C1q腫瘤壞死因子相關(guān)蛋白9對(duì)大鼠心肌梗死后室性心律失常的影響?

魏言昭 李威 楊雙 李艷君 唐艷紅

C1q腫瘤壞死因子相關(guān)蛋白家族(CTRPs)其他成員與脂聯(lián)素(APN)具有相似的結(jié)構(gòu),研究證實(shí),CTRPs除APN 之外,至少包括15個(gè)成員,分別是CTRP1-15,與APN 存在驚人相似的組織結(jié)構(gòu)和生化特性。CTRPs的轉(zhuǎn)錄幾乎完全由脂肪細(xì)胞表達(dá),其中人和小鼠組織CTRPs的表達(dá)最廣泛,CTRP9在人類心臟上高表達(dá),在功能上作為活性心肌保護(hù)相關(guān)因子。已有證據(jù)表明,CTRP9主要通過脂聯(lián)素受體1(AdipoR1)在心肌梗死(MI),或糖尿病合并MI模型上對(duì)心肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞發(fā)揮抗凋亡、抗氧化、抗纖維化等作用,通過內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮舒張血管等作用[1－2]。目前研究證實(shí)CTRP9抗心肌重構(gòu)作用明顯,其對(duì)心肌電生理是否產(chǎn)生影響,以及是否存在CTRP9直接相關(guān)的離子通道途徑,未有相關(guān)研究。筆者通過Ad-CTRP9在MI大鼠中過表達(dá),觀察CTRP9對(duì)MI大鼠在體心肌電生理的影響并探討此影響的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理 體重接近的64只健康雄性SD 大鼠,12周齡,體重為(180±20)g,購自武漢大學(xué)人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。隨機(jī)分為四組:假手術(shù)對(duì)照(Control)組,心肌梗死(MI)組,Ad-CTRP9＋MI(Ad-CTRP9)組,Ad-GFP＋MI(Ad-GFP)組,每組16只。Ad-CTRP9組及Ad-GFP 組分別通過頸靜脈給藥Ad-CTRP9(上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司)或Ad-GFP(上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司),5天后予以MI造模,病毒的濃度為5×109pfu。所有動(dòng)物均在20～25℃的SPF 級(jí)環(huán)境內(nèi)恒溫飼養(yǎng)。MI造模時(shí)給大鼠腹腔注射60 mg/kg的3%戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉,將其仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上。行氣管插管術(shù),連接小動(dòng)物呼吸機(jī),正壓通氣,潮氣量10～15 ml,呼吸頻率70次/分。開胸后用擴(kuò)胸器固定,充分暴露其右心室游離壁的同時(shí)避免損傷肺葉。在肺動(dòng)脈圓錐左緣與左心耳根部交界處下2 mm 處用6/0線結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支,以即刻心尖表面顏色變白和心電圖Ⅱ?qū)?lián)ST 段抬高判定MI造模成功,心肌表面顏色變白與顏色正常交界區(qū)域定義為梗死周邊區(qū)。假手術(shù)組除不結(jié)扎外,其他處理同MI造模。

1.2 在體心電圖(ECG)記錄 MI造模14天后假手術(shù)組于相對(duì)應(yīng)時(shí)間,每組隨機(jī)選取10只大鼠進(jìn)行電生理檢查,給予3%戊巴比妥鈉(60 mg/kg,腹腔注射)麻醉大鼠后,利用Power Lab 數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)(澳大利亞ADInstruments公司)進(jìn)行Ⅱ?qū)?lián)體連續(xù)記錄心電圖2 h,利用Powerlab數(shù)據(jù)分析系統(tǒng),自動(dòng)分析和測(cè)量RR 間期、QT 間期和校正的QT(QTc)間期(采用Bazett算法計(jì)算QTc),測(cè)定的時(shí)域線性指標(biāo)包括RR 間期,所有竇性RR 間期的標(biāo)準(zhǔn)差(SDNN),頻譜分析包括低頻(LF)(nu)、高頻(HF)(nu)及LF/HF。

