基于高通量測(cè)序方法研究腌制麻竹筍發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌群落的動(dòng)態(tài)演替

李薇，吳良如，索化夷，張甫生，鄭炯*

1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715)2(國(guó)家林業(yè)局竹子研究開(kāi)發(fā)中心，浙江 杭州，310012)

麻竹筍(Dendrocalamuslatiflorus)是禾本科竹亞科植物的新生芽，富含膳食纖維、氨基酸，蛋白質(zhì)以及竹多糖、抗壞血酸和多酚等功能性物質(zhì)，具有抗氧化、清除血清膽固醇及預(yù)防心血管疾病等生理活性功能[1]。鮮筍的采收季節(jié)性及貯藏過(guò)程中易失水和木質(zhì)化等特點(diǎn)限制了麻竹筍加工產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，而采后加工有利于解決這一產(chǎn)業(yè)瓶頸。腌制麻竹筍加工易，成本低，易于保存，是常用的竹筍加工方法之一[2]。腌制過(guò)程伴隨著由微生物主導(dǎo)的系列生物化學(xué)反應(yīng)，最終形成獨(dú)特的風(fēng)味和較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。因此，了解麻竹筍腌制過(guò)程中的微生態(tài)結(jié)構(gòu)及動(dòng)態(tài)變化對(duì)于其風(fēng)味特征的形成機(jī)制研究具有重要作用。

早期微生物多樣性研究主要采用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)技術(shù)，然而絕大多數(shù)微生物無(wú)法被分離，受到較大限制[3]；而后出現(xiàn)的DNA指紋圖譜、BIOLOG、基因芯片等技術(shù)能夠直接對(duì)環(huán)境中的微生物群落進(jìn)行分析，但僅能靶標(biāo)優(yōu)勢(shì)類(lèi)群，無(wú)法真實(shí)反映微生物的區(qū)系變化規(guī)律[4]。高通量測(cè)序技術(shù)采用邊合成邊測(cè)序的方法，能同時(shí)對(duì)幾百萬(wàn)條DNA分子進(jìn)行測(cè)序，不僅耗時(shí)短、效率高，還具有較高的安全性和準(zhǔn)確性，極大地推進(jìn)了微生物組學(xué)研究[5]。目前高通量測(cè)序技術(shù)已在腌制發(fā)酵蔬菜的微生物多樣性研究中得到廣泛應(yīng)用。YU等[6]采用高通量測(cè)序技術(shù)從四川省6個(gè)地區(qū)采集的泡菜中分離出185株乳酸菌，準(zhǔn)確鑒定出81株植物乳桿菌、38株戊糖乳桿菌和24株短乳桿菌；TANG等[7]應(yīng)用高通量測(cè)序方法比較了重慶和四川兩地區(qū)腌制蘿卜中的優(yōu)勢(shì)菌群差異；LIU等[8]利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)10種發(fā)酵蔬菜的細(xì)菌群落多樣性進(jìn)行了研究，證明了產(chǎn)地、原料種類(lèi)以及發(fā)酵環(huán)境對(duì)細(xì)菌多樣性具有較大影響。

加鹽腌制是發(fā)酵蔬菜的必要環(huán)節(jié)，而食鹽濃度對(duì)腌制麻竹筍中總酸、水分、亞硝酸鹽、VC、總黃酮、Ca2+、Mg2+、果膠含量以及細(xì)菌菌落總數(shù)等均有較大影響，因此對(duì)腌制麻竹筍的品質(zhì)、風(fēng)味的形成以及微生物群落的組成具有至關(guān)重要的作用[9-10]。本課題組前期采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變形梯度凝膠電泳(polymerase chain reaction denatured gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE)技術(shù)分析了不同鹽濃度腌制麻竹筍中的主要優(yōu)勢(shì)菌群[11-12]，但目前還未見(jiàn)系統(tǒng)對(duì)比不同鹽濃度下麻竹筍中菌群動(dòng)態(tài)變化規(guī)律的報(bào)道。因此，本研究擬采用高通量測(cè)序技術(shù)探究不同鹽濃度腌制條件下麻竹筍中菌落的動(dòng)態(tài)演替，進(jìn)一步揭示鹽濃度對(duì)微生物多樣性的影響，從而為探尋微生物群落與腌制麻竹筍的品質(zhì)間的關(guān)系奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

