可可毛色二孢全基因組分泌蛋白的預(yù)測(cè)及分析

邢啟凱，李鈴仙，曹陽(yáng)，張瑋，彭軍波，燕繼曄，李興紅

可可毛色二孢全基因組分泌蛋白的預(yù)測(cè)及分析

邢啟凱1，李鈴仙1，曹陽(yáng)2，張瑋1，彭軍波1，燕繼曄1，李興紅1

（1北京市農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)環(huán)境保護(hù)研究所/北方果樹(shù)病蟲(chóng)害綠色防控北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100097；2大連理工大學(xué)生物工程學(xué)院，遼寧大連 116024）

【】可可毛色二孢（）是一種世界性分布的重要植物病原真菌，可引起嚴(yán)重的葡萄潰瘍?。˙otryosphaeria dieback），影響果木品質(zhì)并造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。本研究預(yù)測(cè)并分析可可毛色二孢基因組范圍內(nèi)的分泌蛋白，并明確其基本特征，為該病菌分泌蛋白致病機(jī)理的研究打下基礎(chǔ)。依據(jù)已公布的可可毛色二孢全基因組序列，利用信號(hào)肽預(yù)測(cè)軟件SignalP v5.0、跨膜結(jié)構(gòu)分析軟件TMHMM v2.0、細(xì)胞器定位分析軟件ProtComp v9.0、GPI錨定預(yù)測(cè)軟件big-PI Fungal Predictor和亞細(xì)胞器定位分析軟件TargetP v2.0生物信息學(xué)軟件對(duì)該菌中的典型分泌蛋白進(jìn)行篩選。對(duì)分泌蛋白N端信號(hào)肽的長(zhǎng)度、氨基酸使用頻率及其切割位點(diǎn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。依據(jù)蛋白序列的同源性，應(yīng)用BLASTP程序?qū)Ψ置诮M蛋白進(jìn)行功能注釋分析，預(yù)測(cè)其生物學(xué)功能。采用蔗糖酶缺陷的酵母分泌系統(tǒng)，對(duì)所選分泌蛋白的信號(hào)肽進(jìn)行活性檢測(cè)。利用qRT-PCR方法檢測(cè)所選分泌蛋白基因在可可毛色二孢侵染葡萄中的表達(dá)情況。在可可毛色二孢全基因組編碼蛋白中共篩選獲得552個(gè)潛在的具有典型信號(hào)肽的分泌蛋白，占全基因組預(yù)測(cè)蛋白總數(shù)的4.3%，其編碼蛋白長(zhǎng)度集中于101—400 aa。信號(hào)肽統(tǒng)計(jì)分析表明，其信號(hào)肽長(zhǎng)度以18—20 aa的序列最為集中，信號(hào)肽長(zhǎng)度為20 aa的蛋白數(shù)量最多。信號(hào)肽中使用頻率最高的氨基酸為丙氨酸；非極性、疏水的氨基酸使用頻率最高，占氨基酸總數(shù)的60.2%。其信號(hào)肽的-3至-1位置上的氨基酸相對(duì)保守，切割位點(diǎn)屬于A-X-A類型，可被Sp I型信號(hào)肽酶識(shí)別并切割。336個(gè)分泌蛋白具有功能注釋，其功能較多集中于細(xì)胞壁降解有關(guān)的酶類以及致病相關(guān)蛋白，并且這些蛋白在分子量、等電點(diǎn)、脂肪族氨基酸指數(shù)等方面均存在差異。通過(guò)蔗糖酶缺陷的酵母分泌系統(tǒng)證實(shí)，挑選的9個(gè)分泌蛋白信號(hào)肽均具有分泌活性。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果表明，所選分泌蛋白基因在該病菌侵染初期的表達(dá)發(fā)生變化。利用生物信息學(xué)分析技術(shù)從可可毛色二孢全基因組中共預(yù)測(cè)獲得552個(gè)經(jīng)典分泌蛋白。其信號(hào)肽氨基酸長(zhǎng)度分布廣泛，氨基酸組成中非極性、疏水的氨基酸使用頻率最高。功能注釋主要集中在細(xì)胞壁組分降解相關(guān)的酶類、致病侵染相關(guān)的壞死誘導(dǎo)相關(guān)蛋白以及幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白等。

