不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠腎臟纖維化的影響及作用機(jī)制研究

付常喜 馬剛 李平 彭朋

摘? ? 要：對(duì)比長(zhǎng)期中等強(qiáng)度持續(xù)運(yùn)動(dòng)（MCE）和高強(qiáng)度間歇運(yùn)動(dòng)（HIE）對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）腎臟纖維化的影響，并探討膠原代謝通路（合成代謝和分解代謝）在其間的作用機(jī)制，研制高血壓腎病患者的最佳康復(fù)運(yùn)動(dòng)處方。方法：45只3月齡雄性SHR隨機(jī)分為高血壓安靜組（SHR-S組）、中等強(qiáng)度持續(xù)運(yùn)動(dòng)組（SHR-M組）、高強(qiáng)度間歇運(yùn)動(dòng)組（SHR-H組），同時(shí)，將10只Wistar-Kyoto大鼠作為正常血壓對(duì)照組（WKY組）。WKY組和SHR-S組大鼠在鼠籠內(nèi)安靜飼養(yǎng)，SHR-M組和SHR-H組大鼠分別進(jìn)行18周相應(yīng)方式的運(yùn)動(dòng)干預(yù)。實(shí)驗(yàn)后，使用無(wú)創(chuàng)血壓儀檢測(cè)尾動(dòng)脈血壓;以血尿素氮（BUN）、血清肌酐（SCr）及24 h尿蛋白含量評(píng)價(jià)腎功能;使用H-E和Masson染色進(jìn)行腎臟組織病理學(xué)觀察，并對(duì)腎小管間質(zhì)損傷進(jìn)行評(píng)分以及計(jì)算間質(zhì)膠原容積分?jǐn)?shù)（CVF）;采用Western blot法檢測(cè)腎臟轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）、磷酸化Smad2/3（p-Smad2/3）、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（CTGF）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）和組織金屬蛋白酶抑制物-1（TIMP-1）蛋白表達(dá)量;采用免疫組織化學(xué)檢測(cè)腎臟α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）表達(dá)量。結(jié)果：SHR-S組的血壓、24 h蛋白尿、BUN、SCr、腎小管間質(zhì)損傷評(píng)分、CVF、TGF-β1、p-Smad2、p-Smad23、CTGF蛋白表達(dá)量、TIMP-1蛋白表達(dá)量和腎臟α-SMA表達(dá)量均高于WKY組（p<0.05），而MMP-9蛋白表達(dá)量和MMP-9/TIMP-1比值均低于WKY組（p<0.05）;SHR-M組的血壓、24 h蛋白尿、BUN、SCr、腎小管間質(zhì)損傷評(píng)分、CVF、TGF-β1、p-Smad2/3、CTGF蛋白表達(dá)量、TIMP-1蛋白表達(dá)量和腎臟α-SMA表達(dá)量均低于SHR-S組（p<0.05），而MMP-9蛋白表達(dá)量和MMP-9/TIMP-1比值均高于SHR-S組（p<0.05）;SHR-H組的腎小管間質(zhì)損傷評(píng)分和CVF均高于SHR-S組（p<0.05），但是血壓、腎功能、TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3、CTGF蛋白表達(dá)量及腎臟α-SMA表達(dá)量相較SHR-S組均無(wú)顯著差異（p>0.05）;SHR-H組的血壓、腎功能、腎小管間質(zhì)損傷評(píng)分、CVF、TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3、CTGF蛋白表達(dá)量、腎臟α-SMA表達(dá)量均高于SHR-M組（p<0.05），而MMP-9蛋白表達(dá)量、TIMP-1蛋白表達(dá)量和MMP-9/TIMP-1比值均低于SHR-M組（p<0.05）。結(jié)論：長(zhǎng)期中等強(qiáng)度持續(xù)運(yùn)動(dòng)通過(guò)維持膠原代謝穩(wěn)態(tài)（即促進(jìn)降解并降低合成）及抑制成纖維細(xì)胞向成肌纖維細(xì)胞分化而減輕自發(fā)性高血壓大鼠腎臟纖維化并改善腎功能;長(zhǎng)期高強(qiáng)度間歇運(yùn)動(dòng)則進(jìn)一步破壞膠原穩(wěn)態(tài)平衡（抑制膠原降解，但對(duì)膠原合成無(wú)影響）加重自發(fā)性高血壓大鼠腎臟纖維化，但并未引起成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化及腎功能繼續(xù)惡化。因此，中等強(qiáng)度持續(xù)運(yùn)動(dòng)仍然是高血壓腎病患者康復(fù)的最佳運(yùn)動(dòng)方式，長(zhǎng)期高強(qiáng)度間歇運(yùn)動(dòng)對(duì)高血壓腎病患者的安全性和有效性有待進(jìn)一步研究。