麻竹筍,購(gòu)于重慶市北碚區(qū)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；瓊脂糖凝膠，西班牙biowest公司；聚合酶Fast Pfu Polymerase，北京TransGen公司；DNA純化試劑盒、AxyPrep DNA凝膠提取試劑盒，美國(guó)Axygen公司；土壤基因組提取試劑盒，Omega公司。

1.2 儀器與設(shè)備

YX280A手提式不銹鋼滅菌鍋，上海三申醫(yī)療器械有限公司；Eppendorf 5430R小型離心機(jī)、Eppendorf 5424R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf有限公司；DYY-6C電泳儀，北京市六一儀器廠(chǎng)；BioTek ELx800酶標(biāo)儀，美國(guó)Biotek公司；TBS380微型熒光計(jì)，美國(guó)TurnerBioSystems公司；Covaris M220超聲波破碎儀，基因有限公司；QL-901渦旋混合器，海門(mén)其林貝爾儀器制造有限公司；SW-CJ-1F單人雙面凈化工作臺(tái)，蘇凈凈化設(shè)備有限公司；S1000 Thermal CyclerPCR 擴(kuò)增儀，美國(guó)Biorad 公司；NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)，美國(guó)Thermo Fisher Scientific 有限公司。

1.3 樣品制備

將新鮮竹筍剝殼，切成片狀。然后沸水漂燙10 min、瀝干后將2 kg竹筍裝入泡菜壇，分別向壇中添加5 g/100mL和15 g/100mL的食鹽水，料水比為1∶1(g∶mL)，將壇子密封后在室溫(20～25 ℃)下進(jìn)行自然發(fā)酵。分別在1、3、5、7、10、14、21、28、35、42 d收集發(fā)酵液樣品(5 g/100mL鹽質(zhì)量濃度組編號(hào)為A1、A3、A5、A7、A10、A14、A21、A28、A35、A42；15 g/100mL 鹽質(zhì)量濃度組編號(hào)為B1、B3、B5、B7、B10、B14、B21、B28、B35、B42)，并將樣品在 DNA提取之前儲(chǔ)存在-80 ℃至最后一次取樣完成后統(tǒng)一進(jìn)行DNA提取。

1.4 宏基因組DNA提取及PCR擴(kuò)增

根據(jù)Omega土壤基因組提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行總DNA抽提，對(duì)DNA濃度和純度進(jìn)行檢測(cè)后，利用1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取質(zhì)量。以338F-806R作為引物對(duì)細(xì)菌16S rRNA V3～V4區(qū)序列進(jìn)行擴(kuò)增，用2%的瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物，利用DNA純化試劑盒進(jìn)行純化，用Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測(cè)。使用微型熒光計(jì)對(duì)PCR進(jìn)行檢測(cè)定量。將處理好的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送到上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司采用Illumina Miseq進(jìn)行測(cè)序。

1.5 數(shù)據(jù)與圖譜分析

高通量測(cè)序數(shù)據(jù)用美吉云計(jì)算平臺(tái)進(jìn)行分析。使用UPARSE軟件，根據(jù)97%的相似度對(duì)序列進(jìn)行操作分類(lèi)單元(operational taxonomic units，OTUs)聚類(lèi)，并在聚類(lèi)的過(guò)程中去除單序列和嵌合體。利用RDP(Ribosmal Database Project) classifier對(duì)每條序列進(jìn)行物種分類(lèi)注釋?zhuān)葘?duì)Silva數(shù)據(jù)庫(kù)(SSU123)，設(shè)置比對(duì)閾值為70%。使用RDP細(xì)菌16S rRNA數(shù)據(jù)庫(kù)注釋OTUs序列。

2 結(jié)果與分析

2.1 腌制麻竹筍細(xì)菌OTU分布

OTU與物種呈現(xiàn)對(duì)應(yīng)關(guān)系，可通過(guò)分析OTU分布情況了解樣本中微生物的多樣性與存在量[13]?；?16S rRNA 基因測(cè)序所獲得的細(xì)菌群落OTU維恩圖如圖1所示，共得到2 417個(gè)OTU。不同鹽濃度樣本中OTU分布具有較大差異。部分OTU是兩種鹽濃度樣本所共有的(575例，23.79%)，高鹽質(zhì)量濃度(15 g/100mL)樣本獨(dú)有的OTU數(shù)目為286例(11.83%)，總共持有的OTU數(shù)目為861例，而低鹽質(zhì)量濃度(5 g/100mL)樣本中則有1 556例(64.38%)特異性檢測(cè)，總共持有2 131例OTU，均顯著高于低鹽濃度樣本。

