金線蓮化學成分的研究

錢麗萍 李 唯 彭華毅 闕慧卿 郭舜民 林 綏▲

1.福建省醫(yī)學科學研究院 福建省醫(yī)學測試重點實驗室，福建福州 350001；2.福建出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心 福建省檢驗檢疫技術研究重點實驗室，福建福州 350003

金線蓮Anoectochilus roxburghii（wall.）Lindl為蘭科（Orchidaceae）開唇蘭屬（Anoectochilus）珍貴藥材。野生金線蓮資源正趨于瀕絕，1990年被福建省人民政府列入“福建省重點保護野生藥材物種”。金線蓮在保護肝腎[1]，預防癌癥[2]、糖尿病[3-4]、心血管疾病[5]、抗衰老[6-9]、免疫調(diào)節(jié)[10-12]等方面具有一定的功效，本文對金線蓮有效部位進行化學和藥理的研究，為金線蓮的臨床應用、藥物的質(zhì)量評價與控制奠定基礎，為大量種植與開發(fā)利用金線蓮提供科學的依據(jù)。

1 儀器與藥材

Unity inova 500型核磁共振波譜儀（美國瓦萊納公司），Q-Tof micro YA019質(zhì)譜儀（沃特世公司），WFH-201（B）型暗箱式紫外透射反射儀（上海精科實業(yè)股份有限公司），2545制備液相色譜儀（沃特世公司），Avatar-330型智能傅里葉變換紅外光譜儀（美國熱電集團），7200型可見-紫外分光光度計（上海尤尼柯科技股份有限公司），APAⅡ自動探針熔點分析儀（德國Schorpp Geratelechik公司），RE-2000B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠），KHW-S-8精密電熱恒溫水浴鍋（上?？坪銓崢I(yè)發(fā)展有限公司）。

實驗用藥材為林下種植6個月的福建產(chǎn)金線蓮Anoectochilus roxburghii（wall.）Lindl，購 自 福建省華芝韻生物科技有限公司，樣本經(jīng)福建中醫(yī)藥大學藥用植物學專業(yè)中藥鑒定方向的褚克丹教授鑒定為金線蓮Anoectochilus roxburghii（wall.）Lindl。薄層硅膠和柱色譜硅膠為青島海洋化工廠產(chǎn)品，乙腈、甲醇為色譜純，水為超純水，其余化學試劑均為分析純。

2 提取與分離

將林下種植6個月的金線蓮Anoectochilus roxburghii（wall.）Lindl洗凈晾干，稱取全草20 kg，加8倍量75%乙醇常溫浸泡24 h，加熱回流提取2次，合并提取液，在減壓狀態(tài)下回收乙醇，濃縮得粗浸膏，加入與粗浸膏相同質(zhì)量的超純水，混勻制得混懸的藥液，加入等體積石油醚振搖萃取三次，收集三次上層石油醚層備用。取下層水溶液加入等體積的乙酸乙酯振搖萃取三次，合并上層的乙酸乙酯層備用。取下層水溶液加入等體積的預先用水飽和的正丁醇，振搖萃取三次，收集正丁醇液備用。此時分別得到金線蓮的石油醚萃取部分、乙酸乙酯萃取部分及正丁醇的萃取部分，將上述3個部分的提取物減壓旋蒸，除去溶劑，得各3個萃取部位的浸膏。取正丁醇及乙酸乙酯部位浸膏分別經(jīng)硅膠柱層析色譜分離，第一次硅膠柱層析用石油醚作為洗脫液：乙酸乙酯梯度洗，收集流份，每250 ml收集一份，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀揮干洗脫劑，用TLC檢查顯色，將收集到相同的相關流份合并，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀揮干溶劑；針對有意義斑點的流份進行第二次硅膠柱層析，用三氯甲烷：甲醇梯度洗脫，收集流份，每50 ml收集一份，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀揮干洗脫劑，用TLC檢查顯色，將收集到相同的相關流份合并，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀揮干溶劑；最后用半制備液相純化得到化合物1（81 mg），化合物2（89 mg），化合物3（78 mg），化合物4（85 mg），化合物5（129 mg），化合物6（133 mg）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1，白色粉末（甲醇），改良的碘化鉍鉀試劑顯色，陽性反應，推測為含生物堿基團的化合 物，EI-MS m/z：230 [M]+，分 子 式：C13H14N2O2，UVλmax nm（MeOH）：222，279，289。IRυmax cm-1（KBr）：3373（NH），3300（OH），2990，1653（C=O）。1HNMR（DMSO-d6）δ：4.54（1H，d，J=6.6Hz，H-3），3.61（1H，dd，J=5.1Hz，J=11.8Hz，H-6），3.17（1H，ddd，J=2.6Hz，J=4.8Hz，J=15.2Hz，H-7），7.45（1H，d，J=8.0Hz，H-10），7.01（1H，ddd，J=2.0Hz，J=7.6Hz，J=8.0Hz，H-11），7.07（1H，ddd，J=2.0Hz，J=7.6Hz，J=8.0Hz，H-12），7.38（1H，d，J=8.0Hz，H-13），1.77（3H，d，J=6.8Hz，H-15）。13C-NMR（DMSO-d6）δ：133.2（C-2），49.1（C-3），169.5（C-5），57.9（C-6），23.3（C-7），106.9（C-8），126.3（C-9），118.3（C-10），118.7（C-11），121.5（C-12），111.4（C-13），136.9（C-14），17.1（C-15）。經(jīng)鑒別化合物1的其理化性質(zhì)、質(zhì)譜特征、核磁共振特征、紫外吸收、傅里葉紅外光譜及熔點分析結(jié)果與文獻[13]報道的ginsenine一致，化合物1確認為ginsenine，是首次從金線蓮植物全草中分離得到的。

