微波法酸水解雞肉短肽的研究

黃佳明，張建勝，賈斌，姜寧

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，動(dòng)物科技學(xué)院，大慶 163319；2.黑龍江省九三管局畜牧站）

傳統(tǒng)酸水解法存在樣品受熱不均、操作復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)等缺點(diǎn)，而通過(guò)微波法，可以實(shí)現(xiàn)樣品對(duì)能量的充分吸收而達(dá)到縮短水解時(shí)間的目的，且不會(huì)出現(xiàn)受熱不均等問(wèn)題[1]。其原理是試樣經(jīng)過(guò)酸溶液處理后，再通過(guò)微波加熱，試樣中的蛋白等極性分子可以吸收微波的能量，從而隨著微波頻率的改變發(fā)生著快速的運(yùn)動(dòng)，這些運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致分子間的總能量增加，溫度快速上升。并且，在磁場(chǎng)的作用下，溶液中帶電離子的來(lái)回遷移運(yùn)動(dòng)，加快發(fā)生分子間的撞擊和裂解，同樣也會(huì)引起溫度的改變[2-4]。微波法在眾多領(lǐng)域都有著不俗的應(yīng)用，包括導(dǎo)體材料的制備[6-8]、有機(jī)物的提取[9-12]、DNA 的提取[13-14]、藥物的測(cè)定[15]以及對(duì)化合物的定量分析[16]等。而且微波儀種類(lèi)很多，使用參數(shù)和方法多有不同[17]。試驗(yàn)探究微波功率、酸溶液濃度以及作用時(shí)間對(duì)雞肉蛋白質(zhì)分解的效果，旨在了解微波水解蛋白的技術(shù)，為同類(lèi)研究提供理論參考和實(shí)踐應(yīng)用，也為如何制備短肽提供了一個(gè)新途徑。

1 材料和方法

1.1 雞肉

為黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院飼養(yǎng)的三黃雞雞肉，洗凈、剔肉（去除骨和內(nèi)臟）、絞碎、烘干、磨粉。

1.2 主要試劑儀器

主要試劑：6 mol·L-1HCl：取100 mL 12 mol·L-1的濃鹽酸稀釋成200 mL 溶液。0.01 mol·L-1NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液：使用時(shí)需要進(jìn)行標(biāo)定。中性甲醛溶液：量取50 mL 甲醛于燒杯中，用0.01 mol·L-1NaOH 滴定至中性。丙烯酰胺單體貯液：在燒杯中加入11.1 g 丙烯酰胺，先用35 mL 無(wú)菌水溶解，在加入3 g N，N′-甲叉雙丙烯酰胺，邊加邊攪拌，直到透明為止。用玻璃棒引流到50 mL 容量瓶中，在加入無(wú)菌水到標(biāo)準(zhǔn)線，保存待用。濃縮膠緩沖液：稱(chēng)取6.06 g Tris，加入35 mL 的無(wú)菌水溶解，加入稀釋后的6 mol·L-1HCl 將PH 調(diào)制至6.8 在加無(wú)菌水定容至50 mL。分離膠緩沖液貯液：稱(chēng)取9.08 g Tris，加入無(wú)菌水10 mL，加入0.01 mol·L-1NaOH 溶液攪拌，使溶劑溶解并調(diào)節(jié)溶液的PH 至8.8，再加無(wú)菌水定容至50 mL。

主要儀器：梅特勒-托利多DELTA-320-PH 計(jì)，真空干燥箱，電熱恒溫水浴鍋，電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，TGL-16G 離心機(jī)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，電泳儀，電泳槽，水平搖床，XT-9900 智能微波消解儀。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)以鹽酸溶液為介質(zhì)，探究以波功率、鹽酸濃度、水解時(shí)間為主要因素對(duì)雞肉粉水解成短肽的影響，實(shí)驗(yàn)采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，方案如下表1。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案Table 1 Orthogonal test design scheme