2.2 腌制麻竹筍細(xì)菌α多樣性

Chao指數(shù)反映群落豐富度，Shannon指數(shù)反映群落多樣性[14]。由圖2-a可知，發(fā)酵前28 d不同鹽濃度樣本Chao指數(shù)變化趨勢(shì)均不明顯，集中在250左右，并且均在發(fā)酵第10天達(dá)到最低值，第35天達(dá)到最高值。具體來(lái)看，5 g/100mL鹽質(zhì)量濃度腌制麻竹筍在第35天Chao指數(shù)急速上升至1 372.89，發(fā)酵42 d時(shí)略有下降(1 252.29)；15 g/100mL鹽質(zhì)量濃度樣本在第35天達(dá)到582.46，后又降低至較低水平(171.78)。說(shuō)明發(fā)酵前、中期(28 d及以前)鹽濃度對(duì)腌制麻竹筍細(xì)菌群落豐富度(OTU數(shù)目)影響較小，而高鹽濃度抑制了腌制后期(28～35 d)群落豐富度的增長(zhǎng)，使得成品竹筍(42 d)群落豐富度較低。群落多樣性是群落豐富度及群落均勻度的綜合指標(biāo)[5]。圖2-b顯示，低鹽濃度樣本細(xì)菌群落多樣性波動(dòng)范圍更大，尤其是發(fā)酵第7、21、28天，在群落豐富度差異不大的情況下，5 g/100mL鹽質(zhì)量濃度的Shannon指數(shù)顯著高于15 g/100mL鹽質(zhì)量濃度，說(shuō)明低鹽濃度使得樣本中細(xì)菌群落均勻度更高。15 g/100mL鹽質(zhì)量濃度Shannon指數(shù)維持在較為穩(wěn)定的水平，說(shuō)明高鹽濃度減緩了麻竹筍腌制過(guò)程中細(xì)菌群落的演替。

a-Chao指數(shù)；b-Shannon指數(shù)圖2 不同鹽濃度腌制麻竹筍細(xì)菌群落α多樣性分析Fig.2 α diversity analysis of the bacterial in pickled Ma bamboo shoots with different salt concentration

2.3 腌制麻竹筍細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

細(xì)菌在門(mén)水平上的高通量相對(duì)豐度分布如圖3-a所示。經(jīng)分類(lèi)學(xué)注釋發(fā)現(xiàn)，厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、變形菌門(mén) (Proteobacteria) 和藍(lán)藻細(xì)菌門(mén)(Cyanobacteria)在2種鹽濃度腌制麻竹筍中均是優(yōu)勢(shì)菌門(mén)(平均相對(duì)豐度>1%)，并且同一菌門(mén)在兩類(lèi)樣本中平均相對(duì)豐度較為接近，但分布上有較大差異：低鹽濃度下Firmicutes在腌制第3天就占據(jù)了98.03%的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)地位，卻在腌制第35天降低到22.20%；而高鹽濃度下Firmicutes在腌制第7天才達(dá)到94.46%，但此后相對(duì)豐度一直維持在90%左右；Proteobacteria相對(duì)豐度較高的時(shí)期分別集中在低鹽濃度腌制中、后期(21～42 d)和高鹽濃度腌制前期(1～5 d)；Cyanobacteria在低鹽濃度腌制第1天相對(duì)豐度達(dá)到54.19%，隨著腌制發(fā)酵的進(jìn)行(3～14 d)相對(duì)豐度陡然降低至1%以下，在第35天重新提升至14.80%，高鹽濃度下Cyanobacteria呈現(xiàn)先降低后趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)，在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中相對(duì)豐度均>1%。擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)從第28天迅速上升，在成品竹筍中達(dá)到20.05%，成為低鹽度樣本中的優(yōu)勢(shì)菌屬。2個(gè)鹽度樣本在腌制35 d時(shí)群落結(jié)構(gòu)最豐富，檢測(cè)到的9種主要菌門(mén)均同時(shí)出現(xiàn)，但明顯除Firmicutes外，其余菌門(mén)在低鹽樣本中的相對(duì)豐度均高于高鹽樣本。

