中國春小麥肌醇磷脂依賴的磷脂酶C基因的全基因組鑒定及表達分析

司旭陽，賈嘵瑋，張洪艷，賈羊羊，田士軍，張科，潘延云

中國春小麥肌醇磷脂依賴的磷脂酶C基因的全基因組鑒定及表達分析

司旭陽1，賈嘵瑋1，張洪艷1，賈羊羊1，田士軍1，張科2，潘延云1

（1河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/河北省植物生理與分子病理學(xué)重點實驗室，河北保定 071000；2河北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/省部共建華北作物改良與調(diào)控國家重點實驗室/河北省作物生長調(diào)控實驗室，河北保定 071001）

【】探知小麥基因組序列中肌醇磷脂依賴的磷脂酶C（PLC）的編碼基因，解析小麥中PLC基因的結(jié)構(gòu)與進化特征，揭示TaPLC基因在小麥各組織中的表達模式及其響應(yīng)鹽脅迫和干旱脅迫過程中的表達規(guī)律，以便深入分析小麥TaPLC基因調(diào)節(jié)小麥應(yīng)答鹽或干旱脅迫中的生理作用?；贓nsembl Plants全基因組數(shù)據(jù)庫，以水稻和擬南芥PLC基因為參考序列，檢索小麥TaPLC基因家族（http://plants.ensembl.org/index.html），并利用在線蛋白結(jié)構(gòu)分析工具（Pfam、CDD和SMART）對TaPLC基因進行結(jié)構(gòu)分析和鑒定；運用ExPASy（http://cn.expasy.org/tools）分析TaPLC基因的分子和生化特征；使用WoLF PSORT（https://www.genscript.com/wolf-psort.html）預(yù)測TaPLC基因的亞細胞定位；運用MEGA 7.0軟件進行系統(tǒng)進化樹分析；并利用實時熒光定量PCR分析TaPLC基因在不同組織以及幼苗期在鹽或干旱脅迫下的表達特征。在小麥基因組中鑒定了11個TaPLC基因序列，其編碼蛋白與其他植物PLC結(jié)構(gòu)相似，均具有X和Y保守催化結(jié)構(gòu)域以及C2結(jié)構(gòu)域；系統(tǒng)進化分析表明11個TaPLC基因可分為4組，即、、、，均為植物PLC基因家族的直系同源基因，在進化方面具有保守性，但也存在一定的分歧；通過與小麥祖先種比對分析，發(fā)現(xiàn)B亞基因組中的在異源六倍體形成前就已經(jīng)缺失，進一步表明小麥亞基因組間進化的不對稱性；亞細胞定位預(yù)測TaPLC基因定位于葉綠體、線粒體或細胞質(zhì)中；TaPLC基因家族各成員的啟動子普遍存在植物激素響應(yīng)和應(yīng)激響應(yīng)相關(guān)的順式調(diào)控元件；實時定量結(jié)果表明，不同的TaPLC基因在不同的組織中有不同的表達水平，其主要在根、葉、穗和籽粒中表達；且多數(shù)基因參與小麥對鹽和干旱脅迫的響應(yīng)，無論是在耐旱和耐鹽品種中，還是在對照品種中，TaPLC基因均受到脅迫的誘導(dǎo)表達，并在12 h內(nèi)迅速達到峰值。在小麥基因組中共鑒定11個TaPLC基因，編碼典型的植物PLC蛋白，在進化上具有保守性，但亞基因組間也存在進化的不對稱性。不同的TaPLC基因有各自的組織和細胞表達特征，在小麥生長發(fā)育過程中起調(diào)節(jié)作用；TaPLC基因在應(yīng)答鹽或干旱脅迫中起重要作用。

