多發(fā)性硬化代謝組學(xué)研究進(jìn)展

王蒂媛 殷旭華 米飛躍

1）內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010058 2）內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010059

多發(fā)性硬化（multiple sclerosis，MS）被認(rèn)為是中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫介導(dǎo)的炎性脫髓鞘疾病，以血腦屏障破壞、軸索損傷、膠質(zhì)增生、脫髓鞘為主要特征［1-2］，該病的臨床特點(diǎn)為時(shí)間多發(fā)性和空間多發(fā)性，可表現(xiàn)為反復(fù)發(fā)作的視力下降、復(fù)視、肢體感覺障礙、肢體運(yùn)動(dòng)障礙、共濟(jì)失調(diào)、膀胱或直腸功能障礙等。該病呈全球性分布［3］，各地發(fā)病率不同，預(yù)計(jì)全球有250萬患者，MS的發(fā)病年齡20～40歲，女性多見，是年輕患者非創(chuàng)傷性殘疾的首要原因，給家庭及社會(huì)帶來極大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［4］。

早期防治可以延緩疾病的進(jìn)展，改善患者的生活質(zhì)量。研究表明環(huán)境和遺傳因素會(huì)增加MS的風(fēng)險(xiǎn)［5］，但疾病的確切因素尚不清楚，使得疾病的準(zhǔn)確診斷、預(yù)后和治療變得復(fù)雜。對MS的深入研究有助于進(jìn)一步理解其病理生理特點(diǎn)，了解發(fā)病機(jī)制以及進(jìn)一步尋找其潛在的診斷或治療靶點(diǎn)。代謝組學(xué)是一種高通量、高靈敏度的檢測技術(shù)，主要針對細(xì)胞、組織、體液中相對分子量＜1 000的小分子進(jìn)行分析，是連接各種生物過程的代謝途徑的分支［6］。代謝組學(xué)從疾病下游小分子層面認(rèn)識(shí)疾病的內(nèi)在過程，能夠更直接、更準(zhǔn)確地反映生物體的生理狀態(tài)，是轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的延伸，提供無法從基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)或蛋白質(zhì)組學(xué)等其他技術(shù)獲得的信息，且其可作為一種精確的非侵入性工具辨別藥物治療的作用機(jī)制，區(qū)分遺傳學(xué)、微生物組活性和營養(yǎng)對整體代謝表型的貢獻(xiàn)，正越來越多地被用于開發(fā)疾病的生物標(biāo)記物和確定致病機(jī)制等［7-9］。因此，運(yùn)用代謝組學(xué)可能會(huì)為理解MS的復(fù)雜性和發(fā)病機(jī)制提供另一個(gè)見解，且有潛力成為多發(fā)性硬化診斷和治療的工具。近年來，越來越多的學(xué)者將代謝組學(xué)技術(shù)運(yùn)用于MS的研究。本文總結(jié)了近年來國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，從發(fā)病機(jī)制、診斷、監(jiān)測疾病進(jìn)展、分期、鑒別其他相關(guān)疾病以及預(yù)測藥物療效等方面進(jìn)行綜述。

1 代謝組學(xué)技術(shù)概述

代謝組學(xué)誕生于20世紀(jì)末，由英國倫敦帝國大學(xué)NICHOLSON教授提出［10］。目前代謝組學(xué)分析最流行的3個(gè)平臺(tái)是磁共振技術(shù)（NMR）［11］、氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）［12］和液相色譜-質(zhì)譜法（LC-MS）［13］。這些技術(shù)均可以高通量、自動(dòng)化的方式檢測、識(shí)別和量化代謝物。磁共振在代謝物鑒定和自動(dòng)化方面具有優(yōu)勢，但靈敏度較低，檢測范圍局限，儀器成本稍高等缺點(diǎn)限制了其廣泛使用。GC-MS具有靈敏度高、儀器成本低等優(yōu)點(diǎn)，但樣品前處理工作量較大。與前兩種比較，LC-MS應(yīng)用范圍相對廣泛，可對大部分小分子代謝物進(jìn)行準(zhǔn)確、靈敏的鑒定。