從屬水平來(lái)看(圖3-b)，細(xì)菌在2種鹽濃度樣本中的群落結(jié)構(gòu)分布有較大差異。乳酸桿菌屬(Lactobacillus)在低鹽及高鹽樣本中的平均相對(duì)豐度分別為35.39%及54.48%，是絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌屬，在低鹽腌制中呈現(xiàn)逐步增加后迅速降低趨勢(shì)，在高鹽度下呈現(xiàn)迅速增加，并在腌制5～42 d維持在65%左右的水平。5 g/100mL鹽質(zhì)量濃度樣本中，乳球菌屬(Lactococcus)及魏斯氏菌屬(Weissella)的平均相對(duì)豐度分別為15.62%和6.79%，屬于優(yōu)勢(shì)菌屬，但兩者均隨發(fā)酵進(jìn)行相對(duì)豐度逐漸降低，而在高鹽樣本中兩者的平均相對(duì)豐度還不到0.1%；藍(lán)藻細(xì)菌屬(Cyanobacteria_norank)、鹽單胞菌屬(Halomonas)和氣球菌屬(Aerococcus)的平均相對(duì)豐度分別為6.82%、3.86%和2.02%，它們僅集中出現(xiàn)在腌制的某一個(gè)時(shí)期(分別為第1、21、28天)，演替較快。反觀(guān)15 g/100mL鹽質(zhì)量濃度樣本，各主要菌屬的更迭速度平緩，其中包括海細(xì)菌屬(Marinobacterium)，平均相對(duì)豐度為7.14%，活躍在腌制前5 d，此后降低至較低水平；Cyanobacteria_norank(10.95%)，發(fā)酵前3 d相對(duì)豐度>30%，并且在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中相對(duì)豐度都>1%；Aerococcus(17.62%)從發(fā)酵第5天開(kāi)始相對(duì)豐度迅速增加，此后在整個(gè)腌制過(guò)程中均占據(jù)主導(dǎo)地位。腌制第35天2個(gè)鹽濃度樣本菌落多樣性迅速增加，預(yù)示著發(fā)酵進(jìn)入尾聲，其中低鹽濃度樣本的多樣性顯著高于高鹽濃度樣本，并且在前期占主導(dǎo)作用的Lactobacillus、Halomonas、Aerococcus等菌屬的優(yōu)勢(shì)地位被多種新增的相對(duì)豐度較小的菌屬取代，菌屬分布更加均衡，而高鹽濃度樣本中發(fā)揮主導(dǎo)作用的優(yōu)勢(shì)菌屬并未發(fā)生較大變化，與α多樣性結(jié)果一致。

a-門(mén)水平；b-屬水平圖3 不同鹽濃度腌制麻竹筍中細(xì)菌在門(mén)水平 和屬水平的高通量相對(duì)豐度Fig.3 High flux relative abundance of the bacterial at phylum level (a) and genus level (b) in pickled Ma bamboo shoots with different salt concentration注：others為平均相對(duì)<1%的門(mén)或?qū)?/p>

2.4 腌制麻竹筍細(xì)菌聚類(lèi)分析及主成分分析

采用非加權(quán)組平均法(unweighted pair group method with arithmetic mean，UPGMA)構(gòu)建樹(shù)狀結(jié)構(gòu)進(jìn)行層聚類(lèi)分析，樹(shù)枝的長(zhǎng)短可直觀(guān)呈現(xiàn)不同鹽濃度下麻竹筍腌制過(guò)程中群落組成的相似或差異程度。如圖4-a所示，15 g/100mL鹽質(zhì)量濃度樣本細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的遺傳距離較短，而5 g/100mL鹽質(zhì)量濃度下細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)遺傳距離較大，尤其是腌制后期與其他時(shí)期間存在較大差距，說(shuō)明高鹽濃度下細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)演替較為緩慢，相鄰階段細(xì)菌群落組成的相似度較高，而低鹽濃度下細(xì)菌演替激烈，尤其是腌制后期(28～42 d)細(xì)菌群落組成發(fā)生較大變化。由細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)主成分分析圖(圖4-b)可知，PC1軸(53.07%)能夠很好地區(qū)分15 g/100mL鹽質(zhì)量濃度樣本腌制過(guò)程中的細(xì)菌群落，而5 g/100mL鹽質(zhì)量濃度下的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)則更易被PC2軸(18.34%)所區(qū)分。2種鹽濃度樣本點(diǎn)整體距離較遠(yuǎn)，其中5 g/100mL鹽質(zhì)量濃度樣本點(diǎn)集中在一、四象限，15 g/100mL鹽濃度樣本點(diǎn)集中在二、三象限，說(shuō)明2種鹽濃度腌制條件下細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成差異較大。腌制前期樣本點(diǎn)A1、B1和B3分布較為集中，與其他樣本點(diǎn)隔離開(kāi)來(lái)，結(jié)合群落結(jié)構(gòu)分析結(jié)果來(lái)看，低鹽濃度下細(xì)菌區(qū)系在腌制第3天發(fā)生較大變化，而高鹽濃度下細(xì)菌區(qū)系在第5天產(chǎn)生較大改變，2種鹽濃度下發(fā)酵第1天的菌群構(gòu)成相似，均以Cyanobacteria_norank、Marinobacterium、希瓦氏菌屬(Shewanella)為優(yōu)勢(shì)菌屬。另一個(gè)聚集點(diǎn)出現(xiàn)在腌制第21天，其主要原因是Aerococcus菌屬在A21突然涌現(xiàn)，導(dǎo)致A21與B21中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似。

