金黃色葡萄球菌生物膜防治研究進展

鄭 楊 查 何

遵義醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院檢驗科，貴州遵義 563000

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）是醫(yī)院感染的關(guān)鍵病原體，可引起從輕微淺表感染到毒素相關(guān)疾病，甚至危及生命的侵襲性感染。在美國，每年有275 000 人因耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）感染住院，多達19 000 人死亡[1]。抗生素被用作抵抗SA 感染的主要武器，但在他們的高選擇壓力下及不當使用下導(dǎo)致耐藥細菌的出現(xiàn)和流行，其中生物膜形成是SA 的主要耐藥機制之一。其次，SA 容易在人工裝置上形成生物膜，是慢性感染存在的關(guān)鍵因素。生物膜的形成使得SA 致病性和耐藥性明顯增強，能夠抵抗吞噬細胞的攻擊，對某些抗生素不具有滲透性或延緩滲透，且生物膜中的細菌不同于浮游狀態(tài)，含有更多對抗生素不敏感的休眠細胞，這種效應(yīng)使該細胞亞群能夠承受遠高于最低抑菌濃度時抗生素的抑菌效果[2]。盡管新型抗生素仍在持續(xù)開發(fā)，但它的發(fā)現(xiàn)也變得越來越困難[3]，迫切需要替代的抗生物膜治療策略。本文對近年SA 生物膜的幾大防治策略進行綜述。

1 SA 生物膜的形成

生物膜的形成是以初始黏附、增殖、成熟和擴散4 個階段為主的動態(tài)過程[4]。首先，浮游細菌的表面附屬物可逆附著，接著細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）導(dǎo)致不可逆附著；其次，細胞增殖形成微菌落；然后，生物膜生長和細胞分化，形成多層細胞簇，從而獲得由細胞、基質(zhì)和水道組成具有復(fù)雜三維結(jié)構(gòu)的成熟生物膜；最后，細胞根據(jù)生物膜中的條件主動或被動地從生物膜分離、分散和定殖在其他表面或返回浮游狀態(tài)[5]。

2 SA 生物膜的結(jié)構(gòu)

生物膜是由ECM 及內(nèi)部浮游細菌組成的有組織的集合。ECM 由多糖、蛋白質(zhì)和胞外DNA（eDNA）等成分組成[5]。多糖被稱為多糖細胞間黏附素（PIA），對生物膜的建立和維持起到重要作用。SA 表面蛋白如自溶蛋白AtlA 通過誘導(dǎo)eDNA 釋放，促進細胞間聚集和附著。其他表面蛋白如蛋白A、纖連蛋白等均有助于生物膜基質(zhì)的形成和穩(wěn)定[6]。

3 SA 生物膜防治

3.1 新型抗生素

自然條件下，細菌以浮游和生物膜2 種生長形式存在，而抗生素選擇的主要標準是對在浮游狀態(tài)下的臨床菌株進行藥敏試驗。與浮游菌比較，特殊的生物屏障作用極大地提高了細菌的耐藥性，傳統(tǒng)抗生素對生物膜的敏感性顯著下降[7-8]，因此需要探索能夠有效殺滅SA 生物膜的抗生素。達托霉素（Daptomycin）是一種新開發(fā)的環(huán)脂肽，通過快速去極化和中斷DNA、RNA 和蛋白質(zhì)合成來破壞細胞膜。其作用方式不要求細胞處于代謝活性狀態(tài)，因此其是對抗深埋在生物膜基質(zhì)中“持久性”細胞特別有效的藥劑。研究發(fā)現(xiàn)，頭孢洛林（Ceftaroline）的活性與Daptomycin 相當，在體內(nèi)甚至更有效[9]，但另一項研究顯示，其在亞抑菌濃度（MIC）下不能減少基質(zhì)產(chǎn)生菌預(yù)形成的生物膜，對部分MRSA 菌株反而增強了生物膜形成。因此，保持抗生素有效殺菌濃度對抗MRSA 相關(guān)生物膜感染至關(guān)重要[10]。特拉萬星（Telavancin，TLV）是一種新型糖肽抗生素，通過干擾肽聚糖的聚合和交聯(lián)抑制細菌細胞壁的合成。此外，TLV 還與細胞膜中的脂質(zhì)Ⅱ結(jié)合，導(dǎo)致細胞膜去極化和破壞細胞屏障功能，同樣也不受細胞代謝活性的影響。TLV 表現(xiàn)出比萬古霉素更強的抗MRSA 活性，對于耐萬古霉素的MRSA 生物膜相關(guān)感染突顯了開發(fā)新型抗生素的必要性[11]。因此，研發(fā)基于不同機制的新型抗生素勢在必行。