關(guān)鍵詞：中等強(qiáng)度持續(xù)運(yùn)動(dòng);高強(qiáng)度間歇運(yùn)動(dòng);高血壓腎病;腎臟纖維化;細(xì)胞外基質(zhì);膠原代謝

中圖分類號(hào)：G 804.5? ? ? ? ? 學(xué)科代碼：040302? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Abstract：To analyze the effects of long-term moderate intensity continuous exercise（MCE） and high intensity interval exercise （HIE） on renal fibrosis in spontaneously hypertensive rats （SHR） and the possible mechanism of collagen metabolic pathway （anabolism and catabolism）， so as to develop the optimal exercise rehabilitation prescription for patients of hypertensive nephropathy. Methods： Forty-five 3-month-old male SHR were randomly divided into sedentary （SHR-S）， MCE （SHR-M） or HIE （SHR-HIE） groups， at mean time， 10 Wistar-Kyoto（WKY） were used as normotensive group. Rats of WKY and SHR-R groups kept quietly at cage while those of SHR-M and SHR-H groups performed corresponding mode of exercise intervention for 18 weeks. After experiment， caudal artery blood pressure was measured by non-invasive blood pressure tester; renal function was tested by blood urea nitrogen （BUN）， serum creatinine （SCr） and 24 h urine protein; renal histopathological observation was conducted by HE and Masson’s staining to grade renal tubule interstitial injury and interstitial collagen volume fraction（CVF） respectively; protein expression of transforming growth factor-β1 （TGF-β1）， phosphorylation of Smad2/3 （p-Smad2/3）， connective tissue growth factor （CTGF）， matrix metalloproteinase-9 （MMP-9） and tissue inhibitors of metalloproteinase-1 （TIMP-1） was tested by Western blot; the expression of α-smooth muscle actin （α-SMA） was tested through immunohistochemistry. Results： Blood pressure， 24 h urine protein， BUN， SCr， renal tubule interstitial injury score， CVF， TGF-β1， p-Smad2， p-Smad23， CTGF protein expression， TIMP-1 protein expression and kidney α-SMA expression were higher（p<0.05）， while MMP-9 protein expression and MMP-9/TIMP-1 ratio were lower （p<0.05） in SHR-S group than WKY group; blood pressure， 24 h urine protein， BUN， SCr， renal tubule interstitial injury score， CVF， TGF-β1， p-Smad2/3， CTGF protein expression， TIMP-1 protein expression and kidney α-SMA were lower （p<0.05）， while MMP-9 protein expression and MMP-9/TIMP-1 ratio were both higher （p<0.05） in SHR-M group than SHR-S group; renal tubule interstitial injury score and CVF were both higher （p<0.05） than SHR-S group， but blood pressure， renal function， protein of TGF-β1， p-Smad2， p-Smad3， CTGF protein expression and kidney α-SMA were no significantly different （p>0.05） in SHR-H group; blood pressure， renal function， renal tubule interstitial injury score， CVF， TGF-β1， p-Smad2， p-Smad3 and kidney α-SMA expression were higher （p<0.05）， while MMP-9 protein expression， TIMP-1 protein expression and MMP-9/TIMP-1 ratio were lower （p<0.05） in SHR-H group than SHR-M group. Conclusions： Long-term MCE alleviated renal fibrosis of SHR through maintenance of collagen metabolism homeostasis （promoted degradation and reduced synthesis） as well as inhibition of differentiation of fibroblasts into myofibroblasts; however， long-term HIE exacerbated renal fibrosis in spontaneously hypertensive rats by further destruction of collagen homeostasis （suppressed collagen degradation， but had no effect on collagen synthesis） but failed to induce phenotype transformation of fibroblasts and subsequent renal dysfunction. Therefore， MCE is still the optimal exercise rehabilitation modality for patients of hypertensive nephropathy， although the safety and efficacy of long-term HIE to patients with hypertensive nephropathy should be further confirmed.

Keywords：moderate-intensity continuous exercise; high-intensity interval exercise; hypertensive nephropathy; renal fibrosis; extracellular matrix; collagen metabolism

