ctDNA 在結直腸癌診療中的應用

劉 莉 蔣 萍 戈 偉

泰康同濟（武漢）醫(yī)院腫瘤科，湖北武漢 430050

結直腸癌是常見的消化系統(tǒng)腫瘤之一，由于結直腸癌起病隱匿，早期癥狀不明顯且不典型，缺乏特異性，有時與其他消化系統(tǒng)疾病共存，因此結直腸癌發(fā)現(xiàn)時多為中晚期，部分患者出現(xiàn)轉移灶。而目前臨床上，結直腸癌的早期篩查往往依賴于糞便隱血試驗（fecal occult blood test，F(xiàn)OBT），缺乏靈敏度和特異性，容易導致漏檢和過度檢測，臨床中急需開發(fā)高特異性的篩查方法[1]。同時，結直腸癌治療手段仍有限，診療效果一定程度上取決于高效精準的個體化治療方案的制訂。因此，對腫瘤的分子遺傳信息的動態(tài)掌握成為了結直腸癌診治的重點和熱點。循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）是由腫瘤細胞釋放到血漿中的單鏈或者雙鏈DNA 片段，攜帶有與原發(fā)腫瘤組織相一致的分子遺傳學信息。ctDNA 液態(tài)活檢技術具有無創(chuàng)、能夠實時反映腫瘤基因組信息、特異性高、靈敏度高、準確度高等優(yōu)勢，能夠對腫瘤患者的病程發(fā)展及治療進行實時監(jiān)控。由此，ctDNA 逐漸成為了癌癥預防、診斷、治療研究的一大熱點[2]。目前，基于ctDNA的結直腸癌檢測平臺技術主要有實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）、微滴式數(shù)字聚合酶鏈反應（droplet digital polymerase chain reaction，ddPCR）、磁珠乳液擴增法（beads emulsion，amplification and magnetics，BEAMing）、擴增阻滯突變系統(tǒng)聚合酶鏈反應（amplification refractory mutation system polymerase chain reaction，ARMS-PCR）、下一代測序（next-generation sequencing，NGS）等[3]。下面將從ctDNA檢測在結直腸癌早期篩查中的應用，在分子診斷與用藥指導中的應用以及預后評估等多方面展開綜述。

1 ctDNA 在結直腸癌早期篩查中的應用

根據(jù)最新腫瘤流行病學研究顯示，我國結直腸癌Ⅰ期和Ⅱ期的5 年生存率分別為90%和70%，而Ⅲ期和Ⅳ期結直腸癌患者5 年生存率僅有50%和10%[4]。因此，針對高齡、吸煙、長期高脂飲食、具有結直腸癌家族史，患有炎癥性腸病等高危人群開展結直腸癌的早期篩查，開展有效的腫瘤二級預防具有重要意義，可降低結直腸癌的死亡率[5-6]。目前，我國結直腸癌的早期篩查方法主要有直腸指檢、FOBT 和腫瘤相關蛋白標志物，如癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、糖類抗原19-9（carbohydrate antigen19-9，CA19-9）檢測等，然而這些檢測方法靈敏度和特異性均有限[7]。而作為診斷結直腸癌金標準的結腸鏡作為一項高成本、患者依從性較差、且具有潛在風險和并發(fā)癥的檢查，難以成為民眾早期篩查的工具[8]。得益于ctDNA的液態(tài)活檢技術具有高靈敏度和非侵入性等特點，使其有望成為結直腸癌早期篩查的理想選擇[9]。有研究表明，通過檢測結直腸癌相關的關鍵基因的ctDNA的突變情況、甲基化水平、羥甲基化水平等，可有效做到結直腸癌的早期篩查[10]。

