雌激素通過氯通道影響骨質(zhì)疏松的研究進展

方煥坤 鄧志欽 段莉 李文翠 王大平*

1.汕頭大學醫(yī)學院，廣東 汕頭 515041

2.深圳市第二人民醫(yī)院骨科，廣東 深圳 518035

1 成骨細胞-破骨細胞代謝平衡與骨質(zhì)疏松

1.1 骨質(zhì)疏松癥的定義和流行病調(diào)查情況

2001年，美國國立衛(wèi)生研究院骨質(zhì)疏松委員會發(fā)表了一份骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)共識的定義：骨質(zhì)疏松癥為骨骼生長失調(diào)，有損害骨骼強度且誘發(fā)骨折風險的疾病，其典型特征是骨皮質(zhì)變薄、骨小梁之間失去連接[1]。世界衛(wèi)生組織定義骨質(zhì)疏松癥為一種全身代謝性骨病，其特點是當骨量減少和骨組織的微細結(jié)構(gòu)受損時，骨的脆性增加，易于發(fā)生骨折。國際骨質(zhì)疏松基金會預測絕經(jīng)后女性中約有1/3罹患骨折，而50歲以上的男性約有1/5罹患骨折[2]。隨著人口老齡化的加劇，骨質(zhì)疏松癥已逐漸成為50歲以上群體的一個全球性健康問題，我國老年人比例不斷上升，骨質(zhì)疏松癥已經(jīng)成為社會面臨的嚴重挑戰(zhàn)[3]。我國50歲以上人群骨質(zhì)疏松癥患病率為女性20.7%，男性14.4%，且骨質(zhì)疏松性骨折發(fā)病率也逐年攀升，女性高達24.43%，男性達15.58%[4]。骨質(zhì)疏松癥患者結(jié)局常常是脆性骨折甚至殘疾，這都將給家庭及社會帶來巨大的經(jīng)濟負擔，且在接下來幾十年中形勢愈加嚴峻。據(jù)統(tǒng)計，2010年約有233萬例骨質(zhì)疏松性骨折發(fā)生，花費9.45億美元。女性骨折的發(fā)生率約為男性骨折的3倍，占總費用的76%，到2035年，骨質(zhì)疏松癥相關(guān)骨折的年數(shù)量和費用將翻一番，到2050年將增加到599萬例骨折，花費254.3億美元[5]。由此看出，骨質(zhì)疏松癥已經(jīng)成為我國50歲以上人群的重要健康問題，中老年女性骨質(zhì)疏松問題尤為嚴重。

1.2 成骨細胞-破骨細胞代謝平衡與骨質(zhì)疏松

成骨細胞(osteoblast，OB)和破骨細胞(osteoclast，OC)是骨重塑過程中的兩種主要細胞，協(xié)調(diào)OB與OC的生成與活性，能平衡骨的吸收與形成過程。已有研究表明，成骨細胞和破骨細胞可以通過直接的細胞-細胞接觸、細胞因子和細胞外基質(zhì)相互作用、相互溝通。成骨細胞可通過多種途徑影響破骨細胞的形成、分化或凋亡，如OPG/RANKL/RA[6]。一旦上述骨吸收和骨形成之間的動態(tài)平衡被破壞，如女性更年期，骨量逐漸減少就會表現(xiàn)出來，骨骼內(nèi)部結(jié)構(gòu)空隙增加、骨骼機械強度漸進性減弱，最終導致骨折的易發(fā)[7]。