葡萄潰瘍病；可可毛色二孢；生物信息學(xué)；分泌蛋白；信號(hào)肽；表達(dá)模式

0 引言

【研究意義】葡萄潰瘍?。˙otryosphaeria dieback）是葡萄（）生產(chǎn)上最重要的枝干病害之一，在世界葡萄主產(chǎn)區(qū)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。通常認(rèn)為，該類型病原真菌主要通過(guò)自然孔口或修剪傷口侵入，感病果木出現(xiàn)枝干潰瘍、果梗干枯、果實(shí)干縮、掉粒以及樹(shù)勢(shì)減弱等癥狀，更嚴(yán)重的會(huì)引起根腐，造成整株果木枯死[2]。至今，在我國(guó)葡萄產(chǎn)區(qū)共分離獲得6種葡萄座腔菌科（Botryosphaeriaceae）真菌可引起葡萄潰瘍病，其中優(yōu)勢(shì)種群為可可毛色二孢（）和葡萄座腔菌（），而致病力最強(qiáng)的為可可毛色二孢[3-5]。目前普遍使用化學(xué)藥劑防治葡萄潰瘍病，但至今沒(méi)有獲得低毒環(huán)保并能夠高效防治該病害的有效藥劑。病原真菌分泌蛋白（secreted protein）在病原真菌與宿主植物的互作中起著至關(guān)重要的作用，其直接影響病原菌的侵入、擴(kuò)展、定殖以及病害發(fā)生[6-7]。可可毛色二孢全基因組范圍內(nèi)分泌蛋白的篩選鑒定，將對(duì)揭示其致病機(jī)理，進(jìn)一步制定葡萄潰瘍病的防治新策略具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】分泌蛋白是指在病原菌體內(nèi)合成后，通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)/高爾基體等分泌途徑轉(zhuǎn)運(yùn)到宿主細(xì)胞質(zhì)膜外空間或細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮功能的蛋白分子[8-9]。經(jīng)典的分泌蛋白具有以下特征[10]：（1）氨基酸N端含有信號(hào)肽序列；（2）無(wú)糖基磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidylinositol，GPI）錨定位點(diǎn)；（3）沒(méi)有跨膜結(jié)構(gòu)域；（4）沒(méi)有將蛋白輸送至葉綠體、線粒體等胞內(nèi)細(xì)胞器的定位信號(hào)。研究表明，在病原真菌的侵入、擴(kuò)展和定殖等致病過(guò)程中，往往有大量的分泌蛋白參與其中，扮演著重要角色[11-12]。例如，在侵入宿主植物期間，病原真菌可以分泌大量的植物細(xì)胞壁降解酶、蛋白水解酶和代謝相關(guān)酶等酶類以及激發(fā)子蛋白，進(jìn)而降解植物細(xì)胞壁以及植物細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的碳氮化合物，一方面獲得營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供病原菌生長(zhǎng)，促使其在宿主中的侵入、定殖和擴(kuò)散；另一方面阻礙或抑制宿主植物的免疫系統(tǒng)，從而完成其致病過(guò)程[9,13]。病原物來(lái)源的分泌蛋白與宿主植物受體蛋白的識(shí)別和信號(hào)傳導(dǎo)研究是揭示病原物與宿主互作機(jī)制的關(guān)鍵點(diǎn)[14-15]，因而研究者完成了多種病原菌全基因組水平的分泌蛋白預(yù)測(cè)研究[16-21]，為其他病原菌分泌蛋白的預(yù)測(cè)及分析提供了參考。【本研究切入點(diǎn)】目前，關(guān)于葡萄潰瘍病的研究主要集中在病原真菌的種類鑒定、種群結(jié)構(gòu)、侵染過(guò)程以及毒素分泌等方面，關(guān)于其病原菌分泌蛋白的研究尚未報(bào)道。實(shí)驗(yàn)前期首先應(yīng)用SOAPdenovo組裝軟件對(duì)可可毛色二孢菌株CSS-01s進(jìn)行了測(cè)序組裝分析[13]，其全基因組大小為43.3 M，測(cè)序深度為90X，GC含量為54.77%[22]。通過(guò)組裝拼接共獲得60條contigs和29條scaffolds，并且通過(guò)基因軟件預(yù)測(cè)并與各數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)共注釋獲得12 902個(gè)蛋白序列[22]?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】在已公布的可可毛色二孢菌株CSS-01s全基因組信息的基礎(chǔ)上[22]，根據(jù)分泌蛋白典型特征，利用生物信息學(xué)在線程序進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，以期獲得所有可編碼經(jīng)典分泌蛋白的相關(guān)基因，為揭示葡萄與可可毛色二孢等葡萄座腔菌科真菌互作的分子機(jī)制，并進(jìn)一步持續(xù)有效地開(kāi)展葡萄潰瘍病的防控打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2018—2019年在北京市農(nóng)林科學(xué)院完成。

