間充質(zhì)干細胞外泌體在針刺治療缺血缺氧性腦病中的作用研究進展

季一峰，鮑超，李彥彩，陳棟

(南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029)

缺血缺氧性腦病(Hypoxic ischemic encephalopathy，HIE)是腦組織缺血缺氧引起的腦部病變，其中新生兒HIE最為常見[1]。HIE分為輕、中、重三種程度，臨床表現(xiàn)上，輕度常出現(xiàn)興奮癥狀，中度以抑制癥狀為主，重度則可至昏迷。研究表明[2]，我國HIE發(fā)病率可達活產(chǎn)新生兒的3‰～6‰，其中死亡于新生兒期的患兒約占15%～20%。存活的患兒亦有20%～30%留下神經(jīng)系統(tǒng)損傷，如腦癱、癲癇、智力障礙、感覺障礙或?qū)W習障礙[3-4]，給本人、家庭與社會都造成沉重的負擔。

HIE至今尚無完整統(tǒng)一的治療方案，治療上主要以糾正缺血缺氧為主。亞低溫治療是目前公認治療新生兒腦病有效的療法，但是其安全性仍未明確[5]，甚至存在著硬腫及彌散性血管內(nèi)凝血的風險[6]。針刺治療HIE已被證實確有療效[7]，然而，其作用機制仍需進一步研究。目前許多研究證實，間充質(zhì)干細胞外泌體(mesenchymal stem cell exosomes，MSC-Exo)能夠減少神經(jīng)元細胞凋亡，促進神經(jīng)功能恢復，達到腦保護作用[8]?；诖耍疚姆治隽薓SC-Exo及其介導的細胞凋亡與HIE的關系，探討了MSC-Exo在針刺治療HIE中的可能作用。

1 細胞凋亡與HIE的相關性

1.1 細胞凋亡是導致HIE的重要因素

HIE的病因是由各種原因所致的腦組織缺血缺氧，其中圍產(chǎn)期窒息是最主要的原因[9]。HIE的發(fā)病機制尚未明晰，一般認為可能與炎癥反應、細胞凋亡、免疫功能改變有關[10]，最終引起腦水腫、神經(jīng)膠質(zhì)增生、神經(jīng)元壞死等腦組織病理性損害[11]。其中，細胞凋亡在HIE的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。

細胞凋亡，是細胞為了保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，在基因調(diào)控下有序、自主地死亡。細胞凋亡對機體的生長發(fā)育有著重要的作用[12]。細胞內(nèi)外的各種病理因素，都可能導致細胞凋亡的發(fā)生。

1.2 缺血缺氧下細胞凋亡的發(fā)生機制

缺血缺氧環(huán)境下，腦組織血流量下降，供氧不足，會增快神經(jīng)元細胞能量消耗，加劇興奮性毒性與氧化應激反應。氧化應激加劇則會引起線粒體功能衰退，進一步增快神經(jīng)元細胞的能量消耗，導致神經(jīng)元細胞損傷乃至凋亡。氧化應激加劇還會使線粒體膜內(nèi)外離子通透性增加，使線粒體跨膜電位改變，從而引起鈣離子超載，增加細胞負荷，導致細胞損傷與凋亡。此外，細胞凋亡又會反過來進一步加劇氧化應激，造成惡性循環(huán)，加重缺血缺氧的進展，對腦組織造成持續(xù)性損傷[13-14]。

因此，通過干預減少細胞凋亡的發(fā)生與進展，是治療HIE的一條關鍵途徑。

2 MSC分泌抗細胞凋亡的外泌體，治療HIE

2.1 MSC分泌攜帶miRNAs的外泌體

間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cell，MSC)是一種多能干細胞，有著自我更新與多向分化的能力，是目前生命科學的新熱點。MSC能夠分泌細胞外囊泡，將生物活性分子輸送至靶細胞，從而修復受損組織[15]。細胞外囊泡分為外泌體、凋亡小體和微泡，研究最為廣泛的是外泌體。外泌體是一類直徑在40～100 nm的脂質(zhì)囊泡[16]，其內(nèi)容物中包裹各種脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和RNAs[17]，通過將這些物質(zhì)靶向釋放，從而實現(xiàn)細胞間物質(zhì)傳遞的作用。諸多研究證明，外泌體能夠減輕缺血缺氧下的細胞損傷與凋亡[18-20]，這可能與外泌體內(nèi)容物中的miRNAs有關。