2 雌激素對骨質(zhì)疏松的影響

2.1 雌激素對骨質(zhì)疏松或絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的影響

雌激素調(diào)節(jié)成骨細胞和破骨細胞的活動，在調(diào)節(jié)骨代謝中起重要作用。絕經(jīng)后，雌激素缺乏，抑制骨形成，使得骨髓擴張和骨內(nèi)膜吸收導致骨丟失，骨強度降低[8]。研究表明，雌激素對維持骨吸收和骨形成的平衡具有著極其重要的作用，雌激素可以促進破骨細胞凋亡，從而抑制骨吸收，但這種促凋亡作用的分子機制尚不清楚。此外，雌激素抑制成骨細胞產(chǎn)生破骨細胞分化因子，并通過這種間接機制抑制破骨細胞的形成和骨吸收[9]。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)又稱原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥(Ⅰ型骨質(zhì)疏松)，是對老年婦女健康危害很大的常見病和多發(fā)病。其發(fā)病機制與雌激素耗竭有關(guān)，隨著年齡增長，雌激素耗竭會導致骨質(zhì)流失加重。這種骨骼疾病模式包括普遍存在的骨小梁丟失和穿孔，使得椎體和橈骨遠端這類松質(zhì)骨骨折風險增高[8]。雌激素可減少更年期引起的骨代謝加速，并可防止全身各骨骼部位的骨丟失。系統(tǒng)口服或經(jīng)皮雌激素治療(estrogen therapy，ET)或雌激素加黃體酮治療(estrogen plus progestin therapy，EPT)對婦女保護的有益影響已被確立。不幸的是，雌激素治療增加了子宮內(nèi)膜癌、中風、冠心病(coronary heart disease，CHD)和凝血栓塞事件的風險[10]。Kyunghee等[11]研究發(fā)現(xiàn)，RANKL通過誘導ERK1和ERK2磷酸化，促進破骨細胞分化。實驗表明，雌激素下降與OPG/RANKL比值升高有關(guān)，雌激素在絕經(jīng)早期通過OPG/RANKL途徑抑制破骨細胞，從而改善骨丟失，且隨著雌激素劑量的增加，局部骨血管的形成增加，提示雌激素可能通過血管生成影響骨質(zhì)疏松癥[12]。此外，腫瘤壞死因子α(TNF-α)在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機制中起著重要作用，它可以抑制間充質(zhì)干細胞(MSC)成骨分化從而導致骨形成受損[13]。雌激素存在時，可促進成骨細胞周期進程加速細胞增殖，有報道指出雌激素可影響大鼠成骨細胞分泌生長因子-β(TGF-β)及類胰島素生長因子-I(IGF-I)，TGF-β調(diào)節(jié)早期骨髓基質(zhì)細胞向成熟成骨細胞分化，IGF-I信號是生長激素誘導骨生長的主要介質(zhì)，IGF-I和配體-受體(efn Eph)信號轉(zhuǎn)導相互作用，調(diào)節(jié)骨骼生長和維持[14-15]。另外，酪氨酸激酶-2 (Pyk2)對骨形成具有重要作用，缺乏Pyk2的雌鼠(Pyk2-ko)骨量增加，骨形成率增加，pyk2的缺失使雌激素刺激OB的分化和礦化[16]。

2.2 雌激素受體在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥中的作用

雌激素受體(ER)介導大部分的雌激素反應(yīng)，ER屬甾體激素類超家族成員，是一類與配體結(jié)合激活的核轉(zhuǎn)錄因子。經(jīng)典的ER信號轉(zhuǎn)導途徑：雌激素通過直接與核內(nèi)雌激素α或β受體結(jié)合，直接激活下游靶基因的活化。雌激素α和β受體(ERα和ERβ)在成骨細胞和破骨細胞均有表達，提示雌激素可通過結(jié)合表達在成骨細胞和破骨細胞上的受體從而發(fā)揮作用[17]。ERα在成骨細胞祖細胞中可通過調(diào)節(jié)骨膜骨形成的增加起關(guān)鍵作用。此外，ERα可刺激成骨細胞的信號維持松質(zhì)骨骨量。但目前，ERα信號在成熟成骨細胞保持松質(zhì)骨質(zhì)量的分子機制仍不清楚[9]。