1.3.2 雞肉的預(yù)處理流程

新鮮雞肉→清洗→絞碎→烘干→脂肪抽提→自然風(fēng)干24 h→制粉

1.3.3 雞肉蛋白的水解

準(zhǔn)確稱(chēng)取0.03 g 雞肉粉置于酵解罐中，按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)分別加入2、3、4 mol·L-1HCl 各6 mL。然后將內(nèi)罐置于外罐之中，關(guān)閉相應(yīng)的閥門(mén)，確保罐內(nèi)處密閉狀態(tài)，并在罐內(nèi)充氮?dú)?0 s，打開(kāi)微波儀解旋儀，進(jìn)行功率和加熱時(shí)間的基本設(shè)定，設(shè)定完成后，進(jìn)行水解實(shí)驗(yàn)，待水解完畢后關(guān)閉儀器將內(nèi)罐取出稍加冷卻，水解物移出，吸取該溶液1 mL 于小燒杯中，在真空干燥箱中揮酸，制樣分析。

1.3.4 水解度的測(cè)定

-NH2 的測(cè)定：取揮酸后的水解產(chǎn)物出1 mL 于燒杯中，加入2 mL 無(wú)菌水，用0.01 mol·L-1NaOH 溶液調(diào)節(jié)溶液PH 至8.2，加入1 mL 中性甲醛溶液，搖勻并放置10 min 。用0.01 mol·L-1NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定該蛋白水解液至PH 為9.2，記錄所用NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積，計(jì)算-NH2 的含量（μmol·L-1）[18]。

清液中的總氮量測(cè)定：稱(chēng)取0.03 g 雞肉蛋白于消化管中，加入配好的催化劑，再加入10 mL 配好的硫酸混合均勻，放在消煮爐上加熱大約1 h 后，將溫度調(diào)到410 ℃繼續(xù)煮，直至溶液變成翠綠色，停止加熱，冷卻至室溫。將消化好的樣品轉(zhuǎn)移到100 mL 容量瓶中定容，將定容好的溶液用凱式定氮儀進(jìn)行氮含量的測(cè)定。

1.3.5 SDS-PAGE

實(shí)驗(yàn)采用SDS-PAGE 凝膠電泳對(duì)水解產(chǎn)物的分子量進(jìn)行分析，以水解度達(dá)50%左右為判斷依據(jù)，選擇合適溫度和水解時(shí)間內(nèi)的水解物進(jìn)行電泳。下表2為SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳濃縮膠和分離膠的配制配方。

表2 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳配制配方Table 2 SDS-polyacrylamide gel electrophoresis formulation

1.3.5.1 樣品的準(zhǔn)備

將揮酸完畢的水解液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中，在60 ℃水浴下蒸干，用蒸餾水重復(fù)洗滌3 次以備電泳使用。

1.3.5.2 制膠

按配方在10 mL 的Ep 管中進(jìn)行凝膠的配制，在凝膠模具中迅速灌入所配制的凝膠。注意先灌注分離膠，完成后在分離膠表面加一層無(wú)菌水，一方面是為了將膠面封住，另一方面是為了使膠面保持水平。將凝膠在室溫靜置，當(dāng)膠面與水面之間出現(xiàn)了一個(gè)清晰的界面時(shí)，證明凝膠配制已完成。倒掉上層無(wú)菌水，用干凈濾紙吸掉多水分，最后加入配制好的濃縮膠，灌膠完成后應(yīng)快速插入梳子，以防止凝膠凝固。

1.3.5.3 加樣

加樣前緩緩拔起梳子，加無(wú)菌水沖洗，應(yīng)盡量小心防止損壞凝膠。洗滌完成后用干凈的濾紙吸干多余水分，并防止氣泡陷入。將制備好的樣品配成10 mol·L-1的溶液與樣品緩沖液在100 ℃下煮5～10 min，蛋白maker 在使用前100 ℃水浴加熱5～10 min。加樣前應(yīng)仔細(xì)檢查加樣孔，看加樣孔中是否存在電極緩沖液，然后用移液槍進(jìn)行加樣，注意緩慢進(jìn)行防止條帶出現(xiàn)氣泡。