1.1 供試材料

供試可可毛色二孢菌株CSS-01s為課題組分離、單孢純化、鑒定并保存?？煽擅?2 902個(gè)蛋白序列來(lái)源于PRJNA339237（accession number SRP107819）[22]。一年生葡萄‘夏黑’（Summer Black）綠枝條由北京市林業(yè)果樹(shù)科學(xué)研究院提供。酵母信號(hào)序列誘捕載體pSUC2T7M13ORI（pSUC2）、對(duì)照載體和酵母菌株YTK12（suc2）由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院孫文獻(xiàn)教授提供。

1.2 分泌蛋白篩選程序

應(yīng)用SignalP v5.0[23]（http://www.cbs.dtu.dk/services/ SignalP/）軟件在線分析可可毛色二孢全基因組的蛋白序列是否含有N端信號(hào)肽以及該信號(hào)肽的切割位置；利用Protcomp v9.0[24]（http://www.softberry.com/）在線分析軟件進(jìn)行亞細(xì)胞定位，獲得其在亞細(xì)胞器的定位和分布；利用在線TMHMM v2.0[25]（http://www.cbs. dtu.dk/services/TMHMM/）軟件對(duì)候選序列的跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析；利用在線軟件big-PI Fungal Predictor[26]（http://mendel.imp.ac.at/gpi/fungi_server.html）實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的GPI錨定修飾位點(diǎn)的預(yù)測(cè)；使用在線程序TargetP v2.0[27]（http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）進(jìn)一步分析靶標(biāo)蛋白在亞細(xì)胞器中的定位和分布情況，以排除非胞外蛋白；利用LipoP v1.0[28]（http:// www.cbs.dtu.dk/services/LipoP/）在線軟件對(duì)分泌蛋白進(jìn)行信號(hào)肽酶識(shí)別位點(diǎn)的預(yù)測(cè)；利用ExPAS[29]（http://web.expasy.org/protparam/）在線軟件預(yù)測(cè)分泌蛋白的理化性質(zhì)。

1.3 分泌蛋白信號(hào)肽功能分析

1.3.1 載體構(gòu)建 參照J(rèn)acobs等[30-31]方法，用蔗糖酶缺陷的酵母分泌系統(tǒng)對(duì)預(yù)測(cè)的分泌蛋白信號(hào)肽的功能進(jìn)行分析驗(yàn)證。根據(jù)可可毛色二孢效應(yīng)子序列信息，用生物信息學(xué)在線程序SignalP v5.0進(jìn)行預(yù)測(cè)分析所選效應(yīng)子的信號(hào)肽區(qū)域，信號(hào)肽通常是位于蛋白質(zhì)N端、大小為40個(gè)氨基酸的多肽。依據(jù)該目的區(qū)段，利用Primer5.0在線程序設(shè)計(jì)載體構(gòu)建所需的特異性引物，并在引物5′和3′端分別添加R I和I酶切位點(diǎn)，保證目的片段可單方向插入功能質(zhì)粒。Trizol（Invitrogen）法提取可可毛色二孢的RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。以此為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)表1所選的9個(gè)候選分泌蛋白信號(hào)肽片段進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3 min；進(jìn)入95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸20 s，共32個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。所用引物見(jiàn)表1，引物由上海生工生物工程有限公司合成。用R I和I酶切PCR片段，將回收產(chǎn)物連接到pSUC2相同的酶切位點(diǎn)間，隨后對(duì)克隆進(jìn)行PCR篩選鑒定，最后將重組質(zhì)粒送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