1.1 ctDNA 基因甲基化水平檢測在結直腸癌早期篩查中的應用

研究指出，與結直腸癌發(fā)生相關的基因甲基化水平變化往往早于相關基因突變的發(fā)生，即在癌癥早期。因此，結直腸癌發(fā)生相關的基因的甲基化水平的檢測，可應用于結直腸癌的早期篩查和診斷[11]。近年來研究報道中關于結直腸癌早期篩查常用的甲基化基因 標 志 物 有：SEPT9、SDC2、SFRP2、ALX4、TMEFF2、NGFR、p14、p16、APC、BCAT1、IKZF1、DAPK、HLTF、hMLH1、MGMT、RARβ2、RASSF2A、WIF-1、VIM、BMP3、NPTX2、RARB 等[12-13]，其中SEPT9 是一種抑癌基因，位于17 號染色體q25.3，編碼GTP 結合蛋白，其主要功能是調(diào)控細胞凋亡及細胞分裂，多數(shù)結直腸癌患者存在該基因啟動子區(qū)域的甲基化水平升高，進而引發(fā)異常的細胞分裂誘發(fā)癌變。目前，SEPT9 甲基化水平檢測結直腸癌的靈敏度可達69%，特異性達92%，相關檢測試劑盒已于2016 年被美國食品和藥品管理局批準應用于臨床，國內(nèi)也已有相關產(chǎn)品開發(fā)[14-15]。2020 年最新研究基于機器學習的生物信息學算法篩選出的cg10673833 位點，其甲基化水平可以作為結直腸癌和癌前病變，晚期腺瘤的檢測標志物。對1493例結直腸癌高危人群開展檢測，檢測靈敏度達89.7%，特異性達86.8%[16]。

然而，單一位點甲基化檢測的靈敏度和特異性仍有限，研究表明，檢測多個結直腸癌關鍵基因位點的甲基化水平可增強結直腸癌的早期篩查的靈敏度和特異性[17]。例如，采用qPCR的方法聯(lián)合檢測SEPT9和SDC2 甲基化水平，晚期腺瘤和Ⅰ期腸癌的檢測靈敏度分別提升至47.8%和80.0%，全部分期的結直腸癌檢測靈敏度達88.9%，特異性達92.8%[18]；聯(lián)合檢測ctDNA 中SDC2 和SFRP2 甲基化水平，結直腸癌檢測靈敏度達76.2%，特異性達87.9%[19]；聯(lián)合檢測ctDNA中C9orf50、KCNQ5、CLIP4 3 個基因的甲基化水平，檢測結直腸癌的靈敏度達78%，特異性達99%[20]。

1.2 ctDNA 羥甲基化水平、突變、拷貝數(shù)變異等其他檢測在結直腸癌早期篩查中的應用

DNA的羥甲基化也是表觀遺傳學的重要修飾，其與基因調(diào)控和腫瘤發(fā)病機制相關，是近年來新興的檢測技術，推動了結直腸癌的早期篩查，靈敏度可達83%。特異性可達94%[21-23]。

近年來也有檢測相關基因突變來篩查早期癌癥的相關報道，但由于單獨檢測突變往往不能做到很好的預測，早期癌癥和癌前病變往往相關突變頻率較低，且ctDNA 含量也較低，檢出率低，靈敏度較低，容易導致漏檢。聯(lián)合檢測相關基因突變和蛋白標志物的cancerseek 技術可用于多種癌癥的早期篩查，其中，結直腸癌的cancerseek 靈敏度達64.9%，特異性達99.1%[24]。

基因組不穩(wěn)定性，特別是拷貝數(shù)變異（copy number variation，CNV）是癌癥的一個特征，已被證明具有潛在的臨床應用價值。進行拷貝數(shù)變異檢測也可以對結直腸癌進行預測，靈敏度為91.7%，特異性為88.9%[25]。

綜上，隨著更大樣本數(shù)量的大規(guī)模研究開展，高效的結直腸癌早篩檢測基因標志物的發(fā)現(xiàn)，PCR、測序文庫構建和NGS 等技術的不斷發(fā)展和革新，使得更加便捷、高靈敏度和特異性的ctDNA 檢測手段和體外診斷產(chǎn)品（in vitro diagnostic products，IVD）將走向臨床，得益于目前新興的生物信息學算法的引入，以上發(fā)展將在一定程度上降低結直腸癌的死亡率，以期達到結直腸癌早診早治的目的。