3 氯離子通道在調(diào)節(jié)成骨細胞中的重要作用和機制

3.1 氯通道的一般生理功能及在調(diào)節(jié)骨形成中的作用

氯離子具有重要的生物學功能，是機體內(nèi)環(huán)境含量最豐富的陰離子。氯通道細分為5個氯離子通道家族：配體門控陰離子通道、CFTR、ClCs、bestrophins和anoctamins[18]。ClC-3氯離子通道是一種電壓門控型離子通道，在哺乳動物細胞中廣泛表達，其作用主要有維持細胞體積平衡、調(diào)節(jié)細胞興奮性、離子穩(wěn)態(tài)、溶酶體酸化和跨膜轉(zhuǎn)運相關(guān)。破骨細胞通過質(zhì)子泵分泌氫離子，氯離子通過靠近鈣化骨的底面細胞膜上的氯離子通道，溶解骨中的礦物質(zhì)，而且ClC-3可通過成骨細胞促進新骨的生長[19]。氯離子交換器ClC-3和ClC-5在活性成骨細胞的表面高表達[20]。盧曉琳等[21]通過研究不同ClC-3氯離子通道表達水平對成骨相關(guān)基因的影響表明，成骨細胞中ClC-3氯離子通道的表達有助于成骨細胞對PTH的刺激，從而介導成骨細胞的分化[21]。ClC-3氯通道蛋白表達水平增加，可以上調(diào)下游Runx2基因表達，從而促進成骨分化[22]。此外，Cl--H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白ClC-3和ClC-5還能驅(qū)動成骨細胞的礦化和調(diào)節(jié)精細骨結(jié)構(gòu)[23]。有研究表明，C1C-3過表達導致小鼠的皮質(zhì)骨和松質(zhì)骨骨量減少，骨結(jié)構(gòu)變差，提示C1C-3可能參與了骨形成或骨吸收[24]。沒有ClC-3和ClC-5，成骨細胞無法在體外礦化，Clcn3/Clcn5雙基因敲除對動物來說可能是致命的[25]。

3.2 氯離子通道蛋白在骨形成信號調(diào)節(jié)通路中的作用

Brum等[26]研究發(fā)現(xiàn)，在成骨細胞分化過程中人類間充質(zhì)干細胞(hMSCs)CLIC3基因表達強烈上調(diào)，而脂肪細胞中的CLIC3表達下降，與成骨細胞的表達相反。當利用慢病毒轉(zhuǎn)導使間充質(zhì)干細胞CLIC3過表達后導致基質(zhì)礦化增加60%，而敲除CLIC3基因后細胞基質(zhì)礦化降低了78%～88%。

4 氯離子通道在調(diào)節(jié)破骨細胞中的重要作用和機制

骨骼也是時刻都在進行著物質(zhì)代謝，成骨細胞和破骨細胞是骨骼不斷新陳代謝的基礎(chǔ)。正常生理條件下，破骨細胞與成骨細胞相互協(xié)調(diào)，通過蝕骨和成骨的動態(tài)平衡機制，維持著骨骼的正常代謝和機體的正常運作。RANKL是腫瘤壞死因子(TNF)超家族成員之一，由成骨細胞和骨細胞表達。RANKL的受體RANK存在于破骨細胞和破骨細胞前體上，當RANKL與RANK結(jié)合時，破骨細胞分化被激活[27]。骨細胞還分泌RANKL誘餌受體骨保護素(OPG)，OPG結(jié)合RANKL與RANK競爭，從而抑制破骨細胞分化[28]。OPG/RANKL比值受雌激素調(diào)節(jié)，其比值下降可側(cè)面增強RANKL-RANK的相互作用，RANKL刺激破骨細胞前體退出細胞周期并最終分化，所以雌激素水平下降破骨細胞被大量活化[29]。氯通道的開放是破骨細胞骨吸收的關(guān)鍵步驟。當破骨細胞被活化，活化后的破骨細胞會貼附靠近在骨骼表面，大量聚集質(zhì)子泵和氯通道，當質(zhì)子泵與氯通道被激活時，則大量分泌 HCl至吸收腔面，調(diào)節(jié)骨吸收[30]。

5 雌激素、雌激素受體和氯離子通道在骨代謝中的作用

近年研究發(fā)現(xiàn)雌激素通過受體依賴性或非受體依賴性兩種方式作用于離子通道。成骨細胞的成骨功能也受雌激素的調(diào)節(jié)。有研究表明，當成骨細胞中I型電壓門控型鈣離子通道被激活后，可以減少卵巢切除(ovx)骨質(zhì)疏松小鼠模型中的骨丟失；在使用鈣通道阻滯劑后，成骨細胞標志物的轉(zhuǎn)錄顯著下降，表明信號通過內(nèi)源性鈣離子通道調(diào)節(jié)骨形成[31]。鈣通道的表達可增強骨小梁的生長，防止雌激素缺乏引起的骨丟失。雌激素與離子通道在細胞功能表達上關(guān)系密切，其中氯離子通道是雌激素調(diào)控細胞功能的重要途徑。ClC-3已被證實參與細胞遷移，雌激素可激活ClC-3基因的表達，促進其翻譯，促進細胞生長[32]。ClC家族中的Cl-通道在成骨細胞中表達并且與骨生理學和病理學相關(guān)，通過研究雌激素對MC3T3-E1成骨細胞氯通道的作用，發(fā)現(xiàn)17β-雌二醇可誘導成骨細胞產(chǎn)生一個氯電流，且該電流可被雌激素受體拮抗劑所抑制，雌激素可通過細胞膜表面的ERα激活氯通道，表明ClC-3氯通道可能是雌激素調(diào)控成骨細胞活性的靶點之一[33]。另外，17β雌二醇可提高I型膠原蛋白表達和堿性磷酸酶活性，促進氯通道蛋白表達；當使用氯通道阻滯劑沉默氯離子通道表達后，阻止了成骨細胞分化，提示雌激素可通過激活ClC-3氯離子通道調(diào)節(jié)骨形成，增強成骨細胞的成骨分化[34]。

