轉(zhuǎn)phyA2、ZmTMT和Bar玉米的獲得及其特性分析

姚興蘭，楊文竹，羅彥忠，陳茹梅，王磊，張?zhí)m

轉(zhuǎn)、和玉米的獲得及其特性分析

姚興蘭，楊文竹，羅彥忠，陳茹梅，王磊，張?zhí)m

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081）

【】玉米是家禽和單胃動(dòng)物飼料的主要原料，但玉米籽粒中高活性的α-生育酚含量較低，且籽粒中的磷主要是以植酸磷的形式存在，動(dòng)物不能有效吸收利用，因此，飼料中需要添加化學(xué)合成的維生素E和無(wú)機(jī)磷或微生物來(lái)源的植酸酶以滿足動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育的需要，增加了飼料成本，同時(shí)又容易造成磷污染。通過(guò)轉(zhuǎn)基因獲得α-生育酚含量和植酸酶活性大量提高的玉米，為飼用玉米育種提供材料基礎(chǔ)。構(gòu)建含有3個(gè)基因表達(dá)盒的載體，采用農(nóng)桿菌侵染的方法轉(zhuǎn)化玉米，草銨膦作為篩選壓力；通過(guò)噴施草銨膦和PCR鑒定的方法篩選轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株，RT-PCR分析目的基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)情況；Western blot分析目的基因在翻譯水平上的表達(dá)情況，采用分光光度計(jì)測(cè)定轉(zhuǎn)基因玉米籽粒中的植酸酶活性，利用HPLC測(cè)定籽粒中的維生素E含量，同時(shí)比較轉(zhuǎn)基因株系與野生型在其他營(yíng)養(yǎng)成分和農(nóng)藝性狀上的差異。構(gòu)建了胚乳特異性啟動(dòng)子123387驅(qū)動(dòng)的植酸酶基因表達(dá)盒、胚特異性啟動(dòng)子13387驅(qū)動(dòng)的玉米γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶基因表達(dá)盒以及組成型啟動(dòng)子CaMV 35S驅(qū)動(dòng)的草銨膦抗性基因表達(dá)盒串聯(lián)的植物表達(dá)載體；轉(zhuǎn)化玉米獲得轉(zhuǎn)基因植株；噴施草銨膦和PCR鑒定得到陽(yáng)性植株；經(jīng)過(guò)多個(gè)世代回交轉(zhuǎn)育，獲得目標(biāo)性狀均較好的2個(gè)轉(zhuǎn)基因純合玉米株系TPB1和TPB2；RT-PCR和Western blot分析結(jié)果表明、和在轉(zhuǎn)基因玉米中顯著高表達(dá)。植酸酶活性測(cè)定結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因玉米籽粒中植酸酶活性達(dá)到10 000—13 000 U·kg-1。維生素E含量測(cè)定結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因玉米籽粒中90%以上的γ-生育酚轉(zhuǎn)化為α-生育酚，α-生育酚的含量達(dá)到50—70 mg·kg-1，α-三烯生育酚的含量也有明顯增加。轉(zhuǎn)基因玉米中的植酸酶活性和α-生育酚含量完全能夠滿足動(dòng)物飼料的需要。轉(zhuǎn)基因株系的農(nóng)藝性狀與野生型無(wú)顯著差異，TPB1的營(yíng)養(yǎng)成分與野生型總體無(wú)顯著差異，TPB2稍高于野生型但是未產(chǎn)生不利影響；且均具有草銨膦抗性。獲得的富含維生素E和植酸酶、且具有除草劑抗性的玉米新材料可以用于玉米雜交種的開(kāi)發(fā)應(yīng)用，降低飼料成本，提高磷的利用率，減少環(huán)境污染。