非靶向和靶向性分析是代謝組學(xué)研究的兩種主要方法［14］。非靶向方法用于生成假設(shè)，能夠?qū)ι飿悠分械乃写x物進(jìn)行檢測，可以更廣泛地了解整個(gè)代謝組和相關(guān)表型，通常被認(rèn)為是基于假設(shè)生成發(fā)現(xiàn)的模型。相反，靶向方法是通過對先前假設(shè)的測試驅(qū)動(dòng)的，該假設(shè)能夠?qū)ψ疃?0種特定但有限的代謝物進(jìn)行絕對量化。兩種方法的聯(lián)合使用可以實(shí)現(xiàn)精確識(shí)別和完整量化。

2 代謝組學(xué)在MS中的研究

2.1診斷方面目前MS的診斷以2017年修訂的McDonald標(biāo)準(zhǔn)作為金標(biāo)準(zhǔn)［15］，強(qiáng)調(diào)時(shí)間和空間上的多發(fā)，但在臨床上MS常因首次發(fā)作的時(shí)間多發(fā)性和空間多發(fā)性證據(jù)不足，且診斷缺少特異性標(biāo)志物，因而容易誤診和漏診。為了提高早期診斷率，人們開始思考是否存在其他的生物標(biāo)志物可以提高M(jìn)S的診斷。隨著代謝組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，其逐漸應(yīng)用于MS。早在1993年，LYNCH等［16］用磁共振檢測到MS患者和正常對照組腦脊液中存在差異代謝物。后又有人利用質(zhì)子磁共振譜進(jìn)行代謝譜分析，結(jié)果顯示與對照組相比，MS組硒含量明顯降低［17］，但當(dāng)時(shí)所鑒定出來的差異代謝物數(shù)量較少。PODDIGHE等［18］采用質(zhì)譜技術(shù)對16例MS患者和12名健康對照者的血漿進(jìn)行代謝組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)2組天冬酰胺、鳥氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸等代謝物存在差異，這些發(fā)現(xiàn)與使用磁共振方法分析腦脊液樣本的研究結(jié)果相似［19］。在一項(xiàng)最近的研究中，使用高分辨率混合四極桿-Orbitrap質(zhì)譜儀對12個(gè)MS患者和12個(gè)健康對照者的腦脊液CSF進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，MS患者的甘氨酸、不對稱二甲基精氨酸（ADMA）、甘油磷脂PC-O（34∶0）和己糖的水平顯著增加［20］。以上結(jié)果表明代謝組學(xué)是一種有效的方法，可能為該疾病提供新的生物標(biāo)志物。

2.2發(fā)病機(jī)制方面目前為止，多種系統(tǒng)生物學(xué)方法已被應(yīng)用于MS的研究，如基因組學(xué)、蛋白組學(xué)，并對該病的發(fā)病機(jī)制取得一定進(jìn)展［21-24］，但關(guān)于其發(fā)病機(jī)制的看法仍不統(tǒng)一，所以需要更多的工具說明MS的確切發(fā)病機(jī)制。SINGH等［25］采用高效液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，在MS動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)8種常見的代謝產(chǎn)物在病例和對照組的血液和尿液生物液體中均發(fā)生明顯的改變，其中苯丙氨酸代謝紊亂，谷氨酰胺、亮氨酸和異亮氨酸代謝途徑紊亂，參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙。VANYSLADA等［26］使用基于質(zhì)譜的非靶向代謝組學(xué)研究表明，大多數(shù)改變發(fā)生在脂類、能量代謝、脂肪酸代謝和磷脂代謝水平的改變。另一項(xiàng)研究確定了MS病例組和對照組的12種差異代謝物，其中6種AUC>80%，如焦谷氨酸、月桂酸酯。這些代謝物參與谷胱甘肽代謝、脂肪酸代謝/氧化、細(xì)胞膜組成和瞬時(shí)受體電位通道信號(hào)傳導(dǎo)?；诿糠N代謝物的基因表達(dá)關(guān)聯(lián)的途徑分析表明，與細(xì)胞凋亡和線粒體功能障礙有關(guān)的途徑富集。有趣的是，主要的MS遺傳風(fēng)險(xiǎn)等位基因HLA-DRB1×15：01與6種最相關(guān)代謝物之一相關(guān)［27］。以上研究表明能量代謝、脂代謝、氧化應(yīng)激等可能參與MS的發(fā)病機(jī)制。