6 Wnt信號通路

在生理條件下，成骨和破骨在多種細胞參與和信號途徑調(diào)解下達到動態(tài)平衡。Wnt配體通過β-連環(huán)蛋白依賴性和非依賴性信號傳導在各種器官的發(fā)育和穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮核心作用。自從發(fā)現(xiàn)低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5(Lrp5)基因突變與人類交替之間的因果關(guān)系以來，Wnt/β-catenin信號在骨量中的關(guān)鍵作用已經(jīng)通過大量研究確定。Wnt蛋白在細胞分化前可抑制成骨細胞前體細胞的凋亡，從而促進間充質(zhì)干細胞向成骨細胞的分化[35]。Wnt/β-連環(huán)蛋白信號傳導的激活誘導促進成骨細胞分化的轉(zhuǎn)錄因子osterix的表達。此外，該信號傳導誘導骨保護素的表達，骨保護素是成骨細胞譜系細胞中的破骨細胞抑制因子，以防止骨吸收。Wnt信號對正常骨形成是必不可少的。Wnt受體Lrp5的失活突變導致骨質(zhì)疏松性假性膠質(zhì)瘤，而激活突變導致高骨量。Wnt1功能缺失突變可導致成骨不全和早發(fā)型骨質(zhì)疏松癥。實驗表明Wnt1是破骨細胞進行骨吸收的來源之一，且Wnt1可能有助于成骨細胞分化與骨吸收位點的耦合[36]。最近的研究也表明，Wnt5a可增強破骨細胞的形成。相反，Wnt16通過β-連環(huán)蛋白非依賴性信號傳導抑制破骨細胞形成[37]。成骨細胞及其前體、骨細胞和破骨細胞能夠分泌各種Wnt配體，參與骨重建，Wnt /β-catenin信號通路直接提高成骨細胞分化和骨形成，而間接地抑制破骨細胞分化和骨吸收，Wnt通路的激活還會導致細胞外基質(zhì)成分如纖維連接蛋白或膠原的分泌增加，這些成分可以改變骨生化和結(jié)構(gòu)特性[38]。Wnt信號通路對骨調(diào)節(jié)發(fā)揮著重要的作用，但其分子機制目前尚不清楚，可能與氯通道開放有關(guān)。

綜上所述，骨質(zhì)疏松癥是一類常見的代謝性疾病，在人群的發(fā)病率逐年上升，尤其是面臨絕經(jīng)期的中老年女性，嚴重影響社會經(jīng)濟及健康。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松是老年女性常見病，目前仍然沒有改善絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松癥的安全有效的藥物。雌激素調(diào)節(jié)成骨細胞和破骨細胞的活動，在調(diào)節(jié)骨代謝中起重要作用，而氯離子通道與骨代謝密切相關(guān)，不僅可以通過破骨細胞溶解骨中的礦物質(zhì)，調(diào)節(jié)骨吸收，而且通過成骨細胞促進新骨的生長。雌激素可激活成骨細胞的氯電流，促進破骨細胞凋亡，雌激素與氯離子通道的相關(guān)機制可能是：雌激素通過細胞表面雌激素受體，激活氯通道，通過Wnt信號途徑，抑制破骨細胞形成并促進成骨細胞表達，從而調(diào)節(jié)骨代謝。但Wnt信號途徑如何影響骨調(diào)節(jié)，其分子機制尚不清楚，有待進一步的科學研究。通過研究及探討氯通道調(diào)控骨形成的機制，有望為離子通道型抗骨質(zhì)疏松癥藥物的研發(fā)提供理論基礎(chǔ)，研發(fā)新型抗骨質(zhì)疏松藥物。