慢性腎臟疾病（chronic renal disease，CKD）是各種原因引起的慢性腎臟結(jié)構(gòu)和功能障礙，其中高血壓是繼發(fā)性CKD首要病因（腎小球腎炎則是原發(fā)性CKD的主要原因），即高血壓腎病[1]。CKD惡化的主要特征是腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞缺失，取而代之的是細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）。ECM的主要成分是膠原，由于膠原代謝平衡穩(wěn)態(tài)失調(diào)（即合成增加、降解減少）以及成纖維細(xì)胞向成肌纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，進(jìn)而引起ECM過(guò)度沉積以致腎臟纖維化，后者是所有CKD發(fā)展到腎功能衰竭的共同特征以及終末期腎病的共同病理特點(diǎn)[2]。分子生物學(xué)研究證實(shí)，基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）/組織金屬蛋白酶抑制物（tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMPs）[3]和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）-Smad2/3[4]分別是調(diào)節(jié)膠原分解與合成代謝的主要調(diào)控因子。MMPs催化ECM降解，同時(shí)TIMPs能夠抑制MMPs活性，以防止ECM過(guò)度降解[3]?；几哐獕耗I病時(shí)，MMP-9和TIMP-1表達(dá)異常造成MMP-9/TIMP-1穩(wěn)態(tài)失衡，進(jìn)而促進(jìn)纖維化[5]。TGF-β1通過(guò)磷酸化胞漿中的Smad2和Smad3，繼之上調(diào)多種促纖維化因子，例如結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（connective tissue growth factor，CTGF）基因表達(dá)，同時(shí)還能促進(jìn)成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化、上調(diào)TIMPs而間接抑制MMPs的活性，最終導(dǎo)致腎臟纖維化[6]。高血壓大鼠腎小球和腎小管間質(zhì)細(xì)胞中的TGF-β1及其下游效應(yīng)分子表達(dá)量均顯著增加[7]。多項(xiàng)研究表明[3-4]，MMP-9/TIMP-1穩(wěn)態(tài)失衡（膠原分解減少）以及TGF-β1-Smad2/3信號(hào)持續(xù)激活（膠原合成增加）是各種病因引起腎臟纖維化的主要分子生物學(xué)機(jī)制，調(diào)控上述信號(hào)途徑成為防治腎臟纖維化的重要靶點(diǎn)。

運(yùn)動(dòng)療法是高血壓患者非藥物治療的主要手段，能夠降低血壓、改善多種心血管危險(xiǎn)因素、防治并發(fā)癥、提高生活質(zhì)量并降低住院率與死亡率[8]。中等強(qiáng)度持續(xù)運(yùn)動(dòng)（moderate intensity continuous exercise，MCE）（簡(jiǎn)稱有氧運(yùn)動(dòng)，下同）是高血壓患者康復(fù)療法的主要形式，其對(duì)腎臟的作用包括增加腎血流量、減輕氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)、降低尿蛋白量并改善腎功能，因此同樣適用于高血壓腎病患者[9-14]。高強(qiáng)度間歇訓(xùn)練（high intensity interval exercise，HIE）是近年來(lái)新興的一種運(yùn)動(dòng)模式，相對(duì)于傳統(tǒng)的MCE具有時(shí)效性、趣味性等突出特點(diǎn)[15-16]，其對(duì)運(yùn)動(dòng)員以及普通健康人群生理機(jī)能、運(yùn)動(dòng)能力的改善作用較為肯定，但對(duì)心血管疾病的健康效應(yīng)尚有爭(zhēng)議[17-21]。課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)，MCE能夠抑制自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR）病理性心臟肥大以及心肌纖維化[18]，短期（8周）HIE的效果與MCE相似，而長(zhǎng)期（18周）HIE卻會(huì)加重心臟重塑并加速心力衰竭進(jìn)程[20]，說(shuō)明HIE對(duì)病理狀態(tài)下心臟的良性作用可能存在“一過(guò)性/暫時(shí)性”特征。HIE對(duì)高血壓腎病的作用則鮮有學(xué)者關(guān)注，最近一項(xiàng)針對(duì)CKD患者（n=14）的隨機(jī)對(duì)照實(shí)驗(yàn)表明[22]，短期（3次/周，共12周）HIE和MCE均可改善心肺功能、促進(jìn)骨骼肌蛋白合成、減輕臨床癥狀（疲勞、呼吸困難、嗜睡等），且無(wú)不良反應(yīng)發(fā)生，初步證實(shí)了HIE的可行性、安全性和有效性。但長(zhǎng)期HIE對(duì)腎臟纖維化的影響及機(jī)制尚不明確。因此，本研究以SHR為動(dòng)物模型，對(duì)比長(zhǎng)期（18周，相當(dāng)于人類運(yùn)動(dòng)10年）不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)（MCE vs HIE）對(duì)腎臟纖維化的影響并探討膠原代謝通路（合成代謝和分解代謝）在其中的作用機(jī)理，探討高血壓腎病患者的最佳康復(fù)運(yùn)動(dòng)處方。本研究假設(shè)長(zhǎng)期MCE和HIE均可抑制SHR腎臟纖維化并改善腎功能，其中以HIE的作用更為顯著。