2.3疾病分期或進(jìn)展方面NOGA等［28］使用靶向液相-色譜質(zhì)譜法（LC-MS）和氣相-色譜質(zhì)譜法（GCMS）研究了急性實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）大鼠模型中的CSF代謝組，通過同時(shí)注射兩種不同物質(zhì)誘導(dǎo)大鼠急性EAE。在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集CSF樣品：接種后10 d（在疾病發(fā)作期間）和接種后14 d（在疾病高峰期）。與對照相比，EAE發(fā)作期間代謝組圖譜顯示精氨酸、丙氨酸和支鏈氨基酸水平顯著降低。在疾病高峰期，觀察到多種代謝物的濃度顯著增加，包括谷氨酰胺、O-磷酸乙醇胺、支鏈氨基酸和腐胺。受影響的途徑包括一氧化氮合成、能量代謝改變、多胺合成和內(nèi)源性抗氧化劑的含量。EAE發(fā)作和高峰兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)獲得的CSF代謝譜顯示出明顯的差異，表明在MBP誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥過程中CNS代謝發(fā)生顯著變化，暗示進(jìn)展型MS中氨基酸和核苷酸代謝與對照組或復(fù)發(fā)緩解型（RRMS）相比有差異，可以嘗試通過代謝譜可區(qū)分不同時(shí)期MS。

DICKENS等［30］第一個(gè)使用血清NMR證明復(fù)發(fā)緩解型（RRMS）和繼發(fā)進(jìn)展型MS（SPMS）代謝物有差異，表明代謝物具有客觀上區(qū)分MS的這兩個(gè)階段的潛力［29］。HERMAN使用質(zhì)譜方法證明了SPMS相對于RRMS在腦脊髓液（CSF）中存在明顯的代謝變化。FEDERICA等［31］采用磁共振（H-NMR）和質(zhì)譜分析（結(jié)合氣相色譜和液相色譜）對收集的34例患者的腦脊液和血液兩種樣本（RRMS 22例，PPMS 12例）進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，RRMS和PPMS的代謝物存在差異，可以鑒定出幾種代謝產(chǎn)物的改變（脂質(zhì)、生物胺和氨基酸），主要參與的代謝途徑有谷胱甘肽代謝、氮代謝、谷氨酰胺-谷氨酸代謝、精氨酸-鳥氨酸代謝等。其中谷胱甘肽代謝和氮代謝與氧化應(yīng)激密切相關(guān)。GAETANI等［32］利用質(zhì)譜技術(shù)的研究也表明，穩(wěn)定期MS患者和復(fù)發(fā)期MS患者的尿液中色氨酸代謝物有差異。這些發(fā)現(xiàn)顯示出代謝組學(xué)在研究疾病不同分期及進(jìn)展方面有很大的潛在價(jià)值。