1.3.2 酵母感受態(tài)的制備與載體轉(zhuǎn)化 依照Frozen- EZ Yeast Transformation II kitTM（Zymo Research，Orange，CA，USA）提供的方法制備蔗糖酶缺陷型酵母YTK12菌株的感受態(tài)，具體方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。將酵母YTK12菌株在YPDA平板上劃線，30℃培養(yǎng)3—5 d；挑單斑至YPDA液體培養(yǎng)基搖培，直到OD600=0.7—0.8，收集菌液，用E1懸浮；再次離心倒掉上清，加入500 μL的E2，即為制備好的YTK18感受態(tài)，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將構(gòu)建好的載體、陽(yáng)性對(duì)照載體pSUC2-Avr1b以及陰性對(duì)照載體pSUC2-Mg87分別轉(zhuǎn)化到酵母YTK18感受態(tài)中，涂到CMD-W培養(yǎng)基（0.67%不含氨基酸的酵母氮源、0.075%色氨酸一缺培養(yǎng)基、0.1%葡萄糖、2%蔗糖和2%瓊脂）上培養(yǎng)3—5 d。將篩選獲得的轉(zhuǎn)化子劃線到Y(jié)PRAA培養(yǎng)基（1%酵母提取物、2%蛋白胨、2 μg·L-1的抗霉素A、2%棉籽糖和2%瓊脂）上培養(yǎng)3—5 d，通過(guò)觀察酵母菌在YPRAA上的生長(zhǎng)狀況來(lái)判斷所選分泌蛋白的信號(hào)肽是否具有分泌功能。

表1 分泌蛋白信號(hào)肽活性測(cè)定載體構(gòu)建引物序列

1.4 可可毛色二孢侵染下分泌蛋白基因的表達(dá)分析

參考Yan等[3,22]接種葡萄座腔病菌的方法，用可可毛色二孢CSS-01s菌株接種一年生葡萄‘夏黑’綠枝條，于接種后0、6和12 h取接種點(diǎn)0.5—2 cm葡萄枝條表皮，液氮凍存后于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。組織經(jīng)液氮充分研磨后，用EASYspin Plus多糖多酚復(fù)雜植物RNA提取試劑盒（艾德萊生物）提取總RNA，經(jīng)DNase I（TaKaRa）處理后，用SuperScript III反轉(zhuǎn)錄酶（Invitrogen）反轉(zhuǎn)錄得到第一鏈cDNA，-20℃保存，用于后續(xù)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析（qRT-PCR）。依據(jù)全基因組預(yù)測(cè)的分泌蛋白序列設(shè)計(jì)特異性引物（表2），以（KAB2581229.1）作為內(nèi)參基因，進(jìn)行qRT-PCR分析。采用SYBR Green I熒光染料法，試驗(yàn)過(guò)程參照TaKaRa說(shuō)明書(shū)。20 μL反應(yīng)體系：2×TB GreenII（Tli RNaseH Plus）10 μL，正反引物（0.5 μmol·L-1）3.5 μL，cDNA 0.5 μL，ROX Reference Dye II 0.5 μL，補(bǔ)水至總體積為20 μL。qRT-PCR在ABI7500儀器上進(jìn)行。反應(yīng)程序：95℃ 5 min；進(jìn)入95℃ 30 s，60℃ 30 s，共45個(gè)循環(huán)。每個(gè)反應(yīng)得到相應(yīng)的Ct值。每個(gè)樣品進(jìn)行3個(gè)平行反應(yīng)，取均值后，用2-ΔΔCt方法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 可可毛色二孢全基因組水平的分泌蛋白篩選鑒定

基于可可毛色二孢全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)[22]，對(duì)12 902條蛋白序列，通過(guò)SignalP v5.0[23]預(yù)測(cè)得到937個(gè)在氨基端含有典型信號(hào)肽序列的蛋白，占全基因組蛋白序列總數(shù)的7.26%。隨后以ProtComp v9.0[24]在線程序?qū)@937個(gè)含有信號(hào)肽的蛋白序列的細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，結(jié)果如圖1所示，共有685個(gè)蛋白可轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外，是胞外分泌蛋白類型，占比73%；另有252個(gè)蛋白未分泌到細(xì)胞外，其中最多的72個(gè)蛋白序列轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)膜（7.7%），其次是轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體（7.5%）、溶酶體（3%）和細(xì)胞質(zhì)（2.9%）；另外轉(zhuǎn)運(yùn)至過(guò)氧化酶體、細(xì)胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和液泡的共有39個(gè)，占比4.2%。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR所用引物序列

為了排除含有跨膜結(jié)構(gòu)域的蛋白序列，通過(guò)TMHMM v2.0在線軟件[25]對(duì)氨基端含有典型信號(hào)肽的蛋白序列進(jìn)行跨膜螺旋結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果如圖2所示，該685個(gè)蛋白序列中，有576個(gè)蛋白序列不含跨膜結(jié)構(gòu)域，占比84.1%；有98個(gè)蛋白序列只含有1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，占比14.3%；其余11個(gè)蛋白序列含有2—3個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，占比1.6%。