玉米；植酸酶；維生素E；α-生育酚；草銨膦抗性

0 引言

【研究意義】玉米（）是動(dòng)物和家禽重要的飼料作物之一，全球用于飼料的玉米占總量的65%，相當(dāng)于4.5×108億t[1]。磷和維生素E是動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育所需的重要元素，磷在谷物、豆類(lèi)等籽實(shí)作物中主要以植酸磷的形式存在，占植物種子磷含量的52%—80%[2-3]。而單胃動(dòng)物（例如豬、雞等）消化道中不能分泌植酸酶，導(dǎo)致植酸磷不能得到有效利用[3-5]。此外，植酸是抗?fàn)I養(yǎng)因子，能與動(dòng)物體內(nèi)的重要礦質(zhì)元素（如Fe3+、Zn2+、Ca2+、Mg2+和K+）和蛋白結(jié)合形成共沉淀，從而導(dǎo)致動(dòng)物不能有效吸收礦物質(zhì)[6-8]。因此，飼料中需外源添加無(wú)機(jī)磷或者微生物來(lái)源的植酸酶才能滿足動(dòng)物生長(zhǎng)的需要。維生素E是一類(lèi)脂溶性抗氧化劑，是人體和動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)所必須、但又不能自身合成的重要維生素。維生素E只能在光合組織合成（植物和光合細(xì)菌），具有維持生物膜完整性、防止脂質(zhì)氧化等重要的生物學(xué)功能[9-10]。根據(jù)天然維生素E植基側(cè)鏈的飽和程度分為生育酚和三烯生育酚，根據(jù)色滿醇環(huán)上甲基數(shù)量和位置的不同分為α-、β-、γ-、δ-生育酚/三烯生育酚[10]，其中，以α-生育酚的活性最高[11]。玉米作為動(dòng)物飼料的主要原料，籽粒中低活性的γ-生育酚含量最高，而高活性的α-生育酚含量較低。為了滿足動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育需要，飼料中需要外源添加合成的DL-α-生育酚醋酸酯。DL-α-生育酚醋酸酯的生物活性僅為天然α-生育酚的三分之二，其生物利用率也僅為天然α-生育酚的五分之一左右[12-13]。因此，改善玉米籽粒中植酸酶的表達(dá)量和維生素E的組成，提高玉米中植酸酶活性和高活性α-生育酚的含量，則飼料中可以不再外源添加植酸酶或磷和合成的維生素E，大大降低飼料成本?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】植酸酶可以催化植酸水解產(chǎn)生肌醇衍生物和無(wú)機(jī)磷[14]，目前，已從植物和微生物中分離了植酸酶基因，其中來(lái)源于微生物、尤其是曲霉屬的植酸酶報(bào)道比較多[15-18]。曲霉來(lái)源的植酸酶因其在酸性環(huán)境酶活性高、耐熱性好而備受關(guān)注[18]。酵母中表達(dá)的具有較高的酶活性（13 000—16 000 U·mL-1）和良好的熱穩(wěn)定性[14]，目前已被用作飼料添加劑[15-18]。玉米中胚特異性表達(dá)，籽粒中植酸酶活性達(dá)到2 200 U·kg-1[19]，胚乳特異性表達(dá)，籽粒中植酸酶活性達(dá)到125 000 U·kg-1[20]，此胚乳特異表達(dá)的玉米已獲得安全生產(chǎn)證書(shū)（BVLA430101）[21]，可應(yīng)用于飼料生產(chǎn)。而在維生素E的合成途徑中，γ-生育酚甲基轉(zhuǎn)移酶（γ-TMT）催化低活性的γ-生育酚轉(zhuǎn)化為高活性的α-生育酚。因此，提高γ-TMT的表達(dá)來(lái)增加高活性的α-生育酚含量是進(jìn)行維生素E基因工程的首選。1998年，SHINTANI等[22]率先過(guò)表達(dá)擬南芥的（），使得擬南芥種子中α-生育酚含量提高約80倍；水稻中過(guò)表達(dá)，轉(zhuǎn)基因水稻胚乳中α-三烯生育酚含量提高1.7倍[23]；萵苣中過(guò)表達(dá)，T2代轉(zhuǎn)基因株系中α-生育酚含量提高約38倍[24]；過(guò)表達(dá)擬南芥和白蘇的，轉(zhuǎn)基因大豆種子中α-生育酚含量分別提高4倍和10.4倍[25-26]。Zhang等[23,27]分別研究了大豆的和玉米的，轉(zhuǎn)和玉米株系α-生育酚含量分別提高3—4.5倍和5—6.5倍?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】前期分別研究了和在玉米籽粒中的表達(dá)，轉(zhuǎn)玉米中，植酸酶活性得到大幅度提高[19-20]；轉(zhuǎn)玉米中，α-生育酚含量與野生型相比提高5—6.5倍[27]。但是通過(guò)同時(shí)表達(dá)和聚合高α-生育酚和植酸酶活性2種性狀的相關(guān)研究卻未見(jiàn)報(bào)道，因此，利用和共表達(dá)獲得多種目標(biāo)性狀聚合的轉(zhuǎn)基因玉米，將為飼料加工提供便利，還可以大大降低成本；同時(shí)，研究多性狀聚合是否會(huì)影響受體材料的農(nóng)藝性狀以及營(yíng)養(yǎng)成分，為今后聚合更多性狀飼用玉米育種提供參考?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究分別利用胚、胚乳特異表達(dá)的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)目的基因的表達(dá)，獲得多性狀聚合的轉(zhuǎn)基因玉米，為飼料加工提供便利，大大降低成本；同時(shí)為飼料玉米育種提供資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