化合物2，針狀結(jié)晶，mp 139～141℃（CHCL3-MeOH），EI-MS m/z：424 [M]+，分 子 式：C30H48O，UVλmax nm（MeOH）：255，373。IRυmax cm-1（KBr）：3433（OH），2920（CH），1465（C=C）。1HNMR（CDCl3）δ：1.08（1H，m，H-1），1.88（1H，m，H-1），1.51（1H，m，H-2），1.86（1H，m，H-2），3.53（1H，m，H-3），2.22（1H，m，H-4），2.28（1H，m，H-4），5.36（1H，brd，J=5.4Hz，H-6），1.52（1H，m，H-7），1.98（1H，m，H-7），1.47（1H，m，H-8），0.95（1H，m，H-9），1.48（2H，m，H-11），1.19（1H，m，H-12），2.01（1H，m，H-12），1.01（1H，m，H-14），1.54（2H，m，H-15），1.26（1H，m，H-16），2.21（1H，m，H-16），1.16（1H，brd，J=4.0Hz，H-17），5.23（1H，dd，J=15.4Hz，J=8.0Hz，H-22），0.68（3H，s，H-18），1.02（3H，s，H-19），2.06（1H，m，H-20），1.01（3H，d，J=4.5Hz，H-21），5.15（1H，dd，J=15.4Hz，J=7.6Hz，H-23），2.41（1H，ddd，J=7.0Hz，J=7.0Hz，J=7.0Hz，H-24），1.42（1H，m，H-241），1.51（1H，m，H-241），0.85（3H，t，J=7.4Hz，H-242），1.99（2H，m，H-26），1.04（3H，t，J=7.6Hz，H-261），4.74（2H，dd，J=1.4Hz，J=1.2Hz，H-27）。13C-NMR（CDCl3）δ：37.4（C-1），31.9（C-2），71.8（C-3），42.5（C-4），140.7（C-5），121.8（C-6），31.8（C-7），32.3（C-8），50.4（C-9），36.6（C-10），21.1（C-11），39.7（C-12），42.4（C-13），57.2（C-14），24.4（C-15），28.8（C-16），56.1（C-17），12.2（C-18），19.4（C-19），40.2（C-20），20.7（C-21），137.1（C-22），130.5（C-23），51.2（C-24），154.7（C-25），26.8（C-26），26.8（C-241），12.3（C-242），12.4（C-261），106.9（C-27）。經(jīng) 鑒別化合物2的理化性質(zhì)、質(zhì)譜特征、核磁共振特征、紫外吸收、傅里葉紅外光譜及熔點分析結(jié)果與文獻[14]報道的[anoectosterol（26-Methylstigmasta-5，22，25，（27）-trien-3β-ol]一致，化合 物2確 認為anoectosterol，是首次從金線蓮植物全草中分離得到。