2 ctDNA 在結直腸癌分子診斷和用藥指導中的應用

目前，針對結直腸癌的確診主要依賴于結直腸鏡和病理學檢測，針對結直腸癌的治療方法主要有手術、化療、放療、靶向治療和免疫治療等。對于結直腸癌患者，特別是針對中晚期原發(fā)性結直腸癌和轉移性結直腸癌患者，取得組織樣本較為困難，因此，采用基于ctDNA的液態(tài)活檢策略檢測RAS（KRAS、NRAS、HRAS），BRAF，HER2（ERBB2），EGFR，TP53，PIK3CA，APC，MET，GNAS 等基因突變，評估微衛(wèi)星不穩(wěn)定性，對結直腸癌的分子診斷和個體化用藥指導具有重要意義[26-27]。

2.1 ctDNA RAS 基因突變在結直腸癌分子診斷和用藥指導中的應用

在多種突變中，RAS 相關基因的突變檢測對靶向治療的選擇有著決定性的作用，其中KRAS 是表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）下游信號通路的重要效應因子，主要激活RAF-MAPK通路，參與生長調(diào)控，在抗細胞凋亡，介導腫瘤侵襲和轉移中起到關鍵作用[28]。存在KRAS 和NRAS 基因突變的患者往往對EGFR 抑制劑（如西妥昔單抗）不敏感，其中約有40%的轉移性結直腸癌患者存在KRAS突變，以發(fā)生在右側結腸癌者為主，有4%的轉移性結直腸癌患者存在NRAS 突變，以發(fā)生在左側結腸癌的女性患者為主。KRAS 突變中，2 號外顯子突變發(fā)生率最高，主要發(fā)生在12 號和13 號密碼子，例如，2 號外顯子G12C、G13D 突變預示著較差的預后，G12D、G12V 則與預后相關性不大。KRAS的3 號和4 號外顯子，以及NRAS的2、3、4 號外顯子突變患者對EGFR抑制劑響應也較差[29]。

因此，在結直腸癌患者中開展RAS 相關基因突變的檢測對診療中EGFR 抑制劑的使用起到指導性作用。

2.2 ctDNA 其他基因突變在結直腸癌分子診斷和用藥指導中的應用

BRAF 基因是RAS 基因下游一種絲氨酸蘇氨酸激酶基因，BRAF的激活在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到關鍵作用，該基因突變導致MAPK 信號通路活化，誘發(fā)癌癥發(fā)生。該基因中V600E 突變常發(fā)現(xiàn)于女性和年老者，存在該基因突變者可能對西妥昔單抗耐藥，對治療及預后產(chǎn)生不利影響[30]。KLF4 基因的A472D突變也會導致患者對EGFR 抑制劑耐藥，其與下游EGFR 蛋白磷酸化增強有關[31]。NTRK1 基因G595R 和G667C 突變導致了結直腸癌患者對廣譜抗癌藥TRK抑制劑恩曲替尼的耐藥[32]。

因此，對于不存在RAS 和BRAF 等相關基因突變的結直腸癌患者，可考慮聯(lián)合使用化療藥物和EGFR抑制劑及抗血管內(nèi)皮生長因子受體（vascular en dothelial growth factor，VGFR）抑制劑，以期獲得最大獲益[33]。

由于結直腸癌一般對常規(guī)化療欠敏感，早期患者根治術后一般不需要化療，在中晚期手術前減低腫瘤大小，降低分期，以及促進術后康復，臨床中氟尿嘧啶、亞葉酸鈣、奧沙利鉑三聯(lián)用藥是常規(guī)的化療方案；而對于高度的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的患者，在Ⅱ期術后，單藥氟尿嘧啶類藥物不獲益，則可采用免疫治療中的免疫檢查點抑制劑納武單抗[34-35]。因此，評估微衛(wèi)星穩(wěn)定性對于是否采取常規(guī)化療和免疫治療具有指導意義。