圖1 可可毛色二孢中937個(gè)具有信號(hào)肽蛋白的亞細(xì)胞定位

圖2 可可毛色二孢中685個(gè)外泌蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域分析

為了在預(yù)測(cè)蛋白中將這一部分蛋白去除，對(duì)576個(gè)蛋白序列進(jìn)一步應(yīng)用big-PI Fungal predictor[26]在線軟件進(jìn)行GPI錨定位點(diǎn)預(yù)測(cè)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)552個(gè)蛋白序列不具有GPI錨定位點(diǎn)，而24個(gè)蛋白含有GPI錨定位點(diǎn)。通過(guò)對(duì)以上552個(gè)非GPI錨定蛋白序列測(cè)試發(fā)現(xiàn)，這552個(gè)測(cè)試蛋白序列均具有胞外分泌途徑信號(hào)肽（SP）。

綜合運(yùn)用上述5種生物信息學(xué)算法程序，對(duì)可可毛色二孢全基因組12 902個(gè)蛋白序列進(jìn)行預(yù)測(cè)篩選，最終獲得552個(gè)具有信號(hào)肽、不含有跨膜結(jié)構(gòu)域和GPI錨定位點(diǎn)并可外泌到細(xì)胞外的具有典型特征的經(jīng)典分泌蛋白，占全基因組預(yù)測(cè)蛋白總數(shù)的4.3%。

2.2 可可毛色二孢中分泌蛋白的信號(hào)肽特征

在552個(gè)具有分泌蛋白信號(hào)肽的蛋白序列中，蛋白序列長(zhǎng)度最小的是66 aa，最大的長(zhǎng)度是2 269 aa，大多集中于101—400 aa，占蛋白序列總數(shù)的54.5%（圖3），上述結(jié)果表明，可可毛色二孢中所預(yù)測(cè)的典型分泌蛋白多屬于小型蛋白。

信號(hào)肽氨基酸長(zhǎng)度統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖4所示，候選分泌蛋白的信號(hào)肽長(zhǎng)度多集中在18—20 aa，有253個(gè)，占預(yù)測(cè)分泌蛋白總數(shù)的45.8%；其中，含信號(hào)肽長(zhǎng)度為20 aa的蛋白數(shù)量最多，有91個(gè)，占比16.5%。關(guān)于候選分泌蛋白的信號(hào)肽酶識(shí)別位點(diǎn)，利用LipoP v1.0[28]在線程序進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，結(jié)果表明含有Sp I型信號(hào)肽識(shí)別位點(diǎn)的分泌蛋白序列有522個(gè)，占比94.6%；另有10個(gè)分泌蛋白含有Sp II型信號(hào)肽識(shí)別位點(diǎn)，2個(gè)含有CYT型信號(hào)肽識(shí)別位點(diǎn)。以上結(jié)果說(shuō)明大部分的可可毛色二孢候選分泌蛋白是通過(guò)Sp I型信號(hào)肽酶識(shí)別并切割掉信號(hào)肽。

進(jìn)一步對(duì)20種氨基酸在候選分泌蛋白信號(hào)肽區(qū)段中的使用頻率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果如圖5所示，在組成信號(hào)肽的20種氨基酸中，有129個(gè)丙氨酸（A），數(shù)量最多，占分泌蛋白總數(shù)的23.4%；其次為亮氨酸（L），數(shù)量為106個(gè)，占全部的19.2%；非極性、疏水的氨基酸使用頻率最高（A、G、I、L、P和V），占蛋白總數(shù)的60.2%；其次是極性、不帶電荷的氨基酸（C、M、N、Q、S和T），占全部的27.2%；帶正電荷的堿性氨基酸（K、R和H）所占比例為5.2%；帶負(fù)電荷的酸性氨基酸（A和E）占23.7%；芳香族氨基酸（W、F和Y）占6.8%。

圖3 可可毛色二孢典型分泌蛋白的序列長(zhǎng)度

圖4 可可毛色二孢分泌蛋白的信號(hào)肽長(zhǎng)度分布

圖5 可可毛色二孢分泌蛋白氨基酸使用頻率

對(duì)可可毛色二孢候選分泌蛋白信號(hào)肽切割位點(diǎn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果如表3所示，在信號(hào)肽和成熟分泌蛋白切割位點(diǎn)-3、-2、-1、1、2、3位最多的氨基酸分別為A、L、A、A、P、T，所占比例分別為47.0%、16.4%、73.0%、27.3%、27.9%、14.0%。位于信號(hào)肽切割位點(diǎn)之前的-3、-2、-1位的氨基酸組成為A-S-A，屬于比較典型的A-X-A類型，可被Sp I型信號(hào)肽酶識(shí)別并切割，這與LipoP v1.0預(yù)測(cè)的結(jié)果相一致。