雙元載體pCAMBIA3301（含有表達(dá)盒，具有草銨膦抗性）、質(zhì)粒pPHP20754-phyA2（含植酸酶基因表達(dá)盒、LEG1啟動(dòng)子、LEG1終止子）[20]、pSP-ZmTMT（含有表達(dá)盒，Glb1的啟動(dòng)子和終止子）[27]、pEU13387G3（含有13387啟動(dòng)子）[28]、pUM3G-123387（含有123387啟動(dòng)子）、農(nóng)桿菌菌株EHA105、含有30a-ZmTMT質(zhì)粒的大腸桿菌菌株[27]均為王磊研究員實(shí)驗(yàn)室保存。

轉(zhuǎn)化受體材料Hi-II[29]和回交轉(zhuǎn)育材料（自交系鄭58）為王磊研究員實(shí)驗(yàn)室保存。玉米大田種植于試驗(yàn)基地；轉(zhuǎn)基因幼苗在25℃的生長(zhǎng)箱中以16 h光照/8 h黑暗周期生長(zhǎng)約2周，再在16 h光照/8 h黑暗周期中移至28℃的溫室中。

1.2 載體構(gòu)建和轉(zhuǎn)基因植株的獲得

利用引物ZT3301 FW：5′-ATCGCAAATTTGGTC ATGGCTCACGCGGCGCTGCT-3′，ZT3301 RV：5′- CGATCGGGGAAATTCGAGCTGGGTCACCTCTTTTATGAATAATAATAA-3′，以質(zhì)粒pSP-ZmTMT為模板，PCR擴(kuò)增獲得片段（含有序列和Glb1終止子序列）。利用引物13387 FW0：5′-CTATGACCATGATTACGGTTTAAACAAGGAACATCTTAGGAAGTG-3′（加入Ⅰ酶切位點(diǎn)），13387 RV1：5′-GACCAAATTTGCGAT GTGTCGTCG TCCGCCACCCGA-3′，以質(zhì)粒pEU13387G3為模板，PCR擴(kuò)增得到13387啟動(dòng)子序列。質(zhì)粒載體pCAMBIA3301做RⅠ和EⅡ酶切處理。利用試劑盒（Vazyme，C112-01），將酶切后的載體pCAMBIA3301、13387啟動(dòng)子序列以及片段進(jìn)行重組反應(yīng)，得到3301-13387-ZT質(zhì)粒載體。

利用引物CPAO3301 FW：5′-TGGTCACAAATT TCGATGGCCCCACGCCGCCTGCT-3′，CPAO3301 RV1：5′-CTAAGATGTTCCTTGTTTAAACCAGTAT AACTATGCCGAGGT-3′，以質(zhì)粒pPHP20754-phyA2為模板，PCR擴(kuò)增得到片段（含有信號(hào)肽SP，靶向液泡序列VTS，序列以及LEG1終止子）。利用引物123387 FW：5′-CTATGACCATGATTACG GTTTATTTAAATATGCTTCGACCAAAACACCC-3′，123387 RV：5′-CGAAATTTGTGACCAGCATGCAG TCAACAATGGCCA-3′（加入Ⅰ酶切位點(diǎn)），以質(zhì)粒pUM3G-123387為模板，PCR擴(kuò)增得到123387啟動(dòng)子序列。質(zhì)粒載體3301-13387-ZT做Ⅰ酶切處理。將酶切后的3301-13387-ZT、123387啟動(dòng)子序列以及片段進(jìn)行重組反應(yīng)，得到3301-phyA2- ZT質(zhì)粒載體。

將3301-phyA2-ZT載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌株EHA105，侵染玉米Hi-II幼胚，參照HYUN等[30]方法進(jìn)行，草銨膦BASTA作為篩選壓力，獲得轉(zhuǎn)基因植株。轉(zhuǎn)基因植株與自交系鄭58雜交獲得F1植株，然后再與鄭58回交5代，自交2代獲得BC5F3。最后，獲得轉(zhuǎn)基因純合株系TPB1和TPB2。每個(gè)世代的轉(zhuǎn)基因玉米植株均通過(guò)葉片涂抹草銨膦或者噴施草銨膦鑒定陽(yáng)性，再經(jīng)過(guò)PCR驗(yàn)證。