小麥；肌醇磷脂依賴的磷脂酶C；鹽脅迫；干旱脅迫

0 引言

【研究意義】小麥（）是世界上最重要的作物之一。隨著世界人口的不斷增長，糧食安全已成為一個主要問題。干旱、土壤鹽分以及極端溫度等滲透脅迫是影響植物生長最主要的不利環(huán)境[1-2]。植物肌醇磷脂信號系統(tǒng)在應(yīng)答滲透脅迫，調(diào)節(jié)植物生長中發(fā)揮著重要的作用[3-4]。肌醇磷脂依賴性磷脂酶C（phosphatidylinositol-dependent phospholipase，PI-PLC，簡稱為PLC）是肌醇磷脂信號系統(tǒng)中的關(guān)鍵酶之一[3-4]，研究小麥基因組中編碼PLC的基因及其功能對于澄清小麥在脅迫中的應(yīng)答反應(yīng)和改良小麥在不利環(huán)境中的生長都有重要的理論和應(yīng)用價值[1,3]?！厩叭搜芯窟M展】在哺乳動物中已鑒定出5種PLC亞型，即β、γ、δ、ε和ζ，被激活的PLC可以水解質(zhì)膜上的4,5-磷酸磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate，PIP2）產(chǎn)生二酰甘油（diacylglycerol，DAG）和三磷酸肌醇（inositol 1,4,5-trisphosphate，IP3）雙信使分子，分別激活蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）和釋放胞內(nèi)鈣庫Ca2+，進而調(diào)控一系列靶蛋白和靶酶的活性，參與細胞生長、增殖、代謝、分泌、收縮等發(fā)育過程和生理過程的調(diào)節(jié)[2]。植物PLC的研究始于20世紀(jì)80年代，目前已經(jīng)在多個物種——擬南芥[5]、大豆[6]、煙草[7-8]、水稻[9]、馬鈴薯[10]、玉米[11]、百合[12]和綠豆[13-14]中克隆獲得PLC基因序列。每個植物物種幾乎都由多個PLC基因組成基因家族，而各個成員可能參與不同的生理過程。以擬南芥為例，其基因組編碼9個AtPLC家族成員（—），其中可能編碼質(zhì)膜相關(guān)蛋白[15]，并負調(diào)控幼苗對鹽的耐受性[16]。是組成型表達基因，其不僅參與對幼苗生長發(fā)育和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)控[17]，而且還通過生長素信號調(diào)節(jié)雌雄配子體的發(fā)育[18]。參與初級和次級根的生長調(diào)控，其過表達提高了植物的抗旱性[19]。也參與了根系的發(fā)育[20]，和的過表達都可增加植物對干旱的耐受性，并在ABA調(diào)控的種子萌發(fā)和氣孔運動中發(fā)揮作用[20-21]。【本研究切入點】與動物PLC不同，目前發(fā)現(xiàn)的植物PLC結(jié)構(gòu)均與動物中最簡單的PLC ζ亞型相似。植物PLC的作用模式與動物也不相同，植物細胞中缺乏受IP3調(diào)控的受體，IP3被進一步磷酸化形成六磷酸肌醇（inositol hexaphosphate，IP6），參與細胞內(nèi)鈣信號形成，但具體的作用機制尚不清楚；植物中目前也沒有鑒定出PKC的同源類似物，DAG可用于磷脂的再生或繼續(xù)被磷酸化形成磷脂酸（phosphatidic acid，PA），而PA被認(rèn)為是植物特有的第二信使，調(diào)節(jié)植物的多種生理過程，但是目前也只鑒定了少數(shù)的PA結(jié)合蛋白，且蛋白與PA互作的結(jié)構(gòu)域尚未確定[3,22-24]。因此，需要更廣泛地分析植物PLC基因的功能，以詮釋其作用機制。小麥TaPLC的研究起始較早，1987年，就在小麥根細胞的質(zhì)膜中檢測到PLC活性[25]；1992年檢測了小麥PLC酶活性的生化特征[26-27]。但目前僅有2個TaPLC基因被克隆，即和（GenBank：HM754654.1和HM754653.1），初步結(jié)果顯示這兩個基因在調(diào)節(jié)小麥幼苗生長中發(fā)揮著作用且表達受到鹽或干旱的誘導(dǎo)[28]。基于小麥為異源六倍體的特征以及植物中PLC基因多是以多基因家族形式存在，小麥基因組中應(yīng)該還有其他的TaPLC基因序列?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究通過全面檢索小麥基因組，獲得全部TaPLC基因序列，明確其結(jié)構(gòu)、表達模式和進化特征，并檢測TaPLC基因在各種組織中以及在干旱或鹽脅迫下的表達模式，為全面探究TaPLC基因家族成員的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

所用小麥品種有中國春，洛旱7#（LD）為抗旱小麥品種，科農(nóng)199（KD）為對照小麥品種，小偃60#（XS）為耐鹽小麥品種，石麥15#（SS）為對照小麥品種。

選取小麥兩葉一心期的根、葉以及成熟后的莖、穗等材料，液氮速凍后，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

小麥在霍氏培養(yǎng)液水培至兩葉一心期時，分別移至20% PEG 6000和200 mmol·L-1NaCl的培養(yǎng)液中，于0、0.5、1、2、6、12、24和48 h取葉片，液氮速凍后，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 TaPLC基因的鑒定