表3 可可毛色二孢分泌蛋白信號(hào)肽切割位點(diǎn)的氨基酸組成分布

2.3 可可毛色二孢全基因組候選分泌蛋白的功能預(yù)測(cè)

將預(yù)測(cè)的可可毛色二孢候選分泌蛋白在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，216個(gè)分泌蛋白描述為功能未知的推定蛋白，其余336個(gè)則有明確的功能描述。在已有功能描述的這些分泌蛋白中，注釋功能主要集中在細(xì)胞壁組分降解相關(guān)的酶類，如蛋白酶、糖基水解酶、纖維素酶、角質(zhì)酶、果膠裂解酶等，占比41.7%；此外還有CFEM結(jié)構(gòu)域蛋白、FAD結(jié)合結(jié)構(gòu)域蛋白、LysM結(jié)構(gòu)域蛋白等結(jié)構(gòu)域蛋白，以及與致病侵染相關(guān)的壞死誘導(dǎo)相關(guān)蛋白以及幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白等（表4）。并且上述候選分泌蛋白在序列長(zhǎng)度、等電點(diǎn)、分子量和脂肪族氨基酸指數(shù)等方面均存在差異，推測(cè)其可能參與不同的生理活動(dòng)。

2.4 分泌蛋白預(yù)測(cè)信號(hào)肽的生物學(xué)功能分析

借助pSUC2系統(tǒng)[30-31]驗(yàn)證候選分泌蛋白的信號(hào)肽是否具有分泌功能。SUC2編碼一個(gè)果糖苷酶，可將蔗糖、棉籽糖等多糖酶解生成葡萄糖、果糖等單糖。將9個(gè)候選可可毛色二孢分泌蛋白信號(hào)肽融合至SUC2蛋白的氨基端，轉(zhuǎn)至酵母突變體YTK12中，若pSUC2融合載體成功轉(zhuǎn)化到酵母中，則能在CMD-W培養(yǎng)基中正常生長(zhǎng)。隨后挑去生長(zhǎng)的單斑，在棉籽糖培養(yǎng)基（YPRAA）上劃線，若預(yù)測(cè)的分泌蛋白信號(hào)肽能夠引導(dǎo)SUC2向胞外分泌，則可分泌到酵母細(xì)胞外將YPRAA培養(yǎng)基中的棉籽糖分解成單糖，酵母突變體就能正常生長(zhǎng)，反之，則不會(huì)生長(zhǎng)。結(jié)果如圖6所示，陰性對(duì)照Mg87酵母菌不能在YPRAA培養(yǎng)基上存活，陽(yáng)性對(duì)照Avr1b的酵母菌可以在YPRAA培養(yǎng)基生長(zhǎng)，而預(yù)測(cè)的9個(gè)分泌蛋白融合載體轉(zhuǎn)化的酵母可在YPRAA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，表明上述分泌蛋白信號(hào)肽具有分泌活性，是典型的分泌蛋白。

表4 可可毛色二孢部分分泌蛋白生化特性與功能注釋

2.5 可可毛色二孢候選分泌蛋白基因的表達(dá)分析

在可可毛色二孢侵染初期，和的表達(dá)是持續(xù)下降的趨勢(shì)；在接種6 h后的表達(dá)量是接種0 h的2.5倍，隨后表達(dá)下調(diào)；、、、和的表達(dá)持續(xù)上調(diào)；而在接種12 h才表現(xiàn)出誘導(dǎo)表達(dá)（圖7）。結(jié)果表明，上述分泌蛋白可能在可可毛色二孢的侵染初期發(fā)揮一定的作用。