1.3 phyA2、ZmTMT和Bar的RT-PCR分析

利用RNA提取試劑盒（Transgene，ER501-01）提取轉(zhuǎn)基因株系玉米授粉15 d的籽?？俁NA，cDNA第一鏈的合成按照MonScript? RTIII All-in-One Mix（Monad，MR05001S）的操作說(shuō)明進(jìn)行。

采用RT-PCR的方法分析、、的RNA水平表達(dá)。以作為內(nèi)參[31]，引物：Actin-F：5′-ATGTTTCCTGGGATTGCCGAT-3′，Actin-R：5′-CCAGTTTCGTCATACTCTCCCTTG-3′；引物：AO1229F1：5′-TTGTCTGGCGTGACTCT CAC-3′，AO1229R1：5′-TCCTGCTCAGACTGGCAT TG-3′；引物：ZT1229F1：5′-ATGTCGGATGTG GCATTGG-3′，ZT1229R1：5′-CCCTGGATCATTAG CGGC-3′；引物：bar1225F：5′-GGAAGTTGACCG TGCTTGTC-3′，bar1225R：5′-CGAGTCAACCGTGT ACGTCT-3′。

1.4 phyA2、ZmTMT和Bar蛋白的western blot分析

轉(zhuǎn)基因株系成熟籽粒研磨成粉末，稱(chēng)取100 mg提取總蛋白（蛋白提取液：50 mmol·L-1Tris-HCl（pH 8.0）、150 mmol·L-1NaCl、1 mmol·L-1EDTA、2% NP-40（v/v）和10 mmol·L-1PMSF）進(jìn)行western blot分析，參考Chen等[19]方法進(jìn)行。SDS-PAGE使用12%濃度膠，使用NC膜（Merk，Germany）轉(zhuǎn)膜。phyA2雜交一抗為phyA2蛋白的兔抗血清[19]，二抗為辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的羊抗兔IgG（CW Bio，CW0156S）；ZmTMT和Bar雜交的一抗分別為2個(gè)蛋白的鼠抗單克隆抗體，二抗為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG（CW Bio，CW0110S），雜交時(shí)一抗/二抗稀釋5 000—10 000倍進(jìn)行雜交。

1.5 植酸酶活性以及植酸磷和磷含量測(cè)定

參考Markus等[32]和Chen等[19]方法測(cè)定植酸酶活性、植酸磷和磷含量。

植酸酶活性測(cè)定：稱(chēng)取上述成熟籽粒粉末50 mg加入1 mL提取液，振蕩孵育1 h，10 000 r/min，離心15 min，上清液即為植酸酶提取液。酶活性測(cè)定：取20 μL植酸酶提取液，加入80 μL植酸鈉，37℃孵育30 min，100 μL 15%TCA終止反應(yīng)；以孵育前加入TCA的反應(yīng)體系作為對(duì)照。取20 μL反應(yīng)液加入80 μL水和100 μL顯色液，37℃顯色20 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)酶活性。

磷含量測(cè)定：稱(chēng)取上述成熟籽粒粉末50 mg加入1 mL 0.4 mol·L-1HCl和15% TCA的混合液；室溫置于搖床振蕩3 h；5 000 r/min，離心15 min；取200 μL上清加入100 μL H2O，混勻，4 000 r/min，離心10 min；取50 μL上清加入96孔板中；每孔加入100 μL顯色液，37℃反應(yīng)30 min后讀數(shù)。

植酸磷測(cè)定：取50 μL上述磷含量測(cè)定時(shí)的提取液上清，加入550 μL 36.3 mmol·L-1NaOH和200 μL顯色液，混勻，5 000 r/min，離心10 min；取200 μL混合液加入96孔板中進(jìn)行讀數(shù)。

1.6 維生素E含量測(cè)定以及其他營(yíng)養(yǎng)成分分析

參考Konda等[33]方法測(cè)定維生素E含量，在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所重大工程中心完成。稱(chēng)取上述成熟籽粒粉末50 mg加入1 mL維生素E提取液（0.01% BHT，甲醇﹕二氯甲烷=9﹕1（v/v），標(biāo)準(zhǔn)品1.5 ng·μL-1），混勻靜置20 min，10 000 r/min，離心10 min，上清經(jīng)0.22 μm濾器（津騰，LQ0002）過(guò)濾，HPLC上樣檢測(cè)。標(biāo)準(zhǔn)品為Rac-5,7-dimethyltocol（Abcam，ab143879），分離柱為安捷倫XDB-C18柱（258×4.6×5），用熒光檢測(cè)器（Ex 292 nm，Em 330 nm）進(jìn)行測(cè)定。