隨著更多靶向藥物、免疫治療藥物的開發(fā)和上市，利用動態(tài)ctDNA 針對結直腸癌相關基因位點的突變檢測和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的評估，將為中晚期結直腸癌的用藥提供重要指導。同時更多關鍵有意義的基因突變位點的發(fā)現(xiàn)，也將為抗腫瘤藥物的開發(fā)提供更多藥物關鍵靶點，助力抗腫瘤藥物的發(fā)展。

3 ctDNA 在結直腸癌預后判斷中的應用

結直腸癌明確診斷和接受相關治療后，其療效的預后評估和治療策略的及時調(diào)整在康復、延長生存時間、降低死亡率等方面是至關重要的。ctDNA 在結直腸癌預后中的效果明顯優(yōu)于其他影像學檢測和腫瘤蛋白標志物檢測。通過檢測結直腸癌患者術后血漿ctDNA 中APC、TP53 和KRAS 等基因突變情況來判斷腫瘤復發(fā)，其靈敏度和特異性均可達100%[36]。聯(lián)合檢測BCAT1、IKZF1 甲基化在檢測結直腸癌復發(fā)的靈敏度上明顯優(yōu)于CEA 檢測[37]?；颊咴诮邮芙Y直腸癌切除術或接受其他治療方案（如輔助化療，靶向治療，免疫治療）后，開展基于ctDNA的液態(tài)活檢，可以提早、特異性地檢測到微小轉移灶，有效地預測復發(fā)轉移風險，又能避免部分術后治愈的患者接受過度的輔助治療。

此外，對于接受化療和靶向治療的患者，如在藥物使用過程中出現(xiàn)不利的基因突變時可以及時更換療法，減少毒副作用，避免延誤治療時機，做到精準調(diào)整治療策略[38-40]。在接受靶向藥物治療后的耐藥分析中，KRAS、BRAF、EGFR 等基因突變頻率的改變及新發(fā)突變都意味著可能發(fā)生耐藥和預后較差[41-42]。研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤組織KRAS 野生型的結直腸癌患者中使用靶向EGFR的治療藥物，部分耐藥患者的ctDNA中檢出KRAS 突變。出現(xiàn)以上結果的可能解釋有兩種，一是藥物的選擇性篩選作用，在原發(fā)腫瘤組織中本身存在極低頻的突變，因檢測技術靈敏度有限未檢出，而靶向藥物治療過程中選擇性地殺死了未發(fā)生突變的腫瘤細胞，殘存了含有KRAS 突變的腫瘤細胞則生長，進而在血液中被檢出。另一種解釋為獲得性突變，即在靶向藥物治療過程中，腫瘤細胞為了適應或抵抗藥物所致的生存環(huán)境的惡劣變化，獲得新的突變。這些解釋在其他研究工作中得到了證實[43-44]。

因此，針對結直腸癌患者治療后開展ctDNA 檢測，能夠使臨床醫(yī)生及時獲得可能對患者具有前瞻性或者隨訪有用的信息，對不利的結果可以做到及時干預，最大可能延長患者生存期。

4 總結與展望

基于ctDNA 檢測的液態(tài)活檢技術在結直腸癌早期篩查、分子分型，檢測術后微小殘留、用藥指導、預測治療效果、監(jiān)測耐藥、術后腫瘤復發(fā)監(jiān)測等多方面，具有無創(chuàng)、實時動態(tài)和克服腫瘤異質(zhì)性等多種優(yōu)勢。檢測技術上，隨著qPCR、ddPCR、NGS 等大量檢測技術的發(fā)展，提高了其檢測的準確性和靈敏度；隨著檢測文庫的構建技術發(fā)展，分子標簽UMI的引入克服了低分子量和標簽跳躍等技術問題；隨著基礎醫(yī)學，分子生物學等多基礎學科的發(fā)展，更多關鍵標志物的發(fā)現(xiàn)，基于ctDNA的結直腸癌液態(tài)活檢將不斷推動臨床診療的不同層面發(fā)展和抗腫瘤藥物的開發(fā)，更好地為腫瘤高危人群提供檢測服務，為腫瘤患者提供更精準的個性化治療策略。