2.4鑒別其他神經(jīng)炎性疾病多發(fā)性硬化（MS）和一些其他的炎癥性脫髓鞘疾病，如視神經(jīng)脊髓炎（NMO），有時(shí)難以區(qū)分，會(huì)增加臨床上的誤診率［33］。為了尋找MS可能的獨(dú)特代謝方式和候選生物標(biāo)志物，MOUSSALLIEH等［34］用質(zhì)子磁共振光譜對47例MS患者、44例NMO患者和42位對照組患者血清進(jìn)行代謝組學(xué)分析，結(jié)果表明鞘肌醇和乙酸鹽分別是MS和NMO的可能血清生物標(biāo)志物。與對照組相比，在87.8%的MS患者中鞘肌醇增加了0.15～3倍，而在74.3%的NMO患者中，乙酸鹽增加了0.4～7倍，同時(shí)使用這兩種代謝物可以區(qū)分MS患者和NMO患者（敏感性為94.3%，特異性為90.2%）。PARK等［35］采用質(zhì)譜代謝物譜方法，從腦脊液樣本中尋找多發(fā)性硬化（MS）、視神經(jīng)脊髓炎（NMOSD）和特發(fā)性橫脊髓炎（ITM）的差異代謝物，結(jié)果表明，脂類、1-單甘肽和1-單硬脂酸分別是MS、NMOSD和ITM的特異代謝物。FRENCH等［36］將1NMR代謝組學(xué)應(yīng)用于萊姆病、西尼羅河病毒腦膜腦炎、多發(fā)性硬化等27例患者和25名健康對照者的CSF樣品，結(jié)果表明MS與其他疾病存在差異代謝物。這些結(jié)果初步表明，代謝組學(xué)作為快速篩查測試可能具有區(qū)分其他神經(jīng)炎性疾病的能力，從而增強(qiáng)診斷準(zhǔn)確性的潛在作用。

2.5預(yù)測治療反應(yīng)方面MS是一種需要長期服藥的疾病，且治療費(fèi)用較高。有些藥物可能對某些患者無效，需要一種手段預(yù)測治療的反應(yīng)，避免無效治療和不必要的花費(fèi)。中和抗藥物抗體（ADA）可大大降低用于治療多發(fā)性硬化患者生物藥物的療效。使用β-干擾素（IFN-β）治療的MS患者中，很多患者發(fā)展為ADA。一項(xiàng)研究對89例MS患者血清樣本進(jìn)行代謝組學(xué)分析，測定干擾素β治療前后代謝產(chǎn)物和ADA的變化。成為ADA+的患者在前3個(gè)月對干擾素β有明顯的代謝反應(yīng)，有29種不同的調(diào)節(jié)代謝物，結(jié)果表明血清代謝物是預(yù)測干擾素β治療的MS患者ADA發(fā)展的一個(gè)有前景的生物標(biāo)志物［37］。一項(xiàng)研究確定IFN-?對MS患者代謝組的影響，以探索可預(yù)測治療反應(yīng)的生物標(biāo)志物。研究入選了21名開始接受IFN-?治療的MS患者（44μg，每周皮下注射3次），在基線水平和治療6、12、24個(gè)月后獲得血液樣本，并通過高分辨率磁共振波譜分析代謝產(chǎn)物的變化。IFN給藥后，根據(jù)“無疾病活動(dòng)證據(jù)（無復(fù)發(fā)、殘疾進(jìn)展和磁共振成像活動(dòng)），將患者分為應(yīng)答者和無反應(yīng)者。結(jié)果表明，有反應(yīng)者和無反應(yīng)者代謝物在乳酸、丙酮、3-OH-丁酸、色氨酸和葡萄糖水平方面的差異［38］。有研究評估了富馬酸二甲酯（DMF）對MS患者代謝組學(xué)特征的影響，在開始DM之前和開始后6個(gè)月對18例MS患者的血漿使用代謝組學(xué)方法分析，磷脂、溶血磷脂和縮醛磷脂增加，循環(huán)游離脂肪酸減少。此外，脂肪酸水平的改變與淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)，特別是CD8+T細(xì)胞亞群之間觀察到很強(qiáng)的相關(guān)性，表明DMF誘導(dǎo)的脂質(zhì)代謝改變與免疫學(xué)變化有關(guān)［39］?？傊x組學(xué)方法似乎是一種有前途的工具，可能有助于預(yù)測MS治療的效果，從而實(shí)現(xiàn)更精確的特異性治療。