首先利用已知的水稻和擬南芥的PLC蛋白序列在全基因組數(shù)據(jù)庫（Ensembl Plants）中查詢小麥中的PLC同源基因的序列信息（http://plants.ensembl.org/ index.html）。將檢索結(jié)果為PLC-like的蛋白序列分別利用Pfam（http://xfam.org/）、CDD（https://www.ncbi. nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）和SMART（http:// smart.embl-heidelberg.de/）驗證蛋白序列是否含有PLC結(jié)構(gòu)保守域（X、Y和C2結(jié)構(gòu)域），含有這3個保守域的序列被認(rèn)定為小麥TaPLC基因序列。

1.3 基因的染色體定位及序列分析

利用Ensembl Plants網(wǎng)站查詢TaPLC基因在染色體上的定位；利用在線工具ExPASy（http://cn.expasy. org/tools）分析TaPLC蛋白的分子和生化特征（如分子量和等電點等）；利用MEME獲得TaPLC基因基序，并利用Evolview繪制基因結(jié)構(gòu)和基序示意圖；在SMART和Pfam中得到TaPLC蛋白結(jié)構(gòu)域，并在IBS軟件中繪圖；利用PLACE（http://www.dna.affrc.go.jp/ PLACE/）和Plant CARE（http://bioinformatics.psb.ugent. be/webtools/plantcare/html/）分析TaPLC基因啟動子區(qū)的順式作用元件。

1.4 多序列比對及進化分析

利用DNAMAN軟件對TaPLC蛋白序列進行多序列比對。為了研究不同物種PLC之間的進化關(guān)系，從NCBI下載擬南芥、水稻、大豆等物種PLC氨基酸序列，用Clustal W進行多序列比對，然后用MEGA 7.0采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap值設(shè)置為1 000。利用Evolview在線軟件對進化樹進行優(yōu)化處理。

1.5 基因的表達分析

利用在線軟件WoLF PSORT（https://www.genscript. com/wolf-psort.html）預(yù)測TaPLC蛋白的亞細胞定位；利用The Triticeae Multi-omics Center在線小麥表達數(shù)據(jù)庫（http://202.194.139.32/expression/index.html? tdsourcetag=s_pcqq_aiomsg）以及URGI網(wǎng)站中Wheat Expression Browser（http://www.wheat-expression.com），選擇Chinese Spring cv-1 Development，輸入gene ID（電子附表1），獲得TaPLC基因在根、莖、葉、穗和籽粒的表達數(shù)據(jù)（TPM值），利用R-3.6.3繪制熱圖。

利用qRT-PCR的方法檢測和驗證部分TaPLC基因的表達。首先利用檢索到的TaPLC基因序列信息，以cDNA為模板擴增基因全長，并測序，進而根據(jù)序列信息設(shè)計區(qū)別于其他旁系同源基因的特異性定量引物（電子附表2）。

將所取材料研磨成粉末，提取總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用于實時熒光定量PCR檢測。以為內(nèi)參基因，qRT-PCR的反應(yīng)體系為模板1/3 μL、2×AceQ qPCR SYBR Green Master Mix 10 μL、上下游引物各0.5 μL（10 μmol·L-1），ddH2O補至20 μL，每個樣品進行3次技術(shù)重復(fù)。反應(yīng)程序為95℃5 min；95℃ 10 s，60℃ 30 s，40個循環(huán)，繪制融解曲線，95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃ 15 s。利用2-ΔΔCT法分析數(shù)據(jù)，試驗設(shè)計3個生物學(xué)重復(fù)。

2 結(jié)果

2.1 小麥TaPLC基因家族成員的鑒定

為了全面鑒定小麥TaPLC基因家族成員，利用擬南芥AtPLC基因和水稻OsPLC基因的編碼蛋白序列信息對小麥基因組數(shù)據(jù)庫進行局部BLAST比對，并進行關(guān)鍵字搜索和蛋白質(zhì)域搜索。發(fā)現(xiàn)小麥基因組序列中有11個序列同源基因（電子附表1），分別分布在第1、2、4和5染色體（表1）。小麥基因組為AABBDD六倍體，這11個TaPLC基因中有4組直系同源基因，每組直系同源基因分別有A、B和D 3個部分同源基因，分別將其命名為、、、、、、、、、和a。未能在第1B染色體上檢出同源序列，推測是由于亞基因組間的不對稱進化所導(dǎo)致。

為了進一步確定第1B染色體中TaPLC基因丟失的時間，利用和序列分別檢索了AA（）二倍體、DD（）二倍體和AABB（）四倍體小麥祖先種基因組。結(jié)果顯示，在祖先種的AA和DD基因組中均檢索到高度相似同源基因（TRIUR3_33781-T和AET1Gv20175500.1），但在AABB基因組中只在A亞組發(fā)現(xiàn)同源基因（TRIDC1AG009650.1），而沒有檢索到B亞組上的同源基因，揭示B亞基因組中的TaPLC基因在異源六倍體形成之前就已經(jīng)缺失（電子附圖1），暗示了小麥亞基因組間進化的不對稱性。