1? ?研究對(duì)象與方法

1.1? 實(shí)驗(yàn)對(duì)象與分組

10只Wistar-Kyoto大鼠以及45只3月齡雄性SHR，體質(zhì)量為（213±15）g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)為SCXK（京）2018-0027。將SHR按照隨機(jī)數(shù)字表分為高血壓安靜組（SHR sedentary，SHR-S組）（n=15）、MCE組（SHR-M組）（n=15）和HIE組（SHR-H組）（n=15），10只Wistar-Kyoto大鼠作為正常血壓對(duì)照組（WKY組）（n=10）。大鼠飼養(yǎng)環(huán)境：溫度24～26℃，濕度為50%～60%，12：12 h明暗周期，分籠（5只/籠）標(biāo)準(zhǔn)飼料飼養(yǎng)，自由進(jìn)食水。WKY組和SHR-S組大鼠在鼠籠內(nèi)安靜飼養(yǎng)，SHR-M、SHR-H組分別進(jìn)行18周持續(xù)跑臺(tái)訓(xùn)練和間歇跑臺(tái)訓(xùn)練。

1.2? 運(yùn)動(dòng)方案

所有大鼠先進(jìn)行5 d適應(yīng)性訓(xùn)練，運(yùn)動(dòng)方式：跑臺(tái)（段氏DSPT-208型，安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司）持續(xù)運(yùn)動(dòng)，強(qiáng)度：10～15 m/min，坡度：0°，時(shí)間：20～30 min/d。隨后按照課題組既往建立的遞增負(fù)荷力竭運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)測(cè)試大鼠最快跑速（maximal velocity，Vmax）[18，20]：起始負(fù)荷為5 m/min，每隔2 min增加1.5 m/min（坡度始終為0°），直至力竭，記錄最后一級(jí)負(fù)荷對(duì)應(yīng)的跑速即為Vmax。

Vmax測(cè)試后休息2 d，隨后SHR-M組和SHR-H組分別進(jìn)行18周不同方式的運(yùn)動(dòng)，負(fù)荷（包括訓(xùn)練強(qiáng)度、持續(xù)時(shí)間、完成組數(shù)以及每周頻率）隨時(shí)間逐漸遞增，具體方案見表1。分別于第4、8、12和16周重新測(cè)定Vmax以及時(shí)調(diào)整訓(xùn)練強(qiáng)度（跑速）[20]。

1.3? 尾動(dòng)脈血壓測(cè)量

末次訓(xùn)練后48 h，采用智能無(wú)創(chuàng)血壓測(cè)量?jī)x（BP-2010E，日本Softron公司）測(cè)量尾動(dòng)脈血壓。大鼠處于清醒、安靜狀態(tài)下，尾部加溫后將傳感器置于尾根部監(jiān)測(cè)血流量變化，當(dāng)脈沖波形穩(wěn)定（即大鼠處于穩(wěn)定狀態(tài)）時(shí)自動(dòng)測(cè)量血壓，重復(fù)3次，取均值。指標(biāo)包括收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP），計(jì)算平均動(dòng)脈壓（MAP）;MAP=（SBP+DBP×2）/3。

1.4? 尿液、血液標(biāo)本采集以及腎臟組織取材

尾動(dòng)脈血壓測(cè)量后禁食，自由飲水。用代謝籠（Columbus CLAMS，美國(guó)Columbus公司生產(chǎn)）收集大鼠24 h尿液，并將2 mL裝入離心管中。大鼠稱量體質(zhì)量后用10%水合氯醛（劑量：0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉并固定，腹主動(dòng)脈取血5 mL，離心取血清。分離左側(cè)腎臟和腎上腺以及胸腺，迅速在冷生理鹽水中洗滌，濾紙吸干水分后分別稱重（mg）并計(jì)算與體質(zhì)量（g）的比值作為腎臟質(zhì)量指數(shù)、腎上腺質(zhì)量指數(shù)和胸腺質(zhì)量指數(shù)，其中腎上腺質(zhì)量指數(shù)和胸腺質(zhì)量指數(shù)用于檢測(cè)是否發(fā)生腎上腺肥大和胸腺萎縮，并作為慢性應(yīng)激指標(biāo)。取約1 cm3腎臟組織用于組織病理學(xué)觀察，其余腎臟組織用錫紙包裹迅速放至-80℃低溫冰箱凍存，待測(cè)各蛋白表達(dá)量。

1.5? 腎功能檢測(cè)

采用光柵分光光度計(jì)（722 型，上海分析儀器廠）以雙縮脲法檢測(cè)尿液樣本24 h尿蛋白含量，生化分析儀（AU680，美國(guó)Bachman公司制造）以酶法檢測(cè)血尿素氮（BUN）及血清肌酐（SCr）含量。嚴(yán)格按照試劑盒（均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司）說(shuō)明進(jìn)行操作，重復(fù)3次，取均值。