單一抗生素對生物膜的作用極為有限，抗菌藥物的聯(lián)合應(yīng)用可迅速增強抗菌活性，并有助于防止或延緩細菌耐藥[12]。利福平是唯一在SA 中顯示出高效和可靠抗生物膜活性的傳統(tǒng)抗生素[7]，但易出現(xiàn)耐藥性。奧利萬星與利福平結(jié)合使生物膜細菌密度顯著降低[13]，奧利萬星通過抑制細胞壁合成、破壞菌膜完整性促進利福平進入細菌，其本身可抑制細菌RNA 合成而達到協(xié)同抗菌的作用。

3.2 新型抗生物膜藥劑

3.2.1 酶 酶可以通過降解SA 的細胞壁或ECM 來破壞生物膜的穩(wěn)定性。①糖苷水解酶：通過靶向PIA 作為分散生物膜的手段。分散素B 水解β（1,6）糖苷鍵降解PIA，從而達到抑制SA 生物膜的作用[14]；溶菌酶通過催化肽聚糖的水解來破壞細菌細胞壁；藻酸鹽裂解酶則能夠降解構(gòu)成基質(zhì)的多糖藻酸鹽發(fā)揮作用[15]。②蛋白水解酶：溶葡萄球菌酶一直是對抗MRSA 的重要臨床研究對象，它能夠裂解細菌細胞壁的交聯(lián)五甘酸橋[16]；金屬蛋白酶Aur 通過降解Bap 和聚集因子b破壞SA 生物膜[16]；ATP 依賴的蛋白酶ClpP 通過對Agr群體感應(yīng)的調(diào)控[16]抑制生物膜的形成[18]，以上幾種蛋白酶通過各自機制發(fā)揮抗生物膜作用。③脫氧核糖核酸酶：DNase-I 通過降解eDNA，抑制SA 的黏附和早期生物膜的形成，這種酶在臨床已被用于治療囊性纖維化[15-16,19-21]。Sugimoto 等[22]對細胞外基質(zhì)的研究顯示，不同于PIA 僅存在少數(shù)菌株，eDNA 存在于所有菌株中，因此，eDNA 可作為今后SA 生物膜根除策略的主要靶點。涉及酶干擾生物膜形成的策略除了通過降解生物膜基質(zhì)成分，還可以使用氧化酶類，他們會產(chǎn)生干擾細菌附著及具有細胞毒性的過氧化氫及次鹵代酸[15]。

酶與抗菌劑的結(jié)合既能有效分散生物膜，又能殺死嵌入ECM 中的菌落，與單用抗菌劑比較，其具有抗菌譜增加、毒副作用減少等優(yōu)勢。無花果蛋白酶通過破壞生物膜基質(zhì)使SA 生物膜結(jié)構(gòu)遭到破壞，同時增強抗生素對生物膜嵌入細胞的作用。研究發(fā)現(xiàn)，用1000 μg/mL 的無花果蛋白酶進行預(yù)處理顯著降低環(huán)丙沙星和苯扎氯銨所需的抗菌濃度[23]。

3.2.2 再利用藥物 與新藥開發(fā)比較，藥物再利用的優(yōu)勢在于該藥的安全性和藥理學(xué)知識可供參考，減少了研發(fā)新藥所需的時間、成本和風(fēng)險。這些“非抗生素”盡管不是用來治療細菌感染，但研究發(fā)現(xiàn)其具有抗菌、抗生物膜的特性[24]。抗真菌藥卡泊芬凈通過抑制N-乙酰葡萄糖胺酶及β-1，3-D-葡聚糖合酶的同源物，降低多糖濃度和聚合物從而減少ECM，分解SA生物膜[2]。布洛芬為非甾體類抗炎藥，使細胞代謝失活和菌落計數(shù)減少，抑制細菌的初始黏附和生物膜的形成。在臨床使用中，給藥后布洛芬的血藥濃度遠低于研究中的最低MIC，但目前商業(yè)用途的布洛芬局部制劑濃度高于研究中所需的濃度。因此，布洛芬可先用作局部制劑中的防腐或消毒劑[25]。

單一使用常規(guī)抗生素很難完全殺死生物膜形式的細菌，藥物重新利用和抗生素聯(lián)合可有效提高療效、降低單藥的使用濃度。研究顯示，類風(fēng)濕藥雷公藤紅素、食品添加劑去甲二氫愈創(chuàng)木酸能在一定濃度下消除SA 已建立的生物膜。此外，可協(xié)同慶大霉素抗生物膜[26]。由于其不會對人類皮膚模型造成刺激，已在臨床用于治療SA 引起的表淺皮膚感染。總之，藥物再利用是在相對較短的時間內(nèi)有效治療細菌感染的唯一可行選擇[27]。