根據(jù)Pfam、SMART和CDD的結(jié)果，獲得的TaPLC基因編碼序列都具有X、Y和C2結(jié)構(gòu)域，并用IBS繪制TaPLC蛋白結(jié)構(gòu)域示意圖（圖1）。通過分析TaPLC基因的分子和生化特性，發(fā)現(xiàn)這些基因的ORF長度范圍為1 770—1 902 bp，其編碼589—633 aa多肽，預(yù)測分子量范圍為5.54—71.11 kD。理論等電點為5.37—6.07（表1）。

2.2 小麥TaPLC基因的系統(tǒng)發(fā)育分析

將檢索到的TaPLC蛋白序列與目前已知的植物PLC蛋白序列進行比對和分析，包括9個擬南芥AtPLC基因、4個水稻OsPLC基因和6個番茄SlPLC基因等共15種植物的56個PLC蛋白序列，7種苔蘚PLC、2種酵母PLC、2種微藻和3種動物ζ亞型的PLC等共計67個蛋白序列，結(jié)果顯示，小麥TaPLC基因家族與已知PLC序列有很高的相似性，其中TaPLC2組（即TaPLC2A、TaPLC2B和TaPLC2D）、TaPLC3組和TaPLC4組同源關(guān)系較近，它們與水稻、玉米、百合和高粱等單子葉植物的PLC的相似性較高，但TaPLC1組的2個蛋白（TaPLC1A和TaPLC1D）則與雙子葉植物（如擬南芥、大豆和番茄等）具有較高的相似度（圖2）。結(jié)合在B基因組中丟失的現(xiàn)象，說明小麥中的TaPLC基因在進化進程中既具有保守性，也出現(xiàn)了分歧。

數(shù)字表示每個結(jié)構(gòu)域在蛋白質(zhì)序列中的位置

2.3 小麥TaPLC基因的結(jié)構(gòu)特征

為了進一步了解TaPLC基因的發(fā)育關(guān)系，分析比較TaPLC基因的DNA序列和氨基酸序列的結(jié)構(gòu)，及其外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。發(fā)現(xiàn)同一組的基因（如//）彼此之間不僅核酸序列和氨基酸序列相似性都達到98%以上（電子附表1），而且外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)也具有高度同一性（圖3），表明小麥TaPLC基因每組的部分同源基因是經(jīng)歷了基因復(fù)制而形成的。組的3個基因均有8個外顯子和7個內(nèi)含子，其他組的基因均有9個外顯子和8個內(nèi)含子，與目前發(fā)現(xiàn)的其他植物的PLC基因有著相似的剪接方式。

表1 小麥TaPLC基因家族各成員的分子和生化特征

a：染色體位置；b：每個TaPLC基因的核酸和氨基酸序列列于電子附表1

a: Chromosomal location;b: The Nucleic acid and deduced amino acid sequences of each TaPLC gene are listed in S1 Table

☆：雙子葉植物；★：單子葉植物；○：松柏類植物；●：石松類植物；：苔蘚植物；■：微藻；：酵母；▲：哺乳動物。Ta：小麥；At：擬南芥；Gm：大豆；Os：水稻；Pp：小立碗蘚；Ps：云杉；Nt：煙草；Sl：番茄；Ld：百合；Sb：高粱；Pi：矮牽牛；St：馬鈴薯；Bn：油菜；Sm：卷柏；Mp：細小微胞藻；Ot：金牛鴕球藻；Hs：智人；Sp：裂殖酵母；Sc：釀酒酵母；Zm：玉米

A：TaPLC基因系統(tǒng)發(fā)育樹；B：TaPLC基因外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)示意圖；C：TaPLC蛋白基序示意圖，基序的序列和logo圖見電子附表3和電子附圖2

利用MEME，在TaPLC基因家族中找到了14個不同的motif（圖3-C）。親緣關(guān)系較近的成員具有相似的motif組合。TaPLC基因共同具有10個motif，特有motif 13，特有motif 12，特有motif 13。14個motif的圖示和序列在電子附表3和電子附圖2中列出。