3 討論

在與宿主植物的協(xié)同進(jìn)化過(guò)程中，病原真菌衍化出多種攻擊宿主的策略[11,32]。病原菌會(huì)通過(guò)分泌大量蛋白質(zhì)來(lái)干擾宿主細(xì)胞功能并誘導(dǎo)其免疫反應(yīng)，從而促進(jìn)病原菌的侵染[14,33]。因此，利用全基因組測(cè)序信息，研究不同病原菌中分泌蛋白的數(shù)量、類型和特征以探究其致病機(jī)理尤為重要[34-36]。葡萄座腔病菌全基因組測(cè)序的完成和公布為該菌激發(fā)子、致病蛋白和效應(yīng)子以及與宿主葡萄的互作研究提供了重要的數(shù)據(jù)支撐[22]?；诓≡婢置诘鞍椎牡湫徒Y(jié)構(gòu)特征，周曉罡等利用生物信息學(xué)分析軟件已對(duì)病原真菌以及卵菌等的分泌蛋白進(jìn)行了預(yù)測(cè)[17-21]。本文基于以上研究，運(yùn)用5種生物學(xué)軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，保證了測(cè)試結(jié)果的準(zhǔn)確性。LIU等研究表明，在侵染過(guò)程中，大豆疫霉（）分泌蛋白PsIsc1和大麗輪枝菌（）分泌蛋白VdIsc1可作為水解酶分解宿主植物的異分支酸合酶，破壞宿主的水楊酸代謝途徑，終止水楊酸介導(dǎo)的免疫反應(yīng)從而使宿主更為感病[35]。值得關(guān)注的是，上述2種分泌蛋白均缺乏分泌信號(hào)肽。因此，對(duì)真菌分泌蛋白的篩選鑒定，不僅需要通過(guò)生物信息學(xué)的手段并結(jié)合生物學(xué)試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，還需要結(jié)合雙向電泳（2-DE）和質(zhì)譜為基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)組學(xué)等技術(shù)進(jìn)行多維度的挖掘[36]。

圖6 分泌蛋白信號(hào)肽功能驗(yàn)證

圖7 9個(gè)候選分泌蛋白基因在可可毛色二孢侵染過(guò)程中的相對(duì)表達(dá)量

基于可可毛色二孢全基因組的12 902個(gè)蛋白序列，本研究預(yù)測(cè)得到552個(gè)經(jīng)典分泌蛋白，占比4.3%。大多數(shù)候選分泌蛋白屬于小型蛋白（圖3），其信號(hào)肽長(zhǎng)度多集中在18—20 aa（圖4），能夠被Sp I型信號(hào)肽識(shí)別并切割，這與前人所報(bào)道的有關(guān)植物病原真菌、卵菌等分泌蛋白無(wú)明顯差異[16-21]。分泌蛋白信號(hào)肽切割位點(diǎn)-3—+3位使用頻率最多是A、L、A、A、P、T（表3），切割位點(diǎn)上氨基酸使用種類較大麗輪枝菌[16]要多。切割位點(diǎn)-3和-1位的氨基酸使用種類最少，分別是16和18種（表3），這也與其他病原菌不同[17-21]。氨基酸使用頻率變化最大的在-1位，范圍從0（H，組氨酸；I，異亮氨酸）到73%（A，丙氨酸），與大麗輪枝菌、馬鈴薯晚疫病菌（）情況類似[16-21]，說(shuō)明這一切割位點(diǎn)位置的保守性。

對(duì)于可可毛色二孢候選分泌蛋白功能注釋分析發(fā)現(xiàn)，39%預(yù)測(cè)為功能未知的假定蛋白，說(shuō)明該菌候選蛋白的特異性，其功能有待于進(jìn)一步驗(yàn)證分析。植物病原真菌可能最初分泌細(xì)胞壁降解酶類來(lái)消化細(xì)胞壁的阻礙，以促進(jìn)其侵入[37]。在有功能描述的候選分泌蛋白中（表4），其功能主要集中于降解細(xì)胞壁組分的酶類，如纖維素酶、果膠裂解酶和果膠酶等，這與其他病原真菌分泌蛋白的功能相似[17-21]。此外，預(yù)測(cè)有LysM結(jié)構(gòu)域蛋白、幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白、壞死誘導(dǎo)蛋白等蛋白（表4），這些蛋白可能參與了可可毛色二孢的致病過(guò)程[38-39]。隨后，借助于pSUC2系統(tǒng)[30-31]對(duì)所選分泌蛋白信號(hào)肽進(jìn)行了功能驗(yàn)證，隨機(jī)挑選的9個(gè)候選蛋白信號(hào)肽均正常發(fā)揮作用，說(shuō)明本研究預(yù)測(cè)方法的精準(zhǔn)度較高（圖6）。進(jìn)一步通過(guò)qPCR表達(dá)分析（圖7），驗(yàn)證了候選分泌蛋白基因在可可毛色二孢侵染初期不同的表達(dá)模式，推測(cè)其在病原菌致病過(guò)程中發(fā)揮著不同的作用。