a-聚類(lèi)分析；b-主成分分析圖4 不同鹽濃度腌制麻竹筍中細(xì)菌微生物區(qū)系 UPGMA聚類(lèi)分析和主成分分析Fig.4 UPGMA cluster analysis and principal component analysis of the bacterial in pickled Ma bamboo shoots with different salt concentration

2.5 腌制麻竹筍細(xì)菌進(jìn)化分析

在屬分類(lèi)水平上相對(duì)豐度前25位的微生物發(fā)育進(jìn)化樹(shù)如圖5所示。其中乳酸桿菌屬(Lactobacillus)的發(fā)育進(jìn)化最簡(jiǎn)單，在系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)中獨(dú)占一支，是腌制麻竹筍發(fā)酵過(guò)程中的核心菌群。氣球菌屬(Aerococcus) 與未鑒別的乳桿菌目(unclassified_Lactobacillales)遺傳距離較近，擬桿菌門(mén)(Bacteroidales_S24-7_group)與擬桿菌屬(Bacteroides)遺傳距離較近，屬于同一支，但兩者發(fā)育程度差異較大。未鑒別的消化鏈球菌科(unclassified_Peptostreptococcaceae)與土孢桿菌屬(Terrisporobacter)遺傳距離較近，乳球菌屬(Lactococcus)和腸球菌屬(Enterococcus)遺傳距離較近。隸屬于變形菌門(mén) (Proteobacteria)的幾個(gè)菌屬親緣關(guān)系也較近。右側(cè)柱狀圖顯示，隸屬于厚壁菌門(mén)(Firmicutes)的Lactobacillus、Aerococcus、Lactococcus和魏斯氏菌屬(Weissella)均具有較高占比，其次是隸屬于藍(lán)細(xì)菌門(mén)(Cyanobacteria)的Cyanobacteria_norank，而隸屬于變形菌門(mén) (Proteobacteria)的海細(xì)菌屬(Marinobacterium)和假單胞菌屬(Pseudomonas)等菌屬占比雖較低，但種類(lèi)豐富，因此厚壁菌門(mén)、藍(lán)細(xì)菌門(mén)和變形菌門(mén)是腌制麻竹筍的核心菌門(mén)。其中，Lactococcus、Weissella、鹽單胞菌屬(Halomonas)、unclassified_Peptostreptococcaceae在低鹽濃度樣本中占比顯著高于高鹽濃度樣本，而Lactobacillus、Aerococcus、Cyanobacteria_norank和Marinobacterium則在高鹽濃度樣本中占比更大，正是這些菌屬導(dǎo)致了不同鹽濃度樣本中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異。