2.4 TaPLC基因啟動子的順式作用元件

為了探究能夠影響TaPLC基因表達因素及TaPLC基因可能參與的調(diào)控途徑，利用在線軟件（PlantCARE和PLACE）分析了翻譯起始位點（ATG）上游的1.5 kb區(qū)域的調(diào)控序列。結(jié)果顯示，TaPLC基因都含有多種順式作用元件，除了2個核心順式元件T和C（分別是TATA box和CAAT box），還發(fā)現(xiàn)了6個植物激素響應(yīng)元件，包括ABA響應(yīng)元件、乙烯響應(yīng)元件、2個GA響應(yīng)元件及2個生長素響應(yīng)元件；同時發(fā)現(xiàn)8個應(yīng)激響應(yīng)元件，即干旱響應(yīng)元件、低溫響應(yīng)元件，熱激響應(yīng)元件和光響應(yīng)元件等（圖4和電子附表4），暗示TaPLC基因可能參與了植物對激素和逆境脅迫的響應(yīng)過程。此外，一些部分同源基因之間，如、和之間，有著類似的順式調(diào)控元件；而不同組的基因之間卻有較大的差異，如組的元件數(shù)量，較組的多（圖4），暗示小麥中不同的TaPLC基因，有些因受共同的因素調(diào)控而呈現(xiàn)相近表達模式的基因，也有的調(diào)控和表達方式彼此差異較大，從而能夠在多種的生理過程中發(fā)揮作用。

A：ABA響應(yīng)元件；E：乙烯反應(yīng)元件；G：赤霉素反應(yīng)元件；P：赤霉素反應(yīng)元件；B：參與茉莉酸反應(yīng)的元件；D和U：生長素反應(yīng)元件；W：傷害反應(yīng)元件；L：低溫響應(yīng)元件；S：干旱反應(yīng)相關(guān)的MYB結(jié)合位點；M：光反應(yīng)相關(guān)的MYB結(jié)合位點；H：熱激反應(yīng)元件；R：光反應(yīng)的順式調(diào)控元件；O：光反應(yīng)元件的一部分；X：應(yīng)答病菌反應(yīng)的WRKY蛋白結(jié)合位點。激素反應(yīng)順式元件為紅色字母；脅迫反應(yīng)順式元件為黑色字母

2.5 小麥TaPLC基因在細胞、組織中的表達模式

利用WoLF POSRT分析結(jié)果顯示，不同的TaPLC基因具有不同的亞細胞分布特征，其中組和組分別主要在線粒體中分布，組主要在葉綠體中分布，而組主要在細胞質(zhì)中分布（表2）。

表2 TaPLC基因表達蛋白的亞細胞分布特征

為了更好地揭示TaPLC基因在異源六倍體小麥中的潛在功能，在2種分析網(wǎng)站上檢測了該家族在小麥各個組織中的表達豐度。分析結(jié)果彼此相似，數(shù)據(jù)顯示，（）、（//）和（//）均在根中高表達，而、和則分別在穗、籽粒和葉中有較高豐度（圖5-A和電子附圖3）。

為了進一步驗證轉(zhuǎn)錄組的結(jié)果，根據(jù)獲得的、、和cDNA序列設(shè)計引物（電子附表2），用實時熒光定量PCR方法分析這些基因在不同組織的表達情況。結(jié)果顯示，4個基因在5種組織（根、莖、穗、成熟葉和幼葉）中均有表達，但表達水平彼此不同。在所檢測的組織中均為表達最高的，表達最低；、和均在根中表達最高，則是在穗中表達最高。qRT-PCR結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)具有一定的相似性，如在穗中表達最高，其他基因均在根中表達最高（圖5）。以上結(jié)果表明TaPLC基因在不同組織的表達模式具有相似性，但也存在差異，暗示該基因家族在小麥的生長發(fā)育過程中發(fā)揮著作用，同時也暗示不同成員之間可能發(fā)生了一定程度的功能分化。

2.6 非生物脅迫對TaPLC基因表達的影響

基于膜磷脂代謝的肌醇磷脂信號系統(tǒng)，在植物應(yīng)答滲透脅迫的反應(yīng)中發(fā)揮著重要的作用。檢測了TaPLC基因在鹽或干旱脅迫下的表達變化。結(jié)果顯示，所檢測TaPLC基因的轉(zhuǎn)錄均顯著受到鹽或干旱的誘導(dǎo)（圖6）。干旱刺激0.5 h后，4個TaPLC基因的表達量均提高，上調(diào)最顯著的是和；其中和在干旱6 h時表達量升至最高，而和，則在干旱12 h時達到高峰（圖6-A），暗示TaPLC基因在參與植物對干旱脅迫響應(yīng)的過程中受到了不同的調(diào)控策略。同樣，該家族成員也受到鹽脅迫的誘導(dǎo)，但對鹽脅迫的敏感性也存在著一定的差異，如、和均在脅迫處理6 h時表達量最高，而則在受刺激后2 h即達到高峰（圖6-B）。