1.3 心室電生理檢查 MI造模14天后假手術(shù)組于相應(yīng)時(shí)間,每組隨機(jī)選取10只大鼠進(jìn)行電生理檢查,大鼠稱重后腹腔注射3%的戊巴比妥鈉(30 mg/kg)充分麻醉,經(jīng)腹腔注射肝素500 u/kg,肝素化10 min后自胸骨劍突下剪斷兩側(cè)肋骨暴露胸腔,迅速分離剪斷主動(dòng)脈。剪下心臟后先置于4℃改良臺(tái)式液中去除殘余血,然后將主動(dòng)脈套在Langendorff心臟灌流裝置上。以新鮮K-H 液逆行恒溫(37℃)、恒壓(5.86k Pa)灌流心臟15 min,K-H 液以95% O2＋CO2混合氣體,灌注流速控制為8 ml/min。2根電極分別連接肺動(dòng)脈圓錐及心尖部記錄心電圖,通過BL-420F 生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(澳大利亞ADInstruments公司)觀察記錄分析心律失常。

單相動(dòng)作電位(MAP)記錄:將刺激電極置于梗死周邊區(qū),假手術(shù)組于相對(duì)應(yīng)位置給予固定頻率起搏(脈寬2 ms方波,電壓5V),在LabChart7.0記錄分析軟件中選擇穩(wěn)定連續(xù)的8個(gè)MAP 波形,經(jīng)軟件自動(dòng)計(jì)算得出各部位單相動(dòng)作電位復(fù)極至20%、50%和90%時(shí)程(APD20,APD50和APD90)。

采用S1S2程序刺激的方法測(cè)量心室有效不應(yīng)期(VERP):S1∶S2＝8∶1,即8個(gè)S1發(fā)放一次S2刺激,S1S1起搏周長(zhǎng)為350 ms,刺激電壓為8 V。S1S2從200 ms以步長(zhǎng)10 ms逐步遞減。當(dāng)出現(xiàn)S2不能奪獲心室時(shí),則從上一個(gè)S1S2為起始以2 ms步長(zhǎng)遞減開始測(cè)量,將不能奪獲心室的最長(zhǎng)S1S2間期定義為該部位有效不應(yīng)期(ERP)。S1S1起搏周長(zhǎng)(PCL)從150 ms到30 ms,以10 ms連續(xù)遞減,直到出現(xiàn)MAP電交替(ALT)。每個(gè)PCL 持續(xù)30 s,然后休息30 s再進(jìn)行下一次刺激。ALT 定義為在連續(xù)10次MAP的振幅至少相差5%。

室性心律失常(VA)誘發(fā):經(jīng)5 min恢復(fù)自發(fā)搏動(dòng)以待消除心電記憶效應(yīng)后,保持相同條件,間斷給予刺激電壓5 V、頻率為50 Hz、持續(xù)時(shí)間2 s、連續(xù)單向方波的猝發(fā)型串刺激(Brust刺激),每次進(jìn)行10次重復(fù)Brust刺激,刺激之間正常心律恢復(fù)時(shí)間＞1 min。記錄VA 發(fā)生類型、持續(xù)時(shí)間,計(jì)算室性心律失常誘發(fā)率(Burst刺激誘發(fā)出室性心動(dòng)過速、心室顫動(dòng)的動(dòng)物數(shù)除以總數(shù))。