1.6? 腎臟病理組織學(xué)觀察

將腎臟組織用多聚甲醛溶液浸泡24 h，經(jīng)梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，利用病理切片機(jī)（RM2255，德國(guó)LEICA公司制造）制備 4 μm 厚切片。脫臘后分別進(jìn)行蘇木素-伊紅（H-E）染色和Masson染色，中性樹膠封片。每只大鼠取3張切片，每張切片隨機(jī)選取10個(gè)高倍（×400）顯微鏡（IX71型，日本OLYMPUS公司制造）下觀察到的腎臟組織病理形態(tài)改變情況。H-E染色觀察腎小管間質(zhì)損傷情況（是否存在腎小管壞死，腎小管擴(kuò)張、萎縮，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小管上皮細(xì)胞水腫以及腎小管管型）并進(jìn)行腎小管間質(zhì)損傷評(píng)分。按照損傷程度由輕度到嚴(yán)重評(píng)分為0～4分[23]：0分，正常腎臟;1分，損傷<25%;2分，損傷占25%～50%;3分，損傷占50～75%;4分，損傷>75%。由3名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理科醫(yī)師分別進(jìn)行觀察并取均值。Masson染色后用圖像分析軟件（Image Pro Plus 6.0，美國(guó)Media Cybernetics公司研發(fā)）測(cè)量切片中結(jié)締組織面積與所觀測(cè)面積的比值作為間質(zhì)膠原容積分?jǐn)?shù)（CVF）。

1.7? Western Blot檢測(cè)法

Western Blot法檢測(cè)腎臟TGF-β1（Santa cruz公司研發(fā)，稀釋比為1∶1 000）、Smad2（Abcam公司研發(fā)，稀釋比為1∶2 000）、Smad3（Abcam公司研發(fā)，稀釋比為1∶2 000）、磷酸化Smad2（p-Smad2）（Abcam公司研發(fā)，稀釋比為1∶1 000）、磷酸化Smad3（p-Smad3）（Abcam公司研發(fā)，稀釋比為1∶1 000）、CTGF（Abcam公司研發(fā)，稀釋比為1∶2 000）、MMP-9（Santa cruz公司研發(fā)，稀釋比為1∶1 000）和TIMP-1（Santa cruz公司研發(fā)，稀釋比為1∶2 000）蛋白表達(dá)量。取適量腎臟組織勻漿后提取總蛋白，用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定總蛋白濃度。取100? μg蛋白樣品在垂直電泳儀上經(jīng)SDS-PAGE分離，隨后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。4 ℃靜置孵育過(guò)夜，二抗（武漢博士德生物工程有限公司，1∶5 000）37 ℃孵育2 h。充分洗滌后，ECL發(fā)光成像，掃描各條帶灰度值。內(nèi)參蛋白為β-actin（Santa cruz公司研發(fā)，稀釋比為1∶10 000），將目的蛋白灰度值與β-actin的比值作為相對(duì)表達(dá)量，計(jì)算各組各蛋白相對(duì)表達(dá)量與WKY組的比值作為相對(duì)表達(dá)率。

1.8? 免疫組織化學(xué)分析

免疫組織化學(xué)分析腎臟α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）表達(dá)量。石蠟切片脫蠟、水化，胃蛋白酶修復(fù)抗原 30 min。加入α-SMA一抗（Abcam公司研發(fā)，稀釋比為1∶250）封閉，4 ℃過(guò)夜。PBS洗滌后加二抗（武漢博士德生物工程有限公司研發(fā)，1∶500）孵育 20 min，DAB顯色，蘇木素輕度復(fù)染1～2 min，充分沖洗反藍(lán)，常規(guī)脫水、透明、封片。光鏡（儀器型號(hào)、產(chǎn)地同1.6）下觀察α-SMA 分布并進(jìn)行半定量積分評(píng)定。

1.9? 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理與分析

使用“SPSS 20.0 for Windows”軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理與分析。所有數(shù)據(jù)用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。各參數(shù)組間比較采用單因素方差分析，若F檢驗(yàn)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05），則多重比較采用LSD檢驗(yàn)。顯著性水平定為α=0.05。

2? ?研究結(jié)果

2.1? 樣本量分析

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，SHR-S組、SHR-M組和SHR-H組的大鼠分別死亡3只、1只和4只，SHR-M組和SHR-H組各有2只拒跑，因此，最終納入統(tǒng)計(jì)的樣本量n=43，各組樣本量分別為：WKY組（n=10）、SHR-S組（n=12）、SHR-M組（n=12）和SHR-H組（n=9）。

2.2? 體質(zhì)量和腎臟指數(shù)的變化

SHR-S組的腎臟質(zhì)量和腎臟質(zhì)量指數(shù)高于WKY組（p<0.05）;SHR-M組的體質(zhì)量、腎臟質(zhì)量和腎臟質(zhì)量指數(shù)低于SHR-S組（p<0.05）;SHR-H組的體質(zhì)量低于SHR-S組（p<0.05），腎臟質(zhì)量和腎臟質(zhì)量指數(shù)高于SHR-M組（p<0.05）（見表2）。