1.3.5.4 電泳

在電泳槽的外槽中加入陽(yáng)極緩沖液，將凝膠放入電泳槽中，在內(nèi)槽中注入陰極緩沖液，將處理好的樣品加入點(diǎn)樣孔，蓋上蓋子，連接電源。起始電壓設(shè)置為60 V，大約2~3 h，當(dāng)看到樣品移動(dòng)到分離膠與濃縮膠之間的明顯分界線時(shí)，將電壓改為100 V，待maker 完全跑開(kāi)后（此過(guò)程大約4~6 h），切斷電源，將含有樣品的凝膠取出，進(jìn)行下一步的考馬斯亮藍(lán)染色準(zhǔn)備。

1.3.5.5 染色

電泳結(jié)束后，帶上朔膠手套，從電泳槽中拿出凝膠模具，利用相應(yīng)的工具輕輕撬開(kāi)玻璃板，用無(wú)菌水簡(jiǎn)單沖洗，沖洗完成后將凝膠玻璃板取下，將濃縮膠切掉，分離膠放入考馬斯亮藍(lán)染色液中，放在微波爐中煮沸1～2 min，用無(wú)菌水沖洗干凈后放在自動(dòng)振蕩器中慢慢搖動(dòng)，染色10～20 min。染色完成后將凝膠取出，用無(wú)菌水沖洗干凈，倒入脫色液，在自動(dòng)振蕩器中過(guò)夜脫色。最后將脫色完成后的凝膠用清水沖洗，在凝膠成像系統(tǒng)中進(jìn)行分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

1.4.1 水解度計(jì)算[19]

清液中氨基氮量的計(jì)算 N-NH2=CNaOH×VNaOH

雞肉中的含氮量按照凱氏定氮法檢測(cè)公式進(jìn)行計(jì)算。

1.4.2 水解度的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)計(jì)采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)、用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的極差法進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 鹽酸濃度、功率、時(shí)間對(duì)雞肉粉水解度影響

鹽酸濃度、功率、時(shí)間對(duì)雞肉粉水解度影響見(jiàn)表3，水解度的大小表明了蛋白水解成游離氨基酸的程度，在因素A 三個(gè)水平中取k3 時(shí)雞肉蛋白水解度最高，在因素B 中取k3 時(shí)水解度最高，在因素C 中取k2 時(shí)水解度最高。所以綜合看來(lái)因素A3 B3 C2 的組合能較好的提高雞肉蛋白的水解度，即鹽酸濃度4 mol·L-1、微波功率900 W、水解時(shí)間160 s，在這種組合下水解度高達(dá)95.24%。但水解度并不是越大越好，水解度過(guò)大說(shuō)明蛋白幾乎全部水解為游離的氨基酸，而得不到所需的蛋白肽。極差R 反應(yīng)了各因素水平變動(dòng)時(shí)測(cè)定指標(biāo)的變動(dòng)情況。極差值越大代表指標(biāo)隨水平的變動(dòng)越大，也就是該因素對(duì)指標(biāo)的影響越大。所以從極差R 值分析來(lái)看，因素A 對(duì)雞肉蛋白水解度影響最大，其次是因素B，最后時(shí)為因素C。

表3 鹽酸濃度、功率、時(shí)間對(duì)雞肉粉水解度影響Table 3 Effect of hydrochloric acid concentration，power and time on hydrolysis degree of chicken meal

圖1 微波法酸水解雞肉SDS-PAGE 分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of chicken by microwave acid hydrolysis

2.2 微波法酸水解雞肉蛋白SDS-PAGE 分析

經(jīng)過(guò)SDS-PAGE 分析，我們發(fā)現(xiàn)用HCl 水解雞肉蛋白所得多肽的分子量可以通過(guò)SDS-PAGE 進(jìn)行分離鑒定。結(jié)果表明，在2 mol·L-1HCl、功率為500 W條件下水解80 s，可得到分子量小于14.4 KD 的短肽，而其他的參數(shù)設(shè)置并沒(méi)有檢測(cè)到短肽的產(chǎn)生，說(shuō)明雞肉的酸水解有著極高的環(huán)境要求，不同的環(huán)境參數(shù)改變會(huì)對(duì)試驗(yàn)產(chǎn)生很重要的影響。通過(guò)試驗(yàn)，也可發(fā)現(xiàn)酸水解肽段隨水解時(shí)間的延長(zhǎng)而變短，故用SDS-PAGE 分離鑒定短肽時(shí)，分離效率隨水解時(shí)間延長(zhǎng)而降低。