為了解TaPLC基因受鹽或干旱誘導(dǎo)表達是否具有普適性，選擇抗旱小麥品種洛旱7#（LD）[29]（以科農(nóng)199（KD）為對照）和耐鹽品種小偃60#（XS）[30]（以石麥15#（SS）為對照）檢測了TaPLC基因在脅迫下的表達特征。結(jié)果顯示，無論是耐旱/鹽的品種，還是相對不耐旱/鹽的對照品種，TaPLC基因的表達均顯著受到干旱/鹽脅迫的誘導(dǎo)；另外，干旱脅迫下，抗旱的品種LD中，表達較對照KD更高；耐鹽的品種中，等在鹽的脅迫下也比對照有更高的表達量（圖7）。

A：RNA-seq數(shù)據(jù)分析；B：qRT-PCR檢測結(jié)果。小寫字母表示各基因在不同組織的顯著性水平（P = 0.05）

A：TaPLC基因干旱條件下表達分析；B：TaPLC基因鹽條件下表達分析。星號表示與對照組比較差異顯著（P= 0.05）

綜上所述，TaPLC基因受到干旱和鹽脅迫的誘導(dǎo)，且各基因?qū)Σ煌{迫處理的敏感性存在差異，揭示家族成員在響應(yīng)非生物脅迫過程存在著一定的功能分化。

A：耐旱品種中TaPLC基因在干旱條件下表達分析；B：耐鹽品種中TaPLC基因在鹽條件下表達分析。KD：科農(nóng)199；LD：洛旱7#； SS：石麥15#；XS：小偃60#

3 討論

3.1 小麥中的TaPLC基因家族

通過對小麥基因數(shù)據(jù)庫的檢索，在中國春小麥基因組中發(fā)現(xiàn)11個PI-PLC編碼基因。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，該家族成員的基因結(jié)構(gòu)、編碼蛋白序列的結(jié)構(gòu)以及生化特征等參數(shù)與目前已知的植物PLC基因相似[31]，顯示了TaPLC基因序列在進化上的保守性。

目前發(fā)現(xiàn)植物中PLC基因都是以多成員的家族形式存在，如擬南芥中9個成員、水稻中4個、番茄中6個等[31-33]。由于小麥異源六倍體的遺傳特征，11個TaPLC基因根據(jù)其序列的同源性和結(jié)構(gòu)特征，可以分成4組直系同源基因，即—，每組內(nèi)包括3個分別位于A、B和D亞基因組中的部分同源基因，其序列相似性達到98%—99%（電子附表1）。另外，在B染色體上卻沒有拷貝，進一步檢索AA二倍體，DD二倍體和AABB四倍體小麥祖先種基因組，發(fā)現(xiàn)B基因組中的在異源六倍形成之前就已經(jīng)缺失（電子附圖1）。組內(nèi)的3個基因在4A、4B和4D染色體上的位置不盡相同。這些結(jié)果說明在小麥的進化過程中染色體可能丟失部分基因或發(fā)生了基因易位（表1）。通過系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)，不同物種的PLC基因均存在于不同的分支中，即使在植物中，單子葉和雙子葉的PLC也明顯地被區(qū)分在不同的模塊中，顯示出PLC在不同物種中存在著進化上的分歧。然而，小麥和，與單子葉植物水稻和玉米序列的相似度卻比雙子葉植物的PLC基因序列相似性更高些，表明小麥的和，在進化上與其他的旁系同源基因有較大的差異（圖2）。另一方面，根據(jù)外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)進行的聚類分析，組的2個基因，均有較長的第一個內(nèi)含子，與其他3組TaPLC基因的相似度最低，反而與擬南芥和，以及水稻的結(jié)構(gòu)相似[31,33]。外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)是基因演變的重要參數(shù)。因此這一組的基因同源關(guān)系較其他組較遠，這與圖3顯示的進化樹的結(jié)果也是一致的。

3.2 TaPLC基因的表達模式

植物PLC的研究最早始于小麥，早在1987、1992年人們分別從小麥中檢測到了PLC的生物活性[25-27]，河北省植物生理與分子病理學(xué)重點實驗室前期根據(jù)文獻報道的2個小麥和（GenBank：HM754654.1和HM754653.1）[34]序列進行了藥物學(xué)和表達分析檢測，發(fā)現(xiàn)高鹽或干旱至少誘導(dǎo)了的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的表達，并且施加PLC抑制劑U73122或edelfosine會損害幼苗生長并增強幼苗對干旱和高鹽分脅迫的敏感性，表明參與了小麥對鹽或干旱脅迫的應(yīng)答反應(yīng)[28]。