根據(jù)飼料中所需檢測(cè)的主要營(yíng)養(yǎng)成分[34]，檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米材料籽粒中鈣、18種氨基酸、干物質(zhì)、粗脂肪以及粗蛋白的含量，委托中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部飼料效價(jià)與安全監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心完成。

1.7 農(nóng)藝性狀分析

對(duì)成熟期的玉米進(jìn)行農(nóng)藝性狀分析，各取40個(gè)單株，對(duì)其株高、穗位，雌穗的穗行數(shù)、行粒數(shù)、穗長(zhǎng)以及軸粗等數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)基因植株的獲得

為了獲得籽粒中α-生育酚和植酸酶含量提高的材料，分別選用胚乳特異表達(dá)的啟動(dòng)子和胚特異表達(dá)的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)和的表達(dá)，與載體自帶的組成型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的表達(dá)盒串聯(lián)，如圖1所示，采用農(nóng)桿菌侵染的方法轉(zhuǎn)化玉米，經(jīng)過(guò)多個(gè)世代回交轉(zhuǎn)育，獲得了目標(biāo)性狀均較好的2個(gè)轉(zhuǎn)基因純合玉米株系TPB1和TPB2，對(duì)其進(jìn)行比較深入的研究。

phyA2表達(dá)盒由胚乳特異表達(dá)的啟動(dòng)子123387驅(qū)動(dòng)；ZmTMT表達(dá)盒由胚特異表達(dá)的啟動(dòng)子13387驅(qū)動(dòng)；Bar表達(dá)盒由組成型啟動(dòng)子CaMV 35S驅(qū)動(dòng)

2.2 phyA2、ZmTMT和Bar的轉(zhuǎn)錄水平分析

為了明確轉(zhuǎn)基因株系籽粒中、和的RNA水平表達(dá)，提取授粉后15 d籽粒的RNA進(jìn)行RT-PCR分析（圖2）。、和在轉(zhuǎn)基因株系TPB1和TPB2的籽粒中均有高表達(dá)，但由于和均是玉米外源基因，二者在WT（鄭58）中無(wú)表達(dá)；而是玉米內(nèi)源基因，在WT中存在一定水平的表達(dá)。

2.3 phyA2、ZmTMT和Bar的翻譯水平分析

為了確定轉(zhuǎn)基因株系籽粒中phyA2、ZmTMT和Bar蛋白的表達(dá)情況，提取成熟籽粒的總蛋白進(jìn)行western blot分析（圖3）。phyA2、ZmTMT和Bar蛋白在轉(zhuǎn)基因株系TPB1和TPB2的籽粒中均有表達(dá)。ZmTMT蛋白為玉米內(nèi)源蛋白，不但在轉(zhuǎn)基因株系有表達(dá)，在WT中也有表達(dá)，但在WT中的表達(dá)與在轉(zhuǎn)基因株系中的表達(dá)差異并不明顯，推測(cè)可能的原因是，ZmTMT是維生素E合成途徑中的關(guān)鍵酶，ZmTMT蛋白可能部分在發(fā)揮功能之后被降解；另外，用于陽(yáng)性對(duì)照的ZmTMT蛋白是原核表達(dá)的融合蛋白，大小約38 kD，而ZmTMT蛋白本身含有葉綠體定位信號(hào)肽，在植物體內(nèi)信號(hào)肽被去除之后其蛋白大小約為33 kD，這也是ZmTMT的蛋白雜交條帶與陽(yáng)性對(duì)照有差異的原因（圖3-A）。Bar和phyA2蛋白均為外源蛋白，因此，2個(gè)蛋白只在轉(zhuǎn)基因株系TPB1和TPB2中有表達(dá)，而在WT中無(wú)表達(dá)（圖3-B和圖3-C）。

WT：野生型鄭58；TPB1、TPB2：轉(zhuǎn)基因純合株系

A：ZmTMT蛋白的表達(dá)分析；B：Bar蛋白的表達(dá)分析；C：phyA2蛋白的表達(dá)分析。WT：野生型鄭58；TPB1、TPB2：轉(zhuǎn)基因純合株系；Marker：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；ZmTMT CK：原核表達(dá)的融合ZmTMT蛋白陽(yáng)性對(duì)照；Bar CK：Bar蛋白陽(yáng)性對(duì)照；phyA2 CK：已報(bào)道的轉(zhuǎn)基因玉米表達(dá)的phyA2蛋白陽(yáng)性對(duì)照[19]