3 討論

腌制麻竹筍在不同的發(fā)酵環(huán)境及生產(chǎn)工藝下，微生物的群落結(jié)構(gòu)及演替各異。過(guò)去研究人員采用生理學(xué)試驗(yàn)、高通量測(cè)序和多重PCR等方法對(duì)各類(lèi)腌制發(fā)酵蔬菜中的微生物群落進(jìn)行研究，普遍發(fā)現(xiàn)細(xì)菌，尤其是乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)是參與發(fā)酵過(guò)程的主要菌種[6, 8, 15]。因此，本研究將焦點(diǎn)放在探索腌制發(fā)酵麻竹筍中細(xì)菌群落動(dòng)態(tài)演替及其與發(fā)酵液中鹽濃度的內(nèi)在聯(lián)系上。發(fā)酵第1天2種鹽濃度樣本中LAB的含量均較低，此后其相對(duì)豐度激增，成為群落中的優(yōu)勢(shì)生物。這可能意味著只有微量的LAB才是啟動(dòng)發(fā)酵所必需的，也代表2種鹽濃度下麻竹筍均腌制發(fā)酵成功[16]。在5 g/100mL鹽質(zhì)量濃度樣本中檢測(cè)到的LAB包括乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、乳球菌屬(Lactococcus)、魏斯氏菌屬(Weissella)和微量的明串珠菌屬(Leuconostoc)，而在15 g/100mL鹽質(zhì)量濃度樣本中僅有Lactobacillus一種LAB的平均相對(duì)豐度>1%并發(fā)揮主導(dǎo)作用，側(cè)面反映出Lactococcus、Weissella以及Leuconostoc對(duì)高滲透壓環(huán)境耐受力較差。Lactobacillus是傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜中的典型微生物群落[16]，但本課題組前期采用PCR-DGGE技術(shù)對(duì)6 g/100mL鹽質(zhì)量濃度下腌制麻竹筍研究中僅檢測(cè)到優(yōu)勢(shì)菌屬Lactococcus和Weissella[12]，說(shuō)明Illumina平臺(tái)測(cè)序作為一種靈敏度更高的宏基因組學(xué)研究手段，能有效檢測(cè)到更多細(xì)菌種屬，得到更為準(zhǔn)確的細(xì)菌多樣性研究結(jié)果。

a-系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)(樹(shù)枝的顏色對(duì)應(yīng)菌屬所屬的菌門(mén))；b-菌屬在2種鹽濃度樣本中的Reads占比圖5 不同鹽濃度腌制麻竹筍中細(xì)菌屬水平系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)Fig.5 Phylogenetic tree of the bacterial in pickled Ma bamboo shoots with different salt concentration at genus level

5 g/100mL鹽質(zhì)量濃度樣本發(fā)酵中期(3～14 d)LAB占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)地位，此階段也是整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中雜菌最少的階段，可能是因?yàn)長(zhǎng)AB消耗發(fā)酵環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)搶占其他菌屬的生存空間，并且LAB適應(yīng)環(huán)境后代謝產(chǎn)酸降低發(fā)酵環(huán)境pH值，還能產(chǎn)生細(xì)菌素進(jìn)一步抑制雜菌滋生[17-18]。然而愈加酸化的環(huán)境反過(guò)來(lái)抑制了Lactococcus和Weissella的生長(zhǎng)，使得這2種LAB走向衰亡[19]。此后雜菌數(shù)量迅速增加，在腌制第28天時(shí)，鹽單胞菌屬(Halomonas)替代了Lactobacillus的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)地位，腌制第35天細(xì)菌群落多樣性激增，尤其是擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、螺旋體(Spirochaetae)、梭桿菌門(mén)(Fusobacteria)及一些相對(duì)豐度<1%的雜菌。值得一提的是，15 g/100mL鹽質(zhì)量濃度下僅在發(fā)酵第35天時(shí)細(xì)菌群落多樣性有短暫的增加，后又恢復(fù)到穩(wěn)定水平，說(shuō)明高鹽質(zhì)量濃度能夠有效抑制雜菌生長(zhǎng)，提高腌制麻竹筍的食用安全性。藍(lán)藻細(xì)菌屬(Cyanobacteria_norank)和海細(xì)菌屬(Marinobacterium)在2種鹽濃度樣本的發(fā)酵初期均屬于優(yōu)勢(shì)菌屬，可能對(duì)構(gòu)建發(fā)酵環(huán)境中的微生物菌群結(jié)構(gòu)具有重要作用。Cyanobacteria_norank在15 g/100mL鹽質(zhì)量濃度樣本發(fā)酵過(guò)程中貫穿始終，與Lactobacillus及氣球菌屬(Aerococcus)一起組成了高鹽腌制條件下麻竹筍發(fā)酵達(dá)到穩(wěn)態(tài)時(shí)的主要菌屬。李恒等[20]發(fā)現(xiàn)，Cyanobacteria_norank和Lactobacillus也是達(dá)到穩(wěn)態(tài)的泡菜母水中的主要細(xì)菌屬。Aerococcus為兼性厭氧的革蘭氏陽(yáng)性球菌，模式種為綠色氣球菌(A.viaid-ans)，有研究[21]顯示其能在NaCl質(zhì)量濃度不低于100 g/L的環(huán)境中存活，但顯然15 g/100mL鹽質(zhì)量濃度條件也不能阻礙其生長(zhǎng)。本課題組前期在鹽質(zhì)量濃度為19 g/100mL的腌制麻竹筍中也檢測(cè)到了綠色氣球菌[11]。由此可見(jiàn)，低鹽濃度樣本發(fā)酵過(guò)程以L(fǎng)AB為優(yōu)勢(shì)菌群，發(fā)酵后期LAB消亡，單純依靠發(fā)酵前期LAB產(chǎn)生的有機(jī)酸難以抵抗雜菌滋生；而高鹽濃度樣本則以耐鹽或是抗逆性較強(qiáng)的菌屬為主要菌屬，發(fā)酵過(guò)程中菌群多樣性較低鹽濃度樣本小，但菌群結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，顯著抑制了雜菌滋生。

