中醫(yī)藥干預失眠模型動物的代謝組學研究進展

王亮，李紹旦，王鵬，李晨，侯曉圓，張俊修，張印，楊明會*

(1.解放軍總醫(yī)院中醫(yī)醫(yī)學部，北京 100853； 2.解放軍醫(yī)學院，北京 100853；3.解放軍總醫(yī)院研究生院，北京 100853)

睡眠作為大腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)活動的一部分，占人類壽命三分之一。在現(xiàn)代醫(yī)學中，失眠泛指符合臨床指南和診斷標準的失眠障礙(Insomnia disorder)和各類失眠癥狀(Insomnia symptoms)，中醫(yī)將失眠統(tǒng)稱為“不寐”“不得眠”“不得臥”等，包括睡眠啟動困難、難以維持睡眠或清晨醒來無法恢復睡眠等癥狀，易引發(fā)日間功能受損如認知能力下降、疲倦或情緒紊亂等臨床上顯著痛苦或活動障礙[1-2]。失眠流行病學調查顯示全世界約12.1%的人群患有與失眠相關癥狀[3]，長期睡眠不足不僅會引起高血壓、心血管病和糖尿病等慢性疾病[4-7]，還會造成抑郁、焦慮等心理疾病[8]。嚴重失眠更是影響人類的工作效率、生活質量和記憶力等，也是造成車禍、自殺等事故的高危因素[9-10]。

目前，常見失眠模型動物多采用應激(如心理創(chuàng)傷、強迫游泳)、特殊環(huán)境(如噪音、低溫)、藥物(如對氯苯丙氨酸PCPA、咖啡因)等方法誘導或睡眠剝奪來模擬人類失眠的癥狀表現(xiàn)[11]。代謝組學(Metabolomics)作為一門新興學科，通過揭示生物整體、器官或組織內源性代謝物質的生化變化深入了解疾病的生理病理過程[12]。睡眠是必不可少的生物學過程，在機體代謝調節(jié)中起關鍵性作用[13]。睡眠時間縮短與代謝失調的風險有關聯(lián)，急性睡眠剝奪(Sleep deprivation，SD)可導致血漿代謝譜紊亂[14]。代謝組學的整體性與中醫(yī)整體觀念有異曲同工之妙，建立系統(tǒng)代謝組學分析方法，為中醫(yī)藥提供了可靠的療效評價機制[15]。隨著中醫(yī)藥治療失眠研究的不斷深入[16]，關于失眠的代謝組學分析文獻也逐漸增多，但報道比較分散、研究不夠深入和代謝產物關聯(lián)不夠密切。本文從中醫(yī)藥干預失眠模型動物的血液、腦組織、臟腑組織、尿代謝物與腸道微生物的代謝組學分析入手，匯總中醫(yī)藥治療失眠的代謝組學研究進展情況，為深入探索中醫(yī)藥干預失眠的代謝機制提供參考。

1 失眠模型動物之血液代謝組學

1.1 中醫(yī)之血與失眠

中醫(yī)認為，“血”源自脾胃運化之水谷精微，化生于脾而受藏于肝，故可濡養(yǎng)周身、平衡陰陽?！鹅`樞》謂:“肝藏血，血舍魂”“血脈和利，精神乃居。”《景岳全書》不寐篇曰:“血液，灌溉一身，無所不及……以致滋臟腑，安神魂，無非血用也?！币虼?，血液正常供給才可使人安寐。

1.2 血代謝實驗研究

現(xiàn)代血液代謝研究表明內源性晝夜節(jié)律鐘對機體各種代謝途徑有很大影響[17]。在SD后除谷氨酸外，血液中谷胱甘肽成分如甘氨酸、谷氨酸和半胱氨酸及其前體如蛋氨酸、絲氨酸和蘇氨酸等顯著減少[18]。楊鈺涵等[19]研究發(fā)現(xiàn)心腎不交失眠模型大鼠中ACTH、CRH增多，并存在磷酸戊糖代謝，谷氨酸、丙氨酸與天冬氨酸代謝，組氨酸代謝，牛磺酸與亞?；撬岽x等4條代謝通路。酸棗仁湯干預失眠大鼠的調節(jié)代謝作用研究表明，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、苯丙氨酸代謝、色氨酸代謝、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、酪氨酸代謝和嘌呤代謝是影響其發(fā)病的主要代謝途徑[20]。研究者應用代謝組學技術檢測出失眠后23個顯著差異代謝物，發(fā)現(xiàn)水芹乙酸乙酯提取物是水芹發(fā)揮鎮(zhèn)靜催眠藥效的有效部位，能提升5-HT、TNF-α和IL-1β含量，增加5-HT1a受體mRNA表達，其主要通過影響機體的甘油磷脂代謝、色氨酸代謝、泛酸和CoA生物合成、β-丙氨酸代謝等代謝通路發(fā)揮干預失眠的作用。岳賀等[21]研究發(fā)現(xiàn)交泰丸干預失眠的作用機制與氨基酸代謝、脂質代謝調節(jié)有關，失眠模型大鼠血清低/極低密度脂蛋白、不飽和脂肪酸水平明顯升高；經(jīng)交泰丸干預后，血清低/極低密度脂蛋白回調趨近正常水平，血清中谷氨酸、異亮氨酸顯著下調，膽堿、磷酸膽堿顯著回調。從中可以看出，血液各代謝成分與中醫(yī)有關失眠本質陰陽平衡之間密切相關。