干旱和高鹽導(dǎo)致的滲透脅迫是影響植物的生長發(fā)育，造成世界范圍內(nèi)的作物減產(chǎn)的重要因素。固著生長的植物進化出復(fù)雜的信號傳導(dǎo)系統(tǒng)，以感受環(huán)境變化，調(diào)控基因表達，從而在細胞和分子水平上對環(huán)境脅迫做出響應(yīng)[1,35]。磷酸肌醇信號傳導(dǎo)途徑在植物對滲透脅迫的響應(yīng)中具有重要作用[4]。作為該途徑的關(guān)鍵酶之一，植物PLC不僅在滲透脅迫下被誘導(dǎo)表達，而且它們的過表達植物在脅迫環(huán)境下還表現(xiàn)多種抵抗或耐受脅迫的表型。擬南芥有9個AtPLC家族成員，第一個被克隆的就是受干旱或鹽強烈誘導(dǎo)的亞型[36]；qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，鹽脅迫下、和3種亞型的轉(zhuǎn)錄水平提高最多，達5倍以上[37-38]；遺傳學(xué)試驗也證實，負調(diào)節(jié)擬南芥的耐鹽性，和的超表達均提高了擬南芥的耐旱性能[18,21-23]。玉米主要在根中表達，干旱脅迫可以誘導(dǎo)其表達上升[36]，超表達轉(zhuǎn)基因玉米，比野生型玉米表現(xiàn)出更好的耐旱性能[11]。NaCl處理后，水稻葉片中的PLC的底物分子PIP2的含量會在30 min內(nèi)迅速增加至4倍[40]；水稻的4種OsPLC基因中，在鹽脅迫下表達上調(diào)，的表達則降低[22]；介導(dǎo)Ca2+信號產(chǎn)生，建立了整個植株的耐鹽性[8]；兩個敲除突變體和株系的幼苗在鹽脅迫下的生長和成活率都降低，過表達可以提高高鹽和缺水條件下的成活率[41]。另外，其他物種如煙草NtPLC基因、馬鈴薯StPLC基因和綠豆VrPLC基因等被克隆時，也檢測到其表達受到鹽、干旱等刺激誘導(dǎo)[8,10,13-14]。甘藍型油菜的過量表達，增強了植物的抗旱性并促進早花和成熟[42]。以上表明，表達受到脅迫影響的PLC基因，在植物體內(nèi)超表達或缺失后，都會改變植物抵抗或耐受鹽或干旱刺激的生理性狀。

本研究檢索小麥基因組序列，獲得了11個TaPLC基因序列后，檢測了它們在高鹽或干旱脅迫下的表達變化，發(fā)現(xiàn)所檢測的4個TaPLC基因在轉(zhuǎn)錄水平都顯著受到脅迫刺激的誘導(dǎo)，其中在干旱脅迫下表達上升最高，而受鹽脅迫誘導(dǎo)最顯著（圖6）。通過序列比對，核實了即前述報道的（GenBank：HM754654.1），即（GenBank：HM754653.1）。另外有趣的是，這些TaPLC基因在耐旱/鹽的小麥品種洛旱7#（LD）/小偃60#（XS）[29-30]以及不耐的對照品種中，表達均顯著受到干旱/鹽脅迫的誘導(dǎo)（圖7）。綜上，植物PLC以表達量變化的方式普遍參與的鹽或干旱的應(yīng)答響應(yīng)。植物面對高鹽或干旱甚至冷、熱等滲透脅迫的物理性因子刺激時，一是可以在細胞的各個位置通過各種大分子和結(jié)構(gòu)獨立地感知，此外植物在應(yīng)答這些脅迫信號時具有一些共同的特征，其中最主要的就是Ca2+作為主要應(yīng)答的通用第二信使[1,4]。而植物PLC，作為調(diào)節(jié)膜脂分子代謝的酶類，不僅依附于細胞質(zhì)膜存在，還在線粒體、葉綠體等細胞器中分布（表2），并且是鈣信號形成的上游調(diào)控者[3-4]。結(jié)合TaPLC基因在不同品系的小麥中受鹽或干旱誘導(dǎo)后的表達模式的相似性，推測PLC基因作為膜肌醇磷脂信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的關(guān)鍵因子，其部分功能可能是參與植物對脅迫信號的感知。另外，在TaPLC基因的調(diào)控序列區(qū)，除了共有的TATA box和CAAT box外，還有ABA、乙烯、赤霉素、生長素等激素反應(yīng)的順式作用元件，光反應(yīng)相關(guān)元件以及低溫、熱激和干旱等滲透反應(yīng)的響應(yīng)元件（圖4）。非生物脅迫觸發(fā)的信號途徑與激素對植物的調(diào)節(jié)過程有很多的cross talk[1,43]。以上諸多信息對于深入研究TaPLC基因家族的每個成員參與小麥應(yīng)答鹽或干旱生理過程的作用機制提供了十分有用的信息，為利用這些基因?qū)π←溸M行遺傳改良奠定好的基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