3.2.3 鎵基療法 鎵基療法的基本原理在于破壞細菌鐵代謝。鎵和鐵是非常相似的元素，含鎵化合物利用細菌鐵獲取系統(tǒng)穿透細菌細胞壁。在細胞水平上鎵與鐵競爭，干擾鐵的吸收、代謝。鎵不能轉(zhuǎn)移電子，也不能誘導(dǎo)氧化還原反應(yīng)，從而阻礙細菌基本生命活動。細菌對鎵不太可能產(chǎn)生抗性，因為如果細菌下調(diào)受體以減少鎵的結(jié)合和吸收，鐵的吸收也會減少[28]。

不同作用模式化合物多管齊下提供了協(xié)同抗菌作用的潛力。靶向細菌鐵代謝的化合物去鐵酮Def 和鎵原卟啉GaPP 的組合，顯示出更強的抗生物膜功效，且體外實驗顯示無細胞毒性[29]。在未來臨床應(yīng)用中，這種新穎的治療組合在對抗SA 生物膜感染方面具有巨大潛力[29]。

3.2.4 植物性化合物 植物性化合物具有抑制生物膜形成或破壞生物膜的能力。其優(yōu)點在于來源廣泛、價格低廉、不易耐藥，具有很好的發(fā)展前景。山柰酚是一種黃酮類化合物，其通過降低SA 分選酶A 基因的活性和黏附相關(guān)基因的表達，抑制初始附著，影響SA生物膜的形成[5]。研究顯示，丁香酚使SA 生物膜的含量和細胞活力顯著降低，丁香酚是一種親脂疏水化合物，透過細胞壁和細胞膜使細胞內(nèi)物質(zhì)泄漏，從而使細菌失去正常形態(tài)。從分子水平上分析，丁香酚可使對生物膜形成具有全局性影響的兩基因表達降低，其分別為葡萄球菌輔助調(diào)節(jié)位點基因和調(diào)節(jié)PIA 合成的icaD 基因[30]。

藥物聯(lián)合應(yīng)用使細菌不太可能同時對多種藥物產(chǎn)生耐藥[12]。植物提取物博拉維農(nóng)B 抑制氟喹諾酮類藥物環(huán)丙沙星的NorA 外排泵，通過藥物的不斷積累，抑制生物膜的形成。且博拉維農(nóng)B 穿透SA 生物膜的ECM 抑制活菌，起到協(xié)同抗生物膜作用[31]。

3.2.5 噬菌體 近年來噬菌體被考慮作為替代抗生物膜的療法[32]。研究發(fā)現(xiàn)噬菌體內(nèi)溶素LysK 可降解SA生物膜，內(nèi)溶素通過降解細菌的細胞壁來殺死細菌，進一步分解構(gòu)成生物膜重要結(jié)構(gòu)的肽聚糖囊泡，從而破壞生物膜的完整性[33]?？股睾褪删w的結(jié)合療法是另一種抗生物膜策略。Tagliaferri 等[32]用慶大霉素和噬菌體SA5 雙重治療金黃色葡萄球菌株P(guān)S80，慶大霉素導(dǎo)致SA 細胞呈現(xiàn)聚集表型，降低了生物膜的形成，同時也更易受噬菌體的攻擊，避免了僅用噬菌體處理出現(xiàn)的噬菌體抗性細胞。

3.2.6 抗菌肽（AMPs）AMPs 除了具有抗菌特性外，近年來發(fā)現(xiàn)其具有抗生物膜活性而作為治療感染的新途徑。最早發(fā)現(xiàn)人類AMPs LL-37 的某些肽通過穿透ECM 和殺死包埋細菌的方式造成生物膜的擴散[34]。SA1018 為一種合成的牛抗菌肽，它能觸發(fā)（p）ppGpp細菌嚴格響應(yīng)信號的降解，有效破壞已建立的SA 生物膜。但目前AMPs 造成生物膜擴散的機制尚不明確，需進一步研究[16]。

抗生素與AMPs 的聯(lián)用是一種新穎的治療方法。研究顯示，新型合成抗菌抗生物膜肽與替考拉寧聯(lián)用可清除99%生物膜包裹的細菌[35]。

4 總結(jié)

本綜述討論了SA 生物膜預(yù)防和治療的最新進展，但目前只有少數(shù)抗生物膜劑在體內(nèi)條件下進行了測試，甚至有些僅處于研發(fā)階段，應(yīng)進一步探索可行的治療方案來特異性治療SA 生物膜的感染。