1.4 心肌組織CTRP9、KChIP2 和Kir2.1 蛋白檢測(cè) MI造模14天后假手術(shù)組于相應(yīng)時(shí)間,利用蛋白質(zhì)免疫印跡法測(cè)定心肌組織中CTRP9、KChIP2和Kir2.1的表達(dá)量。每組隨機(jī)選取6只大鼠,用剪刀剪取梗死周邊區(qū)心肌組織,置于組織勻漿器中,加入總蛋白提取液,勻漿5～20 min直到組織充分破碎,然后冰上放置10～20 min 后,再勻漿5～20 min,將勻漿液吸出放到1.5 ml離心管中。以9 000 rpm,4℃離心10 min,取適量上清置于新的1.5 ml離心管中,提取細(xì)胞總蛋白,使用BCA 蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒(北京艾德來)測(cè)定樣品蛋白濃度。將蛋白質(zhì)樣品與對(duì)應(yīng)的SDS上樣緩沖液混合,100℃,加熱10 min。將凝膠板放入電泳槽中,吸取樣品并加樣。設(shè)置電壓為80 V 進(jìn)行凝膠電泳,30 min后觀察電泳情況。調(diào)整電壓為100 V,繼續(xù)電泳2 h,再次觀察電泳情況,直到溴酚藍(lán)達(dá)至膠板下沿約1 cm處,結(jié)束電泳;SDS-PAGE 電泳分離蛋白后將蛋白轉(zhuǎn)入PVDF膜上。移入相應(yīng)離子通道抗體稀釋液中,在4℃下孵育過夜。然后在膜的蛋白面?zhèn)燃尤胄屡渲频腅CL 混合溶(A∶B＝1∶1),在暗室中曝光、顯影、定影。AlphaEaseFC 軟件分析目標(biāo)帶的光密度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS 23.0軟件進(jìn)行分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料以ˉx±s 表示,同組自身前后比較采用配對(duì)t 檢驗(yàn),同組自身多個(gè)時(shí)點(diǎn)的比較用重復(fù)測(cè)量資料的方差分析。以P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 四組心肌組織CTRP9的表達(dá)水平 與Control組相比,MI組心肌中CTRP9表達(dá)水平顯著降低;與Ad-GFP組相比,Ad-CTRP9組CTRP9表達(dá)水平升高并顯著高于Control組,P 均＜0.05),表明腺病毒成功轉(zhuǎn)染CTRP9并且轉(zhuǎn)染效率高。如圖1和表1所示。

圖1 CTRP9在心肌組織中的表達(dá)量

表1 心肌組織中CTRP9的表達(dá)量及KChIP2和Kir2.1在心肌組織中的表達(dá)量

2.2 ECG 參數(shù)和心室HRV 的變化 與Control組相比,MI組和Ad-GFP組大鼠QT間期、QTc間期和QRS時(shí)限均延長(zhǎng),而與Ad-GFP組比較,Ad-CTRP9組大鼠QT間期、QTc 間期和QRS波時(shí)限顯著縮短(P 均＜0.05);與Control組相比,MI組SDNN 均下降,而與Ad-GFP 組比較,Ad-CTRP9 組SDNN顯著提高;與Control組相比,MI組LF 及LF/HF值顯著增加,HF(nu)值顯著降低;而Ad-CTRP9組這一趨勢(shì)減弱,LF 及LF/HF 值降低,HF 值增加,并使之趨于正常。如表2和表3所示。

表2 四組心電指標(biāo)的比較/ms

表3 四組心率變異性的比較

2.3 四組心室ERP和APD 的比較 與Control組相比,MI 后 梗 死 周 邊 區(qū)ERP、APD20、APD50和APD90顯 著 延 長(zhǎng),相 反,與Ad-GFP 組 比,Ad-CTRP9組ERP、APD20、APD50和APD90顯著縮短(P 均＜0.05)。如表4所示。

2.4 ALT周長(zhǎng)的比較 四組均誘發(fā)出APD電交替,梗死周邊區(qū)APD電交替周長(zhǎng)如圖所示,與Control組相比,MI組梗死周邊區(qū)APD 電交替周長(zhǎng)顯著延長(zhǎng),與Ad-GFP組比較,Ad-CTRP9組誘發(fā)閾值提高,梗死周邊區(qū)電交替周長(zhǎng)縮短。如表4和圖2所示。