2.4 植酸酶活性以及植酸磷和磷含量測(cè)定

植酸酶phyA2蛋白已在轉(zhuǎn)基因玉米成熟籽粒得到高表達(dá)，接下來(lái)對(duì)其酶活性進(jìn)行了測(cè)定（圖4）。轉(zhuǎn)基因株系TPB1和TPB2中phyA2的酶活性均超過(guò)10 000 U·kg-1，TPB1中phyA2的酶活性是10 884 U·kg-1，TPB2中phyA2的酶活性達(dá)到12 864 U·kg-1。已有報(bào)道飼料中對(duì)植酸酶的需求量是750—1 000 U·kg-1[35]，TPB1和TPB2中植酸酶活性已到達(dá)需求量的10倍以上，完全能夠滿足飼料的需要。

植酸酶能夠分解植酸磷生成肌醇衍生物和無(wú)機(jī)磷，進(jìn)一步測(cè)定了植酸磷和磷的含量，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因株系TPB1和TPB2中植酸磷和磷的含量與WT相比并無(wú)差異（表1），這是由于植酸磷主要存在于胚中，而TPB1和TPB2中的植酸酶主要在胚乳中特異高表達(dá)，酶和底物存在部位的不同導(dǎo)致植酸酶不能直接分解植酸磷。而植酸酶在胚中特異高表達(dá)時(shí)則可以有效分解植酸磷[19]。

2.5 維生素E含量以及其他營(yíng)養(yǎng)成分分析

γ-生育酚轉(zhuǎn)化為高活性的α-生育酚，為了確定ZmTMT蛋白的高表達(dá)對(duì)維生素E組分的影響，采用內(nèi)標(biāo)法，利用HPLC檢測(cè)了轉(zhuǎn)基因株系TPB1和TPB2中維生素E的含量（圖5）。轉(zhuǎn)基因株系TPB1和TPB2中，α-生育酚的含量顯著提高，TPB1中達(dá)到51.58 mg·kg-1，TPB2中達(dá)到66.18 mg·kg-1，分別是WT中α-生育酚含量的4.9倍和6.3倍；同時(shí)，γ-生育酚的水平則均顯著下降（＜0.01），表明ZmTMT充分發(fā)揮了其功能，將90%以上的γ-生育酚轉(zhuǎn)化為了α-生育酚。另外，ZmTMT蛋白的高表達(dá)，也將部分γ-三烯生育酚轉(zhuǎn)化為了α-三烯生育酚（圖5-B）。

WT：野生型鄭58；TPB1、TPB2：轉(zhuǎn)基因純合株系

A：維生素E測(cè)定色譜圖。α-、γ-、δ-T/T3表示α-、γ-、δ-生育酚/生育三烯酚；IS：標(biāo)準(zhǔn)品；Rac-5,7-dimethyltocol；B：籽粒中維生素E含量分析。WT：野生型鄭58；TPB1、TPB2：轉(zhuǎn)基因純合株系

表1 籽粒中植酸磷和磷含量分析

WT：野生型鄭58；TPB1、TPB2：轉(zhuǎn)基因純合株系

WT: wild type zheng58; TPB1, TPB2: transgenic homozygous lines

為了確定轉(zhuǎn)基因玉米中α-生育酚和植酸酶的積累是否影響玉米籽粒其他營(yíng)養(yǎng)成分的含量，對(duì)轉(zhuǎn)基因株系籽粒中的營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行了測(cè)定（表2）。結(jié)果顯示，TPB1的營(yíng)養(yǎng)成分總體與WT無(wú)顯著差異，TPB2總體稍高于WT，推測(cè)原因?yàn)椋翰煌D(zhuǎn)基因株系之間由于插入位點(diǎn)的不同可能會(huì)導(dǎo)致性狀之間有一定的差異；另外，轉(zhuǎn)基因材料最初受體是玉米Hi-II，之后轉(zhuǎn)育到鄭58中，轉(zhuǎn)基因株系中存留了少量的Hi-II遺傳信息，這也可能是導(dǎo)致差異的原因之一；除此之外，并未發(fā)現(xiàn)任何不利影響。