4 結(jié)論

基于病原真菌分泌蛋白具有的典型特征，利用在線生物信息學(xué)程序從可可毛色二孢全基因組中共預(yù)測(cè)獲得552個(gè)經(jīng)典分泌蛋白，多屬于小型蛋白。其信號(hào)肽氨基酸長(zhǎng)度分布廣泛，氨基酸組成中非極性、疏水的氨基酸使用頻率最高。功能注釋主要集中在細(xì)胞壁組分降解相關(guān)的酶類、與致病侵染相關(guān)的壞死誘導(dǎo)相關(guān)蛋白以及幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白等。

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Prediction and analysis of Candidate Secreted Proteins from the Genome of

XING QiKai1, LI LingXian1, Cao Yang2, ZHANG Wei1, PENG JunBo1, YAN JiYe1, LI XingHong1

(1Institute of Plant and Environment Protection, Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences/Beijing Key Laboratory of Environment Friendly Management on Fruit Diseases and Pests in North China, Beijing 100097;2School of Biological Engineering, Dalian University of Technology, Dalian 116024, Liaoning)

【】is an important phytopathogenic fungus with a worldwide distribution. This species causes severe Botryosphaeria dieback on a wide range of woody plants, which leads to reduced crop quality and tremendous economic losses. The objective of this study is to predict and analyze the candidate secreted proteins in the genome of, clarify their basic characteristics, so as to lay a foundation for the study of the pathogenic mechanism of secreted proteins in this pathogen.【】The signal peptide prediction algorithm SignalP v5.0 and subcellular localization prediction algorithm ProtComp v9.0, transmembrane helix prediction algorithm TMHMM v2.0, GPI-anchoring site prediction algorithm big-PI Fungal Predictor, and subcellular protein location distribution algorithm TargetP v2.0 were used to analyze 12 902 protein sequences ofpublished in the previous study. The basic features including the length of the N-terminal signal peptide, the frequency of amino acid usage and cleavage site of the predicted secreted proteins were statistically analyzed. Based on the homology of the protein sequence, biological function annotation of the predicted secreted proteins was clarified by using BLASTP program. The activity of the signal peptide of the selected secreted proteins was detected by yeast secretion and cell translocation assays. Expression patterns of the selected secreted protein genes duringinfection were analyzed by qRT-PCR technology.【】In this study, 522 secreted proteins were verified, accounting for 4.3% of the total proteins present in the genome of. The lengths of amino acids of secreted proteins were ranged from 101 to 400 aa. The distribution length of signal peptides was from 18 to 20 aa and the largest number was 20 aa. The top frequent amino acid was alanine in the signal peptides, and the most frequently incorporated amino acids were non-polar and hydrophobic, accounting for 60.2% of the total amino acids. Further, the amino acids in the position -3 to -1 in the signal peptides were relatively conserved and the signal peptide cleavage site belonged to A-X-A type, which could be recognized and cleaved by Sp I type peptidase. Among them, 336 secreted proteins were identified with a predictive function, which was mostly enzymatic or virulence-associated protein. Besides, there are differences in terms of molecular weight, isoelectric point, the aliphatic index in the candidate secreted proteins.Finally, the predicted signal peptides of the 9 putativesecreted proteins were confirmed to have secretory activity by using a yeast invertase secretion assay. qRT-PCR analysis demonstrated that the expression of selected protein genes was differentially regulated during host infection.【】A total of 552 candidate secreted proteins ofwere predicted by a set of computer algorithms. Lengths of the signal peptides vary greatly and the most frequently are mainly non-polar and hydrophobic amino acids. Secreted proteins characterized in this study can be categorized under enzymes related to the degradation of cell wall components, necrosis induction proteins, and chitin-binding proteins which may play an important role inpathogenetic mechanism.

Botryosphaeria dieback;; bioinformatics; secreted protein; signal peptide; expression pattern

10.3864/j.issn.0578-1752.2020.24.006

2020-02-14；

2020-03-20

國(guó)家自然科學(xué)基金（31801686）、北京市自然科學(xué)基金（6184041）、北京市農(nóng)林科學(xué)院科技創(chuàng)新能力建設(shè)（KJCX20190406）

邢啟凱，E-mail：qikaixing@163.com。通信作者李興紅，Tel：010-51503510；E-mail：lixinghong1962@163.com

（責(zé)任編輯 岳梅）