2 失眠動物模型之腦代謝組學

2.1 中醫(yī)之腦與失眠

中醫(yī)經(jīng)典《素問·脈要精微論》認為失眠與腦有關，指出:“頭者精明之府”“腦主神明”。清·王宏瀚著《醫(yī)學原始》首次提出睡眠由腦所主的觀點。清·鄭光祖在《一斑錄》載:“人寐則腦與心神相會，夢每因之而成”，強調腦神主調節(jié)適應內外環(huán)境平衡，維持晝則精明、夜則安眠的生物節(jié)律。

2.2 腦代謝實驗研究

研究證實睡眠能改善大腦的記憶、情緒和認知功能[22]。研究表明，96 h睡眠異?？梢鹣虑鹉X谷胱甘肽水平顯著下降，但其他腦區(qū)則表現(xiàn)正常。王穎等[23]基于代謝組學平臺GC/ MS發(fā)現(xiàn)人參糖蛋白(GPr)可能參與嘌呤代謝、煙酸與煙酰胺代謝、甘氨酸、絲氨酸與蘇氨酸代謝、精氨酸與脯氨酸代謝、丙氨酸、天冬氨酸與谷氨酸代謝以及類固醇激素生物合成等腦代謝途徑來起到鎮(zhèn)靜催眠作用。研究表明[24]交泰丸干預失眠的作用機制可能與調節(jié)機體氨基酸代謝有關，具體表現(xiàn)在下調失眠大鼠海馬組織?；撬?、甘油磷酸膽堿水平，上調丙氨酸、γ-氨基丁酸水平。慢性SD使大鼠腦脊液中內源性代謝產物發(fā)生變化，通過UPLC/Q-TOF-MS檢測技術，在正離子模式下大鼠腦脊液中檢測到組氨半胱氨酸、L-組氨酸、L-色氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸鹽、L-絲氨酸和L-酪氨酸等與睡眠有關因子，其中L-組氨酸和L-絲氨酸隨著睡眠剝奪的進行含量升高[25]。這表明在內分泌和神經(jīng)系統(tǒng)的緊密協(xié)調中大腦起到調節(jié)晝夜節(jié)律的重要作用，特別是大腦與睡眠相關下丘腦、海馬區(qū)域顯著改變和影響代謝物富集分析通路[26]。

3 失眠動物模型之五臟代謝組學

3.1 中醫(yī)之五臟與失眠

歷代醫(yī)家認為五臟與失眠有著密切的聯(lián)系，五臟功能失調是導致陰陽氣血失和的根本原因，久則引起不寐。人體正?！皶兙姑隆睜顟B(tài)與五臟之神有密切關系，如《素問》曰：“人有臥而有所不安者，臟有所傷?！蔽迮K氣化功能正常，氣機暢達則機體代謝正常，若五臟氣化功能異常，氣化無權，氣機逆亂，則機體代謝失常[27]。