2.6 農(nóng)藝性狀分析

為了檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米中α-生育酚和植酸酶的積累是否影響玉米本身的農(nóng)藝性狀，對(duì)轉(zhuǎn)基因株系TPB1和TPB2的株高、穗位，雌穗的穗長(zhǎng)、穗行數(shù)、行粒數(shù)和軸粗等進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因植株的株高、穗位以及雌穗的性狀與WT相比均無(wú)顯著差異（圖6），表明轉(zhuǎn)基因玉米籽粒中維生素E組分的改變以及植酸酶含量的提高并未對(duì)其農(nóng)藝性狀產(chǎn)生影響。

表2 籽粒中其他營(yíng)養(yǎng)成分分析

WT：野生型鄭58；TPB1、TPB2：轉(zhuǎn)基因純合株系；結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示；*表示≤0.05，**表示≤0.001

WT: wild type zheng 58; TPB1, TPB2: transgenic homozygous lines; Results are expressed as mean ± standard deviation (SD); *≤0.05, **≤0.001

WT：野生型鄭58；TPB1、TPB2：轉(zhuǎn)基因純合株系 WT: wild type zheng58; TPB1, TPB2: transgenic homozygous lines

3 討論

玉米是最重要的畜禽飼料原料之一，約占飼料成分的二分之一。玉米中低植酸酶活性和維生素E含量使得飼料中必須外源添加大量微生物來(lái)源的植酸酶和合成的維生素E。中國(guó)飼料工業(yè)年鑒2006/2007數(shù)據(jù)顯示，中國(guó)飼料工業(yè)一年需要合成的維生素E達(dá)17 500 t，按市場(chǎng)價(jià)150元/kg計(jì)算，則需要花費(fèi)26億元；而且近些年的數(shù)據(jù)還在不斷增加[27]。而目前，國(guó)際市場(chǎng)上植酸酶占飼料酶市場(chǎng)總量的40%，高達(dá)3×105t以上，對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)化為5 000 FTU·g-1的產(chǎn)品（工業(yè)植酸酶制劑的濃度范圍通常為5 000—100 000 FTU·g-1），市場(chǎng)價(jià)格7—35元/kg不等，花費(fèi)在21億—25億元，大大增加了飼料的成本[36]。轉(zhuǎn)玉米與微生物來(lái)源的植酸酶分別同時(shí)添加到飼料中飼喂肉雞發(fā)現(xiàn)，玉米表達(dá)的對(duì)肉雞的營(yíng)養(yǎng)作用與微生物來(lái)源的植酸酶在減少飼料無(wú)機(jī)磷添加和動(dòng)物糞便中磷酸鹽的排泄方面相似[20]，表明表達(dá)的玉米可以直接應(yīng)用于飼料生產(chǎn)。轉(zhuǎn)玉米與合成的DL-α-生育酚醋酸酯分別同時(shí)添加到飼料中飼喂肉雞發(fā)現(xiàn)，盡管玉米表達(dá)的維生素E與合成的維生素E對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能無(wú)顯著差異，但富含維生素Ｅ的轉(zhuǎn)基因玉米能夠提高肉仔雞血清中α-生育酚含量，改善血清和肝臟的抗氧化能力[37]，表明α-生育酚含量高的玉米不但可以用于飼料，而且要優(yōu)于合成的維生素E。本研究將、和表達(dá)盒串聯(lián)轉(zhuǎn)化玉米，獲得了具有植酸酶活性＞10 000 U·kg-1、α-生育酚含量達(dá)50—70 mg·kg-1以及草銨膦抗性的性狀聚合的玉米新材料，該玉米用于飼料，則飼料中不再需要外源添加維生素E和植酸酶就完全能夠滿足動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育的需求，可以降低飼料成本，增加生產(chǎn)性能，減少磷污染。另外，此轉(zhuǎn)基因玉米在同時(shí)表達(dá)3個(gè)基因、聚合3種性狀時(shí)，其植株農(nóng)藝性狀以及籽粒的營(yíng)養(yǎng)成分（除目標(biāo)性狀外）等與WT相比無(wú)顯著差異；表明獲得的轉(zhuǎn)基因材料既保持了該品種自身的所有性狀，同時(shí)又增加了除草劑抗性、改良了品質(zhì)性狀。這也為多性狀聚合育種提供了參考。