化 合 物3，無 色 針 晶，mp151～153℃，EIMS m/z：264 [M]+，分子式：C10H16O8， UVλmax nm（MeOH）：219，257，371。IRυmax cm-1（KBr）：3405（OH），2973（CH），1778（C=O）。1HNMR（pyridine-d5）δ：2.89（1H，dd，J=17.6Hz，J=2.8Hz，H-2），2.92（1H，dd，J=17.6Hz，J=5.2Hz，H-2），4.88（1H，dddd，J=5.2Hz，J=4.6Hz，J=2.8Hz，J=1.6Hz，H-3），4.45（1H，dd，J=10.4Hz，J=4.6Hz，H-4），4.72（1H，dd，J=10.4Hz，J=1.6Hz，H-4），4.93（1H，d，J=8.0Hz，G-H-1），3.97（1H，t，J=8.0Hz，G-H-2），4.24（1H，m，G-H-3），4.21（1H，m，G-H-4），3.94（1H，m，G-H-5），4.39（1H，dd，J=11.8Hz，J=5.8Hz，G-H-6），4.59（1H，dd，J=11.8Hz，J=2.4Hz，G-H-6）。13CNMR（pyridine-d5）δ：176.6（C-1），35.8（C-2），75.9（C-3），74.7（C-4），104.7（G-C-1），75.3（G-C-2），78.9（G-C-3），71.8（G-C-4），78.9（G-C-5），62.7（G-C-6）。經(jīng)鑒別化合物3的理化性質(zhì)、質(zhì)譜特征、核磁共振特征、紫外吸收、傅里葉紅外光譜及熔點分析結(jié)果與文獻[15-16]報道的kinsenoside[β-D-glucopyranosyl-（3R）-hydroxybutanolide]一 致，化合 物3確 認 為kinsenoside。

化合物4，黃色固體，改良的碘化鉍鉀試劑顯色，陽性反應，推測為含有生物堿的化合物，EI-MS m/z：216 [M]+。分 子 式：C12H12N2O2， UVλmax nm（MeOH）：223，275，280，285。IRυmax cm-1（KBr）：3353（NH），3090，3025（-CH），2929，2855，2790（C-H），1795（C=O），1639（C=C），1618，1555，1485，1455。1HNMR（DMSO-d6）δ：7.45（1H，d，J=8.0Hz，H-4），6.96（1H，dd，J=7.0Hz，J=8.0Hz，H-5），7.09（1H，dd，J=7.0Hz，J=8.0Hz，H-6），7.33（1H，d，J=8.0Hz，H-7），4.17（1H，d，J=16.0Hz，H-8），4.24（1H，d，J=16.0Hz，H-8），3.63（1H，dd，J=5.0Hz，J=10.6，H-11），2.81（1H，dd，J=10.6Hz，J=16.0Hz，H-12），3.15（1H，dd，J=5.0Hz，J=16.0Hz，H-12），10.7（1H，s，N1-H），8.81（1H，brs，OH），6.08（1H，s，N9-H）。13C-NMR（DMSO-d6）δ：126.3（C-2），106.9（C-3），127.5（C-3a），117.6（C-4），118.3（C-5），121.5（C-6），111.4（C-7），136.5（C-7a），40.1（C-8），169.5（C-10），56.9（C-11），23.1（C-12）。經(jīng)鑒別化合物4的理化性質(zhì)、質(zhì)譜特征、核磁共振特征、紫外吸收、傅里葉紅外光譜及熔點分析結(jié)果與文獻[17-18]報道的anoectochine一致，化合物4確認為anoectochine。