2.2 miRNAs調(diào)控細胞凋亡

miRNAs是一類由核苷酸構成的非編碼單鏈RNA分子，在細胞增長、分化以及凋亡等方面發(fā)揮巨大作用[21]。越來越多研究證明，miRNAs能夠通過調(diào)控細胞凋亡，從而干預HIE。XIAO Q X等人[22]發(fā)現(xiàn)，缺血缺氧性腦損傷(hypoxic-ischemic brain damage，HIBD)大鼠的miR-410-3p水平明顯低于正常大鼠。在上調(diào)miR-410-3p水平后，HIBD大鼠的神經(jīng)元凋亡指數(shù)降低，神經(jīng)元存活數(shù)量增加，運動與認知能力也有所提升。YANG G等人[23]發(fā)現(xiàn)，在HIE模型中miR-146b-5p的過表達能減輕細胞凋亡與炎癥反應，而抑制miR-146b-5p則具有相反的作用。miR-21亦是一個重要的抗凋亡miRNA，能夠負向調(diào)節(jié)PTEN水平，激活PI3K/AKT/mTOR信號通路，從而抑制細胞凋亡，改善腦損傷[24-25]。

由此可見，MSC來源的miRNAs能靶向作用于神經(jīng)元細胞，介導神經(jīng)元細胞凋亡，達到腦保護作用。

2.3 MSC的臨床運用現(xiàn)狀與問題

綜上，越來越多的人們開始考慮運用MSC治療HIE。MSC移植是目前臨床上的一種前沿療法。DING H等人[26]將胎盤來源的MSC移植入HIBD模型大鼠后，發(fā)現(xiàn)抗炎因子白細胞介素-10水平增加，炎性反應減輕，提示MSC可能通過釋放抗炎因子從而改善腦損傷。JOERGER-MESSERLI M S等人[27]發(fā)現(xiàn)，MSC移植能夠減輕圍產(chǎn)期HIE小鼠的神經(jīng)元細胞凋亡，而這種作用似乎是由MSC分泌的let-7-5p調(diào)控所致的。

雖然MSC在抗凋亡方面有效，但在臨床實踐中也存在著一定的局限性。一方面，目前MSC在體外實驗中出現(xiàn)細胞存活率較低，移植難度較大，價格相對較貴等問題，制約著現(xiàn)階段臨床推廣運用使用。另一方面，對于MSC移植治療，我國尚未形成統(tǒng)一的標準化規(guī)程，在安全性、有效性及穩(wěn)定性方面仍需進一步完善。因此，如何更有效、更低廉、更規(guī)范化地將MSC運用于HIE的治療中，是當前亟需解決的一個難題。

3 針刺調(diào)控MSC治療HIE的可能機制

3.1 中醫(yī)學對HIE的認識

HIE在中醫(yī)學中無明確病名，依照臨床表現(xiàn)，可歸為“五遲”“五軟”“胎弱”“胎怯”范疇。本病病位在腦，其基本病機是腦髓不充，肢體失用。病因方面，則可歸為先天稟賦不足或是后天調(diào)養(yǎng)失當[28]。一方面，父母精血不足，或母親孕期中疾病纏身，或早產(chǎn)者，致患兒先天稟賦不足，致使精血不足，腦髓不充，筋骨肌肉、四肢百骸皆失所養(yǎng)。正如《醫(yī)宗金鑒·幼科心法要訣》所云：“小兒五遲之癥，多因父母氣血虛弱，先天有虧”。另一方面，亦有后天感受邪毒，或難產(chǎn)、產(chǎn)傷，或臍繞頸等者，損傷腦絡，以致腦髓不充，導致四肢百骸、筋骨肌肉失養(yǎng)，發(fā)為本病?！墩\書·論行遲》云：“又有離胎多病，與飲病乳，或過食肥甘，則疳癥所侵，血氣日憊，十有六七”。因此治療上，當立足病因病機，以健腦生髓為根本大法。

3.2 針刺治療HIE機制仍需探究

針刺療法在治療HIE方面已被臨床證實確有療效，前景十分廣闊?！端貑枴す强照摗吩疲骸岸矫}者……貫脊屬腎……與太陽起于目內(nèi)眥，上額交巔，上入絡腦”。督脈是“陽脈之?！保偠揭簧碇?，又貫脊背而入腦。與足太陽膀胱經(jīng)相交，有著溫陽行氣，補腦生髓之效，故許多醫(yī)家都非常注重督脈的運用。此外，《素問·陰陽應象大論》認為“腎生骨髓”，因此在治療上亦當注重補腎生髓。趙梁育[29]等通過針刺督脈、任脈、膀胱經(jīng)諸穴，并聯(lián)合丹參注射液治療HIE，有效率達89.47%，治療后患兒血流變、新生兒神經(jīng)行為評分表(NBNA)均有顯著提高。張生玉[30]等采用“醒腦開竅”針法，針刺“四神聰”“百會”“水溝”“風池”“內(nèi)關”“太沖”等穴，并結合高壓氧治療HIE，發(fā)現(xiàn)患兒血流變、認知功能與日常生活行為能力均優(yōu)于單純高壓氧治療。