TaPLC基因家族中有11個植物PLC直系同源序列，分為4組，每組內(nèi)的3個（或2個）部分同源物為小麥六倍體演化過程中染色體復(fù)制形成的拷貝。不同的TaPLC基因有各自的組織和亞細胞水平的分布特征，并且每組的TaPLC基因成員至少有1個基因的轉(zhuǎn)錄受到鹽或干旱的脅迫誘導(dǎo)。TaPLC基因的上游調(diào)控區(qū)存在激素調(diào)控的順式元件及應(yīng)激響應(yīng)元件。

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Genomic Profiling and Expression Analysis of Phosphatidylinositol-specific PLC Gene Families among Chinese spring Wheat

SI XuYang1, JIA XiaoWei1, ZHANG HongYan1, JIA YangYang1, TIAN ShiJun1, ZHANG Ke2, PAN YanYun1

(1College of Life Sciences,Hebei Agricultural University/Key Laboratory of Hebei Province for Plant Physiology and Molecular Pathology, Baoding 071000, Hebei;2College of Agronomy, Hebei Agricultural University/State Key Laboratory of North China Crop Improvement and Regulation/Key Laboratory of Crop Growth Regulation of Hebei Province, Baoding 071001, Hebei)

【】To characterize the gene family encoding phosphatidylinositol-specific phospholipase-C (PI-PLC), the gene number, structure, phylogenetic relationship and expression pattern of TaPLC genes were analyzed. In addition, we explored their relative transcription levels in various tissue and the expression pattern under drought and salt stress to further analysis the physiological role ofTaPLC genes in response to abiotic stress.【】Based on the genome database (Ensembl Plants, http://plants.ensembl.org/index.html), TaPLC genes were identified from, and the gene structures were analyzed by some bioinformatics tools, such as Pfam, CDD and SMART. The protein sequence characteristics of the members in TaPLC family were analyzed with the online server ExPASy (http://cn.expasy.org/tools). The subcellular localization of TaPLC genes were predicted using the WoLF PSORT (https://www.genscript.com/wolf-psort.html). Phylogenic tree analysis was performed by software MEGA 7.0. The real-time PCR was used to detect the gene expression levels in different tissues under abiotic stress. 【】A total of 11 TaPLC genesmembers within the heterologous hexaploid wheat genome were identified and analyzed. All TaPLC genes have conserved X-Y catalytic domains and C2 domains, just like other plant PLC genes. Subcellular localization showed that these proteins were located in the chloroplast or mitochondria. Phylogenetic analysis revealed that all of the TaPLC genes were unevenly classified into four numbered,,,, and, which were all orthologous genes of plant PLC genes in plants, and highly conserved during evolution. However, the deletion ofB subgenome indicates asymmetry evolution in different subgenomes. Further analysis of cis-regulatory elements elucidated that these members of TaPLCfamily shared similar elements, such as the phytohormone and the stress response cis-elements. Each PLC genehas a unique tissue expression pattern, and they are expressed mainly in roots, leaves, spikes, and gains. In addition, PLC genesmediate the response of wheat to salt and drought stresses, which are induced rapidly by salt or drought stress stimulation. 【】The TaPLCfamily incontains 11 members which have conserved X-Y catalytic domains and C2 domains. Although the TaPLC genes were highly conserved, they were asymmetrically evolved in different subgenomes. They had specific expression pattern in different tissues, and were induced by salt or drought stress, which suggested TaPLCgenes play a role in response to salt or drought in wheat.

; PI-PLC; salt stress; drought stress

10.3864/j.issn.0578-1752.2020.24.001

2020-03-23；

2020-06-02

河北省自然科學(xué)基金（C2017204095）、河北省高等學(xué)校科學(xué)技術(shù)研究項目（ZD2017039）

司旭陽，E-mail：sixuyanglove@163.com；賈嘵瑋，E-mail：jia999666@126.com；司旭陽和賈嘵瑋為同等貢獻作者。通信作者潘延云，E-mail：pyycell@163.com。通信作者張科，E-mail：zhangke0126@163.com

（責(zé)任編輯 李莉）