腌制發(fā)酵蔬菜的品質(zhì)與風(fēng)味特性很大程度上取決于駐留的微生物群落和發(fā)酵條件[8]。LAB對(duì)腌制發(fā)酵成功與否具有決定性作用，它們產(chǎn)生有機(jī)酸、細(xì)菌素、維生素和香氣化合物，這些物質(zhì)能夠有效影響發(fā)酵食品的保質(zhì)期、營(yíng)養(yǎng)成分和感官特性[16]。其中，Leuconosto和Weissella通過(guò)異乳酸發(fā)酵途徑啟動(dòng)發(fā)酵，產(chǎn)生有機(jī)酸、乙醇、乙醛、甘露醇等風(fēng)味物質(zhì)，創(chuàng)造有利于其他乳酸菌生長(zhǎng)的環(huán)境的同時(shí)還能保持蔬菜顏色[22-23]。蔬菜發(fā)酵后酯類(lèi)、醇類(lèi)和醛類(lèi)等揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量的增加則與Lactobacillus等微生物的變化密切相關(guān)[24]。此外，隸屬于變形菌門(mén)(Proteobacteria)的假單胞菌屬(Pseudomonas)豐度的增加也可能是導(dǎo)致腌制竹筍中風(fēng)味化合物產(chǎn)生的原因[25]。然而除Lactobacillus外，其余LAB在15 g/100mL鹽質(zhì)量濃度樣本中相對(duì)豐度均較低，并且Pseudomonas僅在5 g/100mL鹽質(zhì)量濃度樣本發(fā)酵28～35 d有明顯的增殖，間接說(shuō)明低鹽濃度樣本風(fēng)味品質(zhì)可能優(yōu)于高鹽濃度樣本。

4 結(jié)論

本研究采用高通量測(cè)序?qū)? g/100mL和15 g/100mL 2種鹽質(zhì)量濃度腌制條件下麻竹筍發(fā)酵過(guò)程中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究。發(fā)酵前28 d 2種鹽濃度樣本中細(xì)菌群落豐富度差異較小，5 g/100mL鹽質(zhì)量濃度樣本中以乳酸桿菌屬、乳球菌屬和魏斯氏菌屬為優(yōu)勢(shì)菌屬，而15 g/100mL鹽質(zhì)量濃度樣本則以藍(lán)藻細(xì)菌屬、氣球菌屬和乳酸桿菌屬為主要菌屬。發(fā)酵進(jìn)入第35天后，5 g/100mL鹽質(zhì)量濃度樣本中細(xì)菌群落豐富度及多樣性均顯著增加，群落結(jié)構(gòu)發(fā)生較大改變，而15 g/100mL鹽質(zhì)量濃度樣本菌群豐富度小幅增加后迅速恢復(fù)至穩(wěn)定水平，群落結(jié)構(gòu)未發(fā)生較大改變。本實(shí)驗(yàn)僅對(duì)不同鹽濃度腌制條件下麻竹筍發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌群落的動(dòng)態(tài)演替進(jìn)行了鑒定，進(jìn)一步的研究可利用熒光定量-PCR技術(shù)對(duì)不同發(fā)酵期微生物進(jìn)行定量檢測(cè)，與腌制麻竹筍的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，以期為麻竹筍腌制過(guò)程中風(fēng)味形成機(jī)理研究及質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。