2.3? 腎上腺質(zhì)量指數(shù)和胸腺質(zhì)量指數(shù)的變化

SHR-S組的腎上腺質(zhì)量指數(shù)高于WKY組（p<0.05）、胸腺質(zhì)量指數(shù)低于WKY組（p<0.05）;SHR-M組的腎上腺質(zhì)量指數(shù)低于SHR-S組（p<0.05）、胸腺質(zhì)量指數(shù)高于SHR-S組（p<0.05）;SHR-H組的腎上腺質(zhì)量指數(shù)高于SHR-S和SHR-M組（p<0.05）、胸腺質(zhì)量指數(shù)低于SHR-S組和SHR-M組（p<0.05）（見圖1）。

2.4? 動(dòng)脈血壓的變化

SHR-S組的SBP、DBP和MAP均高于WKY組（p<0.05）;SHR-M組的SBP、DBP和MAP低于SHR-S組（p<0.05）;SHR-H組的各血壓值高于SHR-M組（p<0.05），但相較SHR-S組無(wú)顯著性差異（p>0.05，見圖2）。

2.5? 腎功能的變化

SHR-S組的24 h蛋白尿、BUN和SCr均高于WKY組（p<0.05）;SHR-M組的24 h蛋白尿、BUN和SCr均低于SHR-S組（p<0.05）;SHR-H組的腎功能各參數(shù)高于SHR-M組（p<0.05），但相較SHR-S組均無(wú)顯著性差異（p>0.05，見圖3）。

2.6? 腎臟病理組織學(xué)分析

HE染色顯示胞漿呈紅色，胞核呈藍(lán)色。WKY組的腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)清晰完整，無(wú)明顯病理改變，腎小管間質(zhì)損傷評(píng)分為0;SHR-S組的腎小球基底膜增厚，腎小囊腔擴(kuò)張，血管球與囊腔壁界限不明顯，空泡變性，腎小管上皮細(xì)胞水腫壞死，管腔擴(kuò)張，間質(zhì)增厚，出現(xiàn)各種管型，腎小管間質(zhì)損傷評(píng)分明顯高于WKY組（p<0.05）;SHR-M組仍存在腎小球基底膜稍厚，腎小囊腔稍增大，部分血管球與囊腔壁界限不清晰，腎管上皮細(xì)胞水腫以及管腔擴(kuò)張，但程度有所減輕，腎小管間質(zhì)損傷評(píng)分低于SHR-S組（p<0.05）;SHR-H組的病理改變進(jìn)一步加重，腎小管間質(zhì)損傷評(píng)分高于SHR-S組和SHR-M組（p<0.05）。腎小管間質(zhì)損傷評(píng)分見圖4。

Masson 染色顯示膠原纖維呈藍(lán)色。WKY 組間質(zhì)膠原分布稀疏，著色較淡;SHR-S組的腎小球、腎小管周圍組織排列紊亂且藍(lán)色深染膠原纖維增多，CVF高于WKY組（p<0.05）;SHR-M組的纖維化程度減輕，CVF較SHR-S組下降（p<0.05）;SHR-H組的纖維化進(jìn)一步加重，CVF高于SHR-S和SHR-M組（p<0.05）。腎臟CVF的變化見圖5。

2.7? 腎臟TGF-β1-Smad2/3信號(hào)途徑各蛋白表達(dá)量的變化

SHR-S組的TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3和CTGF蛋白表達(dá)量高于WKY組（p<0.05）;SHR-M組的TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3和CTGF蛋白表達(dá)量低于SHR-S組（p<0.05）;SHR-H組上述蛋白表達(dá)量均高于SHR-M組（p<0.05），但相較SHR-S組均無(wú)顯著性差異（p>0.05）。各組的Smad2和Smad3蛋白表達(dá)量均無(wú)顯著性差異（p>0.05，見圖6）。

2.8? 腎臟MMP-9/TIMP-1平衡穩(wěn)態(tài)的變化

SHR-S組的TIMP-1蛋白表達(dá)量高于WKY組（p<0.05），MMP-9蛋白表達(dá)量以及MMP-9/TIMP-1值低于WKY組（p<0.05）;SHR-M組的TIMP-1蛋白表達(dá)量低于SHR-S組（p<0.05），MMP-9蛋白表達(dá)量以及MMP-9/TIMP-1值高于SHR-S組（p<0.05）;SHR-H組各指標(biāo)均低于SHR-S組和SHR-M組（p<0.05）。見圖7。