表4 四組心電指標(biāo)的比較/ms

2.5 VA 誘發(fā)率的比較 與Control組相比,MI組的誘發(fā)率顯著增加(10/10 vs 0/10,P ＜0.05),而Ad-CTRP9組較Ad-GFP組的誘發(fā)率下降(3/10 vs 10/10,P＜0.05)。

圖3 四組Burst刺激誘發(fā)VA 典型圖

2.6 四組KChIP2和Kir2.1蛋白的比較 與Control組相比,MI組KChIP2和Kir2.1蛋白的表達(dá)顯著降低,Ad-CTRP9組KChIP2和Kir2.1蛋白高于Ad-GFP組。如圖4和表1所示。

圖4 各組心肌組織中KChIP2的表達(dá)量

3 討論

心臟電重構(gòu)是對(duì)MI后結(jié)構(gòu)和功能改變的應(yīng)激反應(yīng),電重構(gòu)的特征之一是復(fù)極化異常,特別是APD 的延長(zhǎng)[3],既往研究表明,復(fù)極化的電異質(zhì)性是誘發(fā)VA 的主要原因。MI后電生理特性的透壁梯度(包括興奮性,APD 和心肌不應(yīng)性的分散)為折返提供了基礎(chǔ),折返是心律不齊的主要機(jī)制。在本研究中,筆者發(fā)現(xiàn)MI后,梗死周邊區(qū)的心室ERP和APD 延長(zhǎng),心室易損性增加,CTRP9可明顯改善MI后ERP、APD 延長(zhǎng)和心室易感性,提示CTRP9可改善MI后的電重構(gòu)。心臟重構(gòu)的離子機(jī)制涉及外向K＋電流(Ik),內(nèi)向Ca2＋電流(ICa)和內(nèi)向晚Na＋電流(INa)之間的復(fù)雜相互作,除了改變電流密度外,Ik、ICa和INa的空間分布也發(fā)生了變化,這些變化改變了心臟的正常復(fù)極化梯度,可能導(dǎo)致心律失常的發(fā)生[4]。既往研究表明,各種K＋電流,如快速外向瞬時(shí)鉀電流(Ito),快速激活的延遲整流鉀電流(Ikr)和延遲整流鉀通道(Iks)在梗死周邊區(qū)心肌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)[5],促進(jìn)VA 的發(fā)生。

KChIP2基因缺陷導(dǎo)致Ito完全喪失,易發(fā)生室性心動(dòng)過速,KChIP2是一種KChIPs家族的Ito通道相互作用蛋白,作為Kv通道的輔助亞基,對(duì)Kv通道的正常功能發(fā)揮了重要作用[6]。Kir2.1是IK1的成孔α亞基,IK1是靜息電位和動(dòng)作電位后期復(fù)極化的主要決定因素,研究表明IK1的下調(diào)導(dǎo)致心力衰竭后的致命性心律失常[7],MI后心律失常的發(fā)生與靜息電位的降低和IK1表達(dá)的減少緊密相關(guān)[5－8],適當(dāng)增強(qiáng)IK1而使靜息電位超極化有利于消除異常的自律性。IK1的抑制降低了復(fù)極化時(shí)有效不應(yīng)期與APD 的比率,因此降低了復(fù)極化后的心肌不應(yīng)性,表明抑制IK1可能導(dǎo)致HF 或阿斯綜合征后出現(xiàn)的心律失常,促進(jìn)IK1的表達(dá)可能降低這種折返性心律失常的易感性。本研究中CTRP9 過表達(dá)能緩解MI大鼠梗死周邊區(qū)KChIP2 和Kir2.1 的表達(dá)減少,因而上調(diào)Ito,IK1并減少VA 的發(fā)生。本研究證實(shí)CTRP9 能增加梗死周邊區(qū)心肌中KChIP2 和Kir2.1的表達(dá),或許是一種有效的抗心律失常策略。