3.2 五臟代謝實驗研究

現(xiàn)代研究證實SD可導致氧化應激升高，增加對谷胱甘肽合成和谷胱甘肽成分耗竭的需求。眼酸被證明是氧化應激反應的新生物標志物，是肝臟谷胱甘肽耗竭的敏感指標[28]。研究表明慢性SD可使胰島素釋放產生障礙，大鼠胰島β細胞GSIS/KSIS功能明顯受損[29]。睡眠限制對晝夜生物學的影響已經(jīng)確定，發(fā)現(xiàn)脂肪酸和脂類時循環(huán)代謝物的主要部分之一，受晝夜方式調節(jié)的特定脂質如磷酸膽堿是肝臟攝食代謝的特定調節(jié)劑[30]。黃曉宇等[31]采用基因芯片測序技術發(fā)現(xiàn)SD大鼠模型被天王補心丹干預前后能量代謝差異基因可促進脂代謝、糖代謝與蛋白代謝進程，可能通過下調肝、心的NPY、DUSP1 mRNA表達，參與激活p38 MAPK信號通路。研究人員發(fā)現(xiàn)[32]睡眠剝奪SD可引起小鼠肝臟谷胱甘肽代謝、嘧啶代謝、氨基酸代謝及花生四烯酸等多重代謝紊亂。

4 失眠動物模型之尿代謝組學

4.1 中醫(yī)之尿與失眠

尿液的生成和排泄，與腎氣的蒸騰氣化直接相關，對維持體內津液代謝平衡至關重要。不寐患者經(jīng)常出現(xiàn)夜尿頻繁(俗稱起夜過多)，這與中醫(yī)“腎主水”的理論息息相關。中醫(yī)學認為“腎主水，納氣藏精”。清·鄭壽全在《醫(yī)法圓通·不臥》記載：“不臥一證……有因腎陽衰而不能啟真水上升以交于心，心氣即不得下降，故不臥”，強調為若是腎中真元(精)不足，可導致陽不入陰、神不安守。臨床亦發(fā)現(xiàn)恐懼、驚嚇等不良情緒可使“腎水不固、失濟于心”，最終導致失眠。

4.2 尿代謝實驗研究

尿液是細胞代謝物的匯集處，其生物基質可用作代謝信息來源，具有易被動、非侵入性和縱向收集，為臨床醫(yī)學診斷的提供了獨特和連續(xù)的代謝表型。研究發(fā)現(xiàn)[33]交泰丸能上調大鼠尿液與失眠相關的二甲基甘氨酸、?；撬岷捅揭阴８拾彼崴?，下調N-乙酰糖蛋白、丙酮酸、琥珀酸、α-酮戊二酸、二甲胺等8種潛在生物標志物，說明交泰丸能對失眠模型大鼠尿液代謝紊亂產生有效的干預作用。沈淑潔等[34]采用代謝組學1H-NMR技術分析發(fā)現(xiàn)半夏厚樸湯鎮(zhèn)靜催眠作用可能與調節(jié)失眠大鼠尿液谷氨酰胺、磷酸肌酸、2-酮戊二酸含量來減輕腦內神經(jīng)興奮性有關。SD大鼠模型中綠原酸(CGA)可能的抗抑郁機制可能與調節(jié)煙酸和煙酰胺代謝的異常途徑、乙醛酸和二羧酸酯代謝、甘氨酸，絲氨酸和蘇氨酸代謝以及精氨酸和脯氨酸的代謝等有關[35]。近期報道研究者已使用智能設備應用程序收集了各種生物統(tǒng)計數(shù)據(jù)，探索尿液代謝物濃度與睡眠、生活方式等其他衡量標準之間的關聯(lián)性[36]?？梢?，尿液中的代謝產物對于研究失眠的代謝組學機制具有重要的臨床意義。

5 失眠動物模型之腸道菌群代謝組學

5.1 中醫(yī)之腸道菌群與失眠

《素問·逆調論篇》中述：“陽明逆不得從其道，故不得臥也?！薄鹅`樞·大惑論篇》中載：“其腸胃小……衛(wèi)氣之留于陽也久，故少瞑焉?！闭f明腸胃功能失常，體積變小，衛(wèi)氣在體表停留時間較長，則不得臥或少眠，可解釋為腸胃為促進睡眠提供的能力物質較少或功能弱[37]。腸道菌群失調可導致脾、胃、腸運化功能失常，并通過影響HPA軸的神經(jīng)遞質分泌節(jié)律來改變中樞神經(jīng)系統(tǒng)的認知、思維調節(jié)能力。