化合物5，黃色針晶（MeOH），mp 315～316℃，Molish反應陰性性，鹽酸鎂粉反應呈陽性，推測為黃酮類化合物，EI-MS m/z：301 [M-H，10]，302 [M+，100]，275，155，139，分 子 式：C15H10O7， UVλmax nm：210，260，373（MeOH）。IRυmax cm-1（KBr）：3430（OH），1655（C=O），1615，1519，1435（Ar）。1HNMR（DMSO）δ：6.17（1H，d，J=2.0Hz，H-6），6.39（1H，d，J=2.2Hz，H-8），6.88（1H，d，J=8.6Hz，H-5'），7.53（1H，dd，J=8.6Hz，J=2.2Hz，H-6'），7.73（1H，d，J=2.0Hz，H-2'）。13C-NMR（100MHz，DMSO-d6）δ：146.8（C-2），135.7（C-3），175.6（C-4），160.2（C-5），98.2（C-6），163.6（C-7），93.7（C-8），157.3（C-9），103.1（C-10），122.6（C-1'），115.8（C-2'），145.1（C-3'），147.6（C-4'），115.1（C-5'），120.3（C-6'）。與槲皮素標準品對照，進行薄層顯示，結(jié)果一致，其質(zhì)譜特征、核磁共振特征、紫外吸收、傅里葉紅外光譜及熔點分析結(jié)果與文獻[19-21]報道的槲皮素（quercetin）一致，化合物5確認為槲皮素。

化 合物6，黃 色 固體 顆 粒，mp 251～253℃（MeOH），Molish反應呈陰性，鹽酸鎂粉反應呈陽性，推測為黃酮類化合物，EI-MS m/z：408[M]+，分子式：C22H16O8，UVλmax nm372，260，254（MeOH）。IRυmax cm-1（KBr）：3450（OH），1650（C=O），1620，1515，1435（Ar）。1HNMR（DMSO-d6）δ：6.33（1H，s，H-6），7.75（1H，d，H-2'），6.88（1H，d，H-5'），6.57（2H，d，H-3'，H-5'），7.46（1H，dd，H-6'），7.04（2H，d，H-2'，H-6″），3.69（2H，s，H-7'）。13C-NMR（DMSO-d6）δ：146.1（C-2），134.9（C-3），176.3（C-4），162.1（C-5），97.5（C-6），158.6（C-7），105.9（C-8），153.7（C-9），103.3（C-10）。與8-對羥基芐基槲皮素標準品對照，進行薄層顯示，結(jié)果一致，其質(zhì)譜特征、核磁共振特征、紫外吸收、傅里葉紅外光譜及熔點分析結(jié)果與文獻[22]報道的8-對羥基芐基槲皮素一致，化合物6確認為8-對羥基芐基槲皮素。

4 結(jié)果與展望

金線蓮具有廣泛的藥用價值，近年來主要用來治療高血壓、心臟病、肺炎、急慢性肝炎及腎炎等癥，而且對金線蓮的研究主要集中在人工栽培、組培等方面的研究居多[23-28]，雖然目前對金線蓮有較多的化學與藥理學的研究，但是對該植物的研究還不夠完善，我們認為應著重從尋找金線蓮的生物活性物質(zhì)出發(fā)，對金線蓮的化學成分和生物活性進行研究的同時應對種植金線蓮、野生金線蓮、組培的金線蓮進行化學成分的比較研究。

本研究從福建永安林下種植6個月金線蓮中分離到6個化合物，根據(jù)理化性質(zhì)、光譜數(shù)據(jù)及文獻數(shù)據(jù)，6個化合物依次歸屬為：ginsenine（1），anoectosterol（2），kinsenoside（3），anoectochine（4），槲皮素（5），8-對羥基芐基槲皮素（6）?；衔铮?）、（2）為首次從金線蓮植物全草中提取分離得到。但是福建永安林下種植6個月金線蓮提取的成分未與金線蓮瓶苗（組培）及野生金線蓮提取物的成分進行比較。研究在不同的栽培條件下金線蓮的化學成分是很有意義的。我們后續(xù)將進行不同的栽培與采收時期的金線蓮化學成分進行比較研究。為解決金線蓮野生品種稀缺的問題提供理論支撐，同時為臨床應用金線蓮提供理論依據(jù)。