圖2 微波法酸水解雞肉SDS-PAGE 分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of chicken by microwave acid hydrolysis

在2 moloL-1HCl、功率為500 W 條件下水解80 s時(shí)得到的水解短肽進(jìn)行SDS-PAGE 分析，得到如下結(jié)果。在5.8 kd 處出現(xiàn)明顯條帶，表明在該條件下可以成功制得5.8 kd 左右的短肽。

3 討論

微波法是目前在水解不同物質(zhì)方面去常用的一種輔助方法，而且都取得了很好的效果。DNA 堿基組成、DNA 加合物及其一級(jí)結(jié)構(gòu)修飾的研究是不同科學(xué)研究領(lǐng)域都感興趣的課題。雖然已有多種方法用于DNA 分析，但DNA 水解過(guò)程往往是一個(gè)限速步驟。使用常規(guī)酶水解至少需要6~17 h 才能完成。Chilakala Sujatha 等[20]，首次使用微波技術(shù)開(kāi)發(fā)了一種加速DNA 酶解的方法，研究了微波輔助酶解脫氧核糖核酸的作用，比較了微波消解與常規(guī)酶解樣品的通過(guò)率和回收率。發(fā)現(xiàn)僅用30 min 即可獲得與常規(guī)酶解相近的酶解效果，水解率為≥90%。在酸水解的輔助中也有許多的應(yīng)用，HeYanli 等[21]，采用微波酸水解法研究了多糖水解釋放單糖的過(guò)程，研究表明與傳統(tǒng)水解法相比該法是分析酸性、堿性和中性多糖單糖組成的有效方法，特別適用于殼聚糖、肝素和硫酸軟骨素等難以完全水解的多糖。Tasakis Rafail Nikolaos 等[22]通過(guò)采用微波輔助酸水解與高效液相色譜和生物信息學(xué)相結(jié)合的方法，對(duì)乳酸乳球菌分泌的抗菌肽-細(xì)菌素進(jìn)行鑒定的過(guò)程。說(shuō)明該方法可以促進(jìn)新細(xì)菌素的發(fā)現(xiàn)，不僅可以為肽的氨基酸含量提供有用的信息，還可以為蛋白質(zhì)生物學(xué)的進(jìn)化提供有用的信息。對(duì)乳酸益生菌分泌的8 種細(xì)菌素進(jìn)行圖形摘要鑒定，經(jīng)過(guò)微波輔助酸解以及高效液相色譜對(duì)每個(gè)樣品的氨基酸含量進(jìn)行了鑒定。