5.2 腸道菌群代謝實驗研究

現(xiàn)代醫(yī)學腸道微生物-腸-腦軸系列研究提示睡眠與精神、神經(jīng)、內分泌和免疫多因素的聯(lián)合作用密切相關，其中腸道微生物-腸-腦軸扮演了重要的角色，是導致失眠的重要環(huán)節(jié)。睡眠片段和睡眠持續(xù)時間短都可能通過激活HPA軸來影響宿主腸道微生物平衡[38]，降低有益細菌屬的水平，改變微生物組的代謝功能，同時調節(jié)糞便中細菌修飾的代謝產物(如膽汁酸)水平[39]?；谀c道菌群-腸胃-腦軸在失眠中的作用機制，腸道菌群失調可導致胃腸脾運化功能失常，并通過影響HPA軸的神經(jīng)遞質分泌節(jié)律，影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的認知、思維調節(jié)能力。酸棗仁總皂苷及轉化產物均有鎮(zhèn)靜催眠作用，總體轉化產物較酸棗仁總皂苷藥效趨勢好，具有維持穩(wěn)定代謝能力的腸道菌群體外培養(yǎng)體系[40]。李云等[41]研究發(fā)現(xiàn)間歇性SD會引起大鼠抑郁樣狀態(tài)和腸道菌群失調，姜黃素能改善SD大鼠的抑郁樣狀態(tài)和腸道菌群失調。研究證實小檗堿對小站臺水環(huán)境法建立SD模型大鼠腸道菌群結構以及Th17/Treg平衡有調節(jié)作用，包括調節(jié)其腸道菌群結構， 增加大腸桿菌、乳酸桿菌、雙歧桿菌數(shù)量而降低產氣莢膜梭菌和腸球菌的數(shù)量[42]。研究發(fā)現(xiàn)中成藥百樂眠膠囊通過腦-腸軸減輕PCPA所致小鼠失眠情況，平衡結腸糞便中神經(jīng)遞質水平，調節(jié)腸道微生物群多樣性、組成和富集有益菌[43]。研究者發(fā)現(xiàn)酸棗仁湯可調整睡眠剝奪應激引起的特定腸道菌紊亂，增加腸道中有益菌數(shù)量，減少腸道有害菌數(shù)量，改變腸道菌群結構，說明SD過程與腸道菌群的數(shù)量及比例結構直接相關[44]。可見，腸道代謝產物作為深入研究中醫(yī)藥干預失眠動物模型的腸道菌群代謝組學的潛在微生物標記物，為“腸-腦軸”理論與中醫(yī)“胃不和臥不安”經(jīng)典學說的有機結合提供了研究方向。

6 討論

隨著信息化時代電子產品的不斷普及，看電視電影、玩電腦手機、加班熬夜等行為逐漸侵占人類整體睡眠時間，使之呈現(xiàn)明顯減少趨勢。當前，臨床治療失眠可通過藥物療法、非藥物療法來改善睡眠[45-46]，并減輕由睡眠不足引起的痛苦或功能障礙[47]。失眠的具體機制尚不明確，而代謝物水平可反映人類的營養(yǎng)、生活方式及睡眠質量。研究發(fā)現(xiàn)失眠可引起機體代謝功能的紊亂，包括碳水化合物代謝、內分泌以及晝夜代謝過程，代謝基因、時鐘振蕩和氧化應激也受到急性SD的干擾[48]。在正常晝夜節(jié)律下，24 h內新陳代謝控制會跨組織和行為上與時間協(xié)調。流行病學證據(jù)表明，睡眠周期改變、睡眠時間中斷或睡眠質量下降可增加整體代謝綜合征的易感性[49-50]。

在醫(yī)學領域，質譜和核磁共振波譜作為代謝組學的兩個主要分析平臺，具有潛在的強大應用，如新穎的潛在疾病生物標志物發(fā)現(xiàn)[51]、中藥方劑療效評價[52]和中藥安全性評價[53]。中醫(yī)藥干預失眠模型的代謝組學應用，通過選擇適當?shù)氖邉游锶绱笫?、小鼠等嚙齒類模型為研究基礎[54]，分析其代謝組學機制，雖取得了一定的成績，但仍存在失眠動物模型較為單一、造模成功難以評價、代謝產物之間的關聯(lián)性不強等難點，均有待進一步深入研究和探索。綜上所述，本文將中醫(yī)藥治療失眠動物模型探究失眠的代謝組學進展情況進行有效整合，分別從其血液、腦組織、五臟組織、尿液和腸道菌群等代謝機理出發(fā)，深入分析相關代謝產物對失眠病機、進展和治療的主要進展，考慮到現(xiàn)有失眠代謝組學國內外文獻的局限性，對代謝物庫內的動態(tài)合成或分解代謝缺乏相應的解釋和剖析，而特定代謝物報道分子和單細胞代謝組學的未來工作，為中醫(yī)藥治療失眠的下一步實驗研究和臨床路徑提供了合適的探索方法。