2.9? 腎臟α-SMA蛋白表達(dá)量的變化

免疫組織化學(xué)分析結(jié)果顯示，陽(yáng)性部位為棕黃色，細(xì)胞核呈淡藍(lán)色。WKY組僅見腎動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)蛋白α-SMA呈陽(yáng)性表達(dá)，腎小管上皮細(xì)胞以及腎間質(zhì)表達(dá)呈陰性;與WKY組比較，SHR-S組除腎動(dòng)脈血管平滑肌陽(yáng)性表達(dá)外，腎小管上皮細(xì)胞胞漿及腎間質(zhì)中可見α-SMA呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，其半定量積分高于WKY組（p<0.05）;SHR-M組的腎組織中α-SMA表達(dá)明顯減少，半定量積分低于SHR-S組（p<0.05）;SHR-H組的α-SMA表達(dá)量與SHR-S組無(wú)顯著性差異（p>0.05），但高于SHR-M組（p<0.05）。α-SMA蛋白表達(dá)量的變化見圖8。

3? ?討論

本研究旨在探討長(zhǎng)期（18周，相當(dāng)于人類運(yùn)動(dòng)10年）不同強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)高血壓腎病大鼠腎臟纖維化的影響及機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MCE后TGF-β1-Smad2/3信號(hào)通路得到抑制，MMP-9/TIMP-1平衡穩(wěn)態(tài)改善，α-SMA蛋白表達(dá)量減少，腎臟纖維化程度減輕，腎小管間質(zhì)損傷評(píng)分下降，腎功能增強(qiáng)，這說(shuō)明MCE降低膠原合成并促進(jìn)其降解進(jìn)而維持膠原代謝穩(wěn)態(tài)，同時(shí)抑制成纖維細(xì)胞向成肌纖維細(xì)胞分化而減輕SHR腎臟纖維化;然而HIE后，MMP-9/TIMP-1穩(wěn)態(tài)失衡進(jìn)一步破壞，腎臟纖維化程度加劇，腎小管間質(zhì)損傷評(píng)分增加，但TGF-β1-Smad2/3信號(hào)途徑、α-SMA蛋白表達(dá)量以及腎功能并無(wú)改變，這說(shuō)明HIE通過(guò)抑制膠原降解（但對(duì)膠原合成無(wú)影響）加重了SHR腎臟纖維化，但未引起成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化及腎功能繼續(xù)惡化。總之，本研究結(jié)果部分證實(shí)了研究假設(shè)，因此，目前MCE仍然是高血壓腎病患者的最佳運(yùn)動(dòng)康復(fù)方式，長(zhǎng)期HIE的安全性和有效性尚需更多實(shí)證支持。

3.1? 長(zhǎng)期MCE和HIE對(duì)SHR腎臟纖維化的影響

CKD的主要病理學(xué)改變?yōu)槟I炎、腎小球硬化、腎小管間質(zhì)纖維化[1]。本研究成功復(fù)制高血壓腎病模型，組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，SHR-S組大鼠腎內(nèi)小動(dòng)脈透明變性（硬化）、管腔狹窄、腎實(shí)質(zhì)破壞、炎癥浸潤(rùn)、血管周以及間質(zhì)膠原大量沉積，腎小管間質(zhì)損傷評(píng)分增高，這是由于長(zhǎng)期血壓升高，阻力血管病變不斷發(fā)展，造成腎內(nèi)小動(dòng)脈受累使腎臟發(fā)生缺血性損傷并導(dǎo)致腎臟纖維化[1]，同時(shí)24 h尿蛋白、BUN和SCr含量顯著增加，腎功能進(jìn)行性惡化。

規(guī)律運(yùn)動(dòng)尤其是MCE對(duì)多種病因誘發(fā)的組織纖維化（心肌纖維化、血管纖維化、肝纖維化、肺纖維化等）均具有改善效應(yīng)[24]。有動(dòng)物模型證實(shí)，MCE（例如：游泳、跑臺(tái)等方式[25-29]）以及中等強(qiáng)度抗阻訓(xùn)練[30-31]均能夠延緩CKD大鼠腎臟纖維化進(jìn)程，這在本研究中也得到佐證，即SHR-M組的CVF和腎小管間質(zhì)損傷評(píng)分相較SHR-S組下降、腎功能改善，說(shuō)明中等強(qiáng)度多種方式運(yùn)動(dòng)均可對(duì)腎臟起到保護(hù)作用。Choi等[32]的研究還發(fā)現(xiàn)，有氧運(yùn)動(dòng)能夠減少增齡引起的膠原交聯(lián)，因此MCE對(duì)膠原含量和空間結(jié)構(gòu)均具有有益作用。由于血壓升高是高血壓腎病的主要原因，所以血壓下降在MCE組腎臟結(jié)構(gòu)與功能改善中起關(guān)鍵作用。此外，有氧運(yùn)動(dòng)還能通過(guò)神經(jīng)體液途徑以及促進(jìn)肌肉釋放肌肉因子并靶向作用于遠(yuǎn)隔器官等方式對(duì)腎臟起到保護(hù)作用[33]。