試驗(yàn)采用微波酸水解的方法來(lái)水解雞肉制備短肽，并進(jìn)行優(yōu)化驗(yàn)證。研究表明隨著微波水解時(shí)間的延長(zhǎng)，雞肉粉水解度會(huì)逐漸提高。但是經(jīng)過(guò)一段時(shí)間，水解度的增加不是明顯，原因可能是因?yàn)樗獬跏茧A段，微波首先破壞了雞肉細(xì)胞的細(xì)胞膜，導(dǎo)致了氨基酸的大量外流，產(chǎn)物迅速積累，所以初始時(shí)水解效率好，但隨著時(shí)間的進(jìn)行產(chǎn)物累積至最大濃度，氨基酸的流出處于平衡，導(dǎo)致了水解度的降低。當(dāng)微波水解時(shí)間超過(guò)160 s 后，肌肉細(xì)胞被完全破碎，內(nèi)部的其他物質(zhì)也暴露出來(lái)，導(dǎo)致氨基酸的溶解無(wú)明顯增加。微波功率對(duì)水解度的影響不顯著，但微波功率的改變，會(huì)對(duì)水解度有著一定程度的影響，但增幅不大?？赡艿脑蚴俏⒉ㄝ椛涔β实母淖?，導(dǎo)致微波能量發(fā)生變化，雞肉粉吸收的微波能也相應(yīng)發(fā)生改變，雞肉粉的溫度發(fā)生變化，雞肉細(xì)胞遭到破壞，溶液中粒子擴(kuò)散速度也相繼發(fā)生改變，影響了雞肉粉的水解。試驗(yàn)的研究表明，但當(dāng)功率超過(guò)900 W 時(shí)，水解度的提高不在明顯，達(dá)到了一定的閾值。酸溶液濃度大小對(duì)水解反應(yīng)有著重要的影響，研究也表明，酸濃度的大小是影響雞肉粉水解度的主要因素。鹽酸可以破壞蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，逐漸降解成游離氨基酸。酸濃度設(shè)置的太小，會(huì)導(dǎo)致蛋白的水解不充分，不能很好的被利用；而酸濃度設(shè)置的太大，會(huì)導(dǎo)致雞肉粉蛋白的效率高，但可能得不到短肽，都會(huì)轉(zhuǎn)化成游離的氨基酸。從試驗(yàn)結(jié)果看，試驗(yàn)使用的微波儀效果非常明顯，能使雞肉粉的水解率達(dá)到90%以上，不僅可以降低酸的濃度還可以提高水解效率。但試驗(yàn)的初衷并不是要進(jìn)行肌肉水解度的研究，而是要進(jìn)行水解成短肽的研究，試驗(yàn)雖然取得了一定的效果，但是也只得到了一個(gè)5.8 KD左右的短肽，說(shuō)明水解度過(guò)大會(huì)影響短肽的生產(chǎn)，試驗(yàn)結(jié)果表明，在水解度到35%時(shí)已經(jīng)看不到蛋白，但在22%可以看到5.8 KD 的肽，那說(shuō)明當(dāng)水解度大于35%時(shí)蛋白就已經(jīng)完全水解成小肽或游離氨基酸，如果以35%的水解度為最大的水解度，重新設(shè)計(jì)試驗(yàn)，以2 mol·L-1的鹽酸濃度為最大的酸濃度，500 W 的功率為最大的微波功率，將會(huì)得到大于5.8 KD 或小于5.8 KD 的小肽。與傳統(tǒng)的酸水解方法相比試驗(yàn)明顯提搞了水解效率并且降低了酸濃度的使用量。劉曉[21]采用酸水解的方法進(jìn)行甲殼低聚糖的水解試驗(yàn)，結(jié)果表明，酸濃度的使用量在4 mol·L-1時(shí)是最優(yōu)的，并且酸水解的時(shí)間用了72 h。而試驗(yàn)在微波儀的幫助下水解的時(shí)間僅用幾分鐘，在時(shí)間上得到了大大的提升，避免了時(shí)間上的浪費(fèi)，而且能達(dá)到同樣的效果。在酸濃度的使用量上，實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明2 mol·L-1的酸濃度并不一定是最優(yōu)的酸濃度，有可能使用量的濃度要求更低。

研究的不足表現(xiàn)在試驗(yàn)方案的設(shè)計(jì)上，導(dǎo)致只水解得到了一個(gè)分子量約為5.8 KD 短肽，如果將酸濃度、微波功率的數(shù)值設(shè)計(jì)梯度大一點(diǎn)，可能會(huì)取得更好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。但從試驗(yàn)的結(jié)果也可以為微波酸水解法在提取蛋白肽或則時(shí)提取單糖時(shí)提供一個(gè)很好的參考依據(jù)。

4 結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明：利用微波輔助酸水解雞肉蛋白可得到分子量約為5.8 KD 的短肽。但也發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)得到的結(jié)果并不是最優(yōu)結(jié)果，重新調(diào)整酸濃度和微波功率，可以得到更多的理想肽。試驗(yàn)方法證明了微波法的可行性，與傳統(tǒng)酸水解法相比，有著更為顯著的作用效果。