2.6治療靶點(diǎn)方面在一項(xiàng)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究中描述了膽汁酸代謝異常［40］，這可能歸因于膽汁酸通過調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥的神經(jīng)保護(hù)作用。NOTIKO等［41］的研究表明MS患者血液中膽汁酸代謝異常。最近的一項(xiàng)研究也表明膽汁酸代謝在MS中發(fā)生了改變，且膽汁酸的補(bǔ)充阻止了星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的極化，使神經(jīng)毒性表型和MS動(dòng)物模型的神經(jīng)病理學(xué)得到改善［42］。這些發(fā)現(xiàn)確定膽汁酸代謝失調(diào)是MS的潛在治療靶點(diǎn)，但由于樣本量小還需要更多的研究發(fā)現(xiàn)MS的治療靶點(diǎn)。

2.7其他方面對于MS代謝組學(xué)的研究多采用腦脊液、血液、尿液等生物學(xué)基質(zhì)。最近研究人員開發(fā)了一種新的LC-MS/MS方法，該方法可從眼淚中鑒定出極性脂質(zhì)、?；鈮A、游離肉堿和氨基酸，在MS患者中發(fā)現(xiàn)了30種淚脂生物標(biāo)志物，其中一些還存在于這些患者的CSF中。此外，其眼淚中酰基肉堿水平顯著增加［43］。這項(xiàng)研究表明其他基質(zhì)也可以用于MS代謝組學(xué)的研究。

單一組學(xué)方法有各自的優(yōu)勢，但也有局限性。近幾年一些學(xué)者開始用多組學(xué)方法預(yù)測與人類疾病相關(guān)的微生物功能和分子機(jī)制?；跉庀嗌V-質(zhì)譜法的快速、高靈敏度的檢測方法被用于脂肪酸的定量檢測，是研究腸道微生物群落參與代謝途徑的有效工具［44］。如最近利用16S rRNA測序和糞便代謝組數(shù)據(jù)，對RRMS、SPMS和與健康密切相關(guān)的疾?。℉CS）患者的腸道微生物和代謝組進(jìn)行比較。與HCS相比，每一患者組都有一些物種有明顯的變化，包括短鏈脂肪酸（SCFA）產(chǎn)生菌在MS中減少。與HCS相比，RRMS中丁酸和丙酸的生物合成明顯減少。硫代謝組學(xué)發(fā)現(xiàn)SPMS中半胱氨酸與半胱氨酸的比值增加，推測SPMS腸道內(nèi)存在過量的DNA氧化。腸生態(tài)環(huán)境和功能微環(huán)境在MS的不同階段發(fā)生了顯著的變化，尤其是RRMS中SCFA的生物合成減少，SPMS中的氧化水平升高是其特征［45-46］。將代謝組學(xué)技術(shù)與腸道微生物整合，來自人類腸道的微生物群落的生物活性化合物參與了與宿主的微調(diào)互聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，協(xié)調(diào)了各種生理過程。BLANCHET等［47］使用NMR代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)相結(jié)合，觀察到EAE所致大鼠腦脊液能量供應(yīng)和氨基酸代謝與T激肽原1、乳酸或肌醇、補(bǔ)體C3和銅藍(lán)蛋白的解除有關(guān)，闡明了蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)的一種新的融合方法在EAE中的應(yīng)用。這種多組學(xué)方法可能更好地了解疾病的病理生理及發(fā)病機(jī)制，制定新的治療方案。多組學(xué)技術(shù)尚屬于初步探索階段，需要進(jìn)一步進(jìn)行研究。

3 結(jié)論與展望

代謝組學(xué)作為一種較為新興的研究手段，發(fā)展已較為成熟，目前在MS血液、腦脊液等基質(zhì)中的研究已相對較多。今后可能會(huì)需要更大的樣本對MS的代謝組學(xué)進(jìn)行研究，或探索性地在其他基質(zhì)上進(jìn)行研究，且隨著檢測技術(shù)和生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，將代謝組學(xué)技術(shù)與其他技術(shù)相結(jié)合將會(huì)成為研究MS的熱點(diǎn)。