HIE是近年來(lái)大眾健身中新興的訓(xùn)練模式，相對(duì)于MCE方式具有明顯的時(shí)效性特征，能夠改善多種慢性病患者器官功能和臨床癥狀，延緩疾病發(fā)展并提高生活質(zhì)量。長(zhǎng)期HIE對(duì)CKD的效果理應(yīng)優(yōu)于MCE，然而本研究卻發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)18周HIE后，SHR-H組的CVF和腎小管間質(zhì)損傷評(píng)分相較SHR-S組進(jìn)一步提高，說(shuō)明HIE加重了SHR腎臟纖維化，推測(cè)與運(yùn)動(dòng)負(fù)荷過(guò)大有關(guān)。有研究證實(shí)[34]，腎臟缺血-再灌注（運(yùn)動(dòng)期缺血、恢復(fù)期再灌注）以及運(yùn)動(dòng)性橫紋肌溶解癥（肌肉損傷時(shí)釋放的肌紅蛋白損傷腎小管）是高強(qiáng)度劇烈運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)腎臟損傷的重要原因[34]。一次急性高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)組織器官發(fā)生一過(guò)性損傷，若及時(shí)調(diào)整訓(xùn)練負(fù)荷并采取恢復(fù)手段（營(yíng)養(yǎng)、休息等）后可逆轉(zhuǎn)，但持續(xù)高負(fù)荷運(yùn)動(dòng)造成機(jī)體無(wú)法完全恢復(fù)，其長(zhǎng)期的積累效應(yīng)則會(huì)導(dǎo)致腎臟結(jié)構(gòu)與功能異常。此外，反復(fù)高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)對(duì)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物而言是一種不良應(yīng)激源[35]，致使SHR長(zhǎng)期處于應(yīng)激狀態(tài)并發(fā)生應(yīng)激性損傷而加重疾病，本研究中SHR-H組出現(xiàn)腎上腺肥大和胸腺萎縮（應(yīng)激標(biāo)志物）也間接證實(shí)了這一推斷。維持ECM穩(wěn)態(tài)是腎臟膠原代謝平衡的關(guān)鍵機(jī)制，高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)通過(guò)誘導(dǎo)ECM穩(wěn)態(tài)失衡最終加重SHR腎臟纖維化（詳見3.2和3.3）。然而值得注意的是，HIE在加重SHR腎臟纖維化的同時(shí)腎功能并未進(jìn)一步惡化，這與Aparicio等[36]對(duì)健康SD大鼠進(jìn)行12周高強(qiáng)度抗阻訓(xùn)練的研究結(jié)果一致，其原因有四。第一，腎臟具有強(qiáng)大的代償能力，在腎臟損傷不超過(guò)75%時(shí)，殘存的腎組織仍可維持正常生理機(jī)能，同時(shí)各模型組動(dòng)物可能并未發(fā)展至腎衰階段;第二，持續(xù)血壓升高是高血壓腎病的根本原因，SHR-H組的血壓未發(fā)生顯著性變化可能是腎功能無(wú)變化的重要機(jī)制之一;第三，高血壓大鼠已出現(xiàn)蛋白尿、BUN和SCr的顯著升高（約3～4倍），進(jìn)行高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)可能并不能進(jìn)一步增加其含量;第四，即使高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)可造成蛋白尿與BUN暫時(shí)性增加，但本研究的取材點(diǎn)在末次訓(xùn)練后48 h，可能錯(cuò)過(guò)了蛋白尿與BUN的升高相。總之，運(yùn)動(dòng)負(fù)荷過(guò)大誘導(dǎo)機(jī)體適應(yīng)不良是HIE加重SHR腎臟損傷的主要原因，同時(shí)也說(shuō)明，MCE仍然是高血壓腎病患者運(yùn)動(dòng)康復(fù)的最佳方式。

3.2? 長(zhǎng)期MCE和HIE對(duì)ECM代謝信號(hào)通路的影響

ECM代謝穩(wěn)態(tài)平衡是膠原含量以及腎臟組織是否發(fā)生纖維化的決定因素[37]。在本研究中，SHR-S組的TGF-β1、p-Smad2/3和CTGF蛋白表達(dá)量相較WKY組明顯增加，說(shuō)明介導(dǎo)膠原合成的TGF-β1-Smad信號(hào)活化。另一方面，MMP-9表達(dá)量減少而TIMP-1增加，即TIMP-1對(duì)MMP-9的抑制增強(qiáng)，膠原分解速度減緩?？傊琒HR腎臟纖維化是膠原