本研究中，轉(zhuǎn)基因玉米中不僅α-生育酚含量升高，α-三烯生育酚的含量也得到了提高。α-三烯生育酚的生物活性約相當(dāng)于合成的DL-α-生育酚醋酸酯生物活性的45%[38]，即本研究獲得的轉(zhuǎn)基因材料中活性維生素E成分有額外的改善。另外，多項(xiàng)研究表明，三烯生育酚也同樣具有清除自由基、抗氧化等作用。Che等[39]通過(guò)同時(shí)表達(dá)和，使得高粱中生育酚和三烯生育酚含量以及β-胡蘿卜素含量都得到了提高，并且大量積累的維生素E對(duì)β-胡蘿卜素儲(chǔ)存過(guò)程中的穩(wěn)定性起到了非常關(guān)鍵的作用。Konda等[33]同時(shí)表達(dá)和，使得大豆中維生素E含量提高；此轉(zhuǎn)基因大豆與高SDA的大豆材料雜交后，改善了PUFA的氧化穩(wěn)定性。在醫(yī)療方面，三烯生育酚還具有降低膽固醇、抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)等重要作用[40-41]。因此，從生物強(qiáng)化的角度來(lái)看，維生素E仍將是未來(lái)具有潛力的研究方向，通過(guò)同時(shí)轉(zhuǎn)化多個(gè)基因的手段，不但能夠獲得多性狀聚合的植物材料，而且還可以具有營(yíng)養(yǎng)豐富、耐儲(chǔ)存等優(yōu)良性狀。

4 結(jié)論

同時(shí)表達(dá)生育酚合成相關(guān)基因、植酸酶基因和草銨膦抗性基因，獲得了富含α-生育酚和植酸酶、且具有除草劑抗性的轉(zhuǎn)基因玉米，可應(yīng)用于飼料生產(chǎn)。

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Acquisition and characteristic analysis of transgenic maize with,, and

YAO XingLan, YANG WenZhu, LUO YanZhong, CHEN RuMei, WANG Lei, ZHANG Lan

(Biotechnology Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081)

】Corn seeds are the main feed ingredient for poultry and monogastric animals, but the content of α-tocopherol with high-activity in corn seeds is low, and maizerich, which cannot be effectively utilized by animals. Therefore, synthesized DL-α-tocopheryl acetate and phosphorus or microbial phytase are supplemented in the feed for optimal animal growth. These methods not only greatly increase the feed cost, but also cause the phosphorus pollution due to the undigested phytate. The aim of this study is to acquire maize seeds rich in α-tocopherol and high in phytase activity, and provide resources for forage maize breeding.【】Construct an expression vector with three expression cassette, and introduced into maize through agrobacterium infection method, glufosinate was used for screening; The positive transgenic plants were identified by spraying glufosinate and PCR analysis; RT-PCR analysis of target gene expression at the transcription level; Western blot analysis of target gene expression at the translation level; Phytase activity was measured by spectrophotometric method; vitamin E content was determined by HPLC. At the same time, the differences of other nutrients and agronomic traits between transgenic lines and wild types were compared.【】Constructed an expression vector with three expression cassette,driven by endosperm-specific promoter 123387,driven by embryo-specific promoter 13387,driven by constitutive promoter CaMV35S, and introduced into maize; Transgenic plants were identified by spraying glufosinate and PCR; Two transgenic homozygous maize lines TPB1 and TPB2 with good target traits were obtained after multiple generations of backcross transfer. RT-PCR and Western blot analysis showed that,andwere all highly expressed in transgenic lines. Phytase activity determination showed phytase activity reached to 10 000-13 000 U·kg-1, which is able to meet the needs of animal growth and development, vitamin E content measurement showed more than 90% of γ-tocopherol was transformed to α-tocopherol, and α-tocopherol content increased to 50-70 mg·kg-1. In addition, there were no significant differences on agronomic traits between transgenic lines and wild type, and there was no significant difference on nutrient component between TPB1 and wild type, slight difference but without adverse effect between TPB2 and wild type; and the transgenic plants were resistant to BASTA.【】These transgenic maize, which are rich in α-tocopherol and phytase, and also with herbicide resistance, can be applied for maize breeding to reduce feed cost, improve the utilization rate of phosphorus and reduce environmental pollution.

maize; phytase; vitamin E; α-tocopherol; glufosinate resistance

10.3864/j.issn.0578-1752.2020.24.002

2020-03-07；

2020-04-20

轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專(zhuān)項(xiàng)（2016ZX08003-002）

姚興蘭，E-mail：15751004149@163.com。通信作者張?zhí)m，E-mail：zhanglan01@caas.cn。王磊，E-mail：wanglei01@caas.cn

（責(zé)任編輯 李莉）