雖然目前很多研究證明了針刺對于治療HIE有效，但是作用機制尚有爭議。目前關于針刺治療HIE作用機制的研究是多方面的，涉及腦血流量、病理形態(tài)學、能量代謝、自由基代謝、細胞凋亡、突觸聯(lián)系、神經(jīng)營養(yǎng)因子表達等，但許多機制仍需要進一步的探索。

3.3 針刺調(diào)控miRNAs抑制細胞凋亡

越來越多的研究證明，針刺能夠調(diào)控miRNAs水平，介導細胞凋亡從而產(chǎn)生神經(jīng)保護作用。ZHOU H[31]等人用電針(Electro-acupunture，EA)刺激大腦中動脈缺血(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型大鼠，發(fā)現(xiàn)EA能夠抑制miR-191a-5p的表達，減少細胞凋亡，從而保護腦組織。SHA R[32]等人發(fā)現(xiàn)EA刺激MCAO模型大鼠后，大鼠miR-223的水平升高，細胞凋亡指數(shù)降低，這說明EA可能通過調(diào)控miR-223水平減少細胞凋亡，從而治療腦損傷。 ZHANG S[33]等人發(fā)現(xiàn)EA可以上調(diào)miR-146b的表達，減少細胞凋亡，并促進神經(jīng)干細胞分化，從而改善MCAO大鼠的神經(jīng)損傷。

由此可見，miRNAs介導的細胞凋亡可能是針刺治療HIE的作用機制，但起作用的miRNAs的來源仍需進一步探究。

3.4 針刺調(diào)控MSC水平

MSC-Exo能夠定向遷移至靶細胞，實現(xiàn)細胞間的物質(zhì)傳遞，從而治療疾病。這與中醫(yī)學中的經(jīng)絡相類似。經(jīng)絡“溝通表里，聯(lián)系臟腑”，又“運行氣血，調(diào)和陰陽”，亦是一個進行物質(zhì)傳遞，從而治療疾病的通道。因此，MSC-Exo很有可能是經(jīng)絡的科學內(nèi)涵之一。中醫(yī)學認為，針刺會通過經(jīng)絡產(chǎn)生治療作用。從分子生物學角度上來看，很可能是針刺作用于MSC，通過MSC-Exo將攜帶的miRNAs釋放于靶細胞，從而產(chǎn)生治療作用。

如果受到針刺調(diào)控的miRNAs來源于MSC，那么針刺應當對MSC產(chǎn)生作用。最新研究表明，針刺確實能夠調(diào)節(jié)機體內(nèi)MSC的水平。

LIU L[34]等人用電針(EA)刺激大鼠“脊中”“命門”穴位，發(fā)現(xiàn)外周血中的MSC水平顯著增高，由此提出，EA刺激能夠促進骨髓MSC進入外周血循環(huán)。SALAZAR T E[35]等人則通過實驗進一步明確作用機理。研究指出，在經(jīng)過EA刺激后，大鼠外周血內(nèi)的MSC水平明顯高于刺激前，這可能是由于EA使得大鼠下丘腦內(nèi)以及下丘腦與杏仁核等鄰近腦區(qū)之間的功能連接強度增加，從而激活交感神經(jīng)系統(tǒng)(SNS)所致，激活的SNS促進MSC釋放到外周血循環(huán)中，增加循環(huán)MSC水平并轉(zhuǎn)運到受損組織，從而輔助組織修復。

由此可見，在針刺作用下，MSC的水平提高。MSC水平提高則會產(chǎn)生更多的MSC-Exo作用于靶細胞，使得miRNAs表達增加，從而抑制細胞凋亡，形成腦保護作用。這可能是針刺治療HIE的分子生物學機制之一。

4 小結

目前，關于針刺通過調(diào)節(jié)MSC-Exo從而治療HIE的研究鮮有報道。但是目前已經(jīng)應用于臨床的MSC移植治療方案，證明了MSC-Exo攜帶著miRNAs等物質(zhì)，通過多種通路靶向作用于神經(jīng)元細胞，從而介導神經(jīng)元細胞凋亡，達到腦保護作用。而最新研究表明，針刺能夠調(diào)控miRNAs介導細胞凋亡，亦能調(diào)節(jié)機體內(nèi)的MSC?；诖耍P者推測針刺能夠通過對自體MSC的調(diào)節(jié)，促進MSC-Exo源性miRNAs的釋放于靶細胞，從而減輕細胞凋亡，達到治療HIE的效果。在今后的研究中，深入探究MSC、MSC-Exo以及miRNAs在治療HIE中的作用，能夠為針刺治療HIE提供科學客觀的作用機制，帶來新的研究思路與研究途徑，從而更好地服務于臨床。