是否過表達(dá)考慮是否進(jìn)行靶向治療，對于IHC診斷為可疑陽性的標(biāo)本可選擇DISH行下一步評價，但為提高檢測HER-2基因的準(zhǔn)確性也可適當(dāng)選擇FISH，但無論是何種檢查方式，操作者都應(yīng)嚴(yán)謹(jǐn)操作、規(guī)范流程。

總而言之，IHC、DISH、FISH均可對乳腺癌患者的HER-2基因狀態(tài)行評估，可以IHC作為篩查手段，若醫(yī)療資源許可應(yīng)當(dāng)結(jié)合DISH檢查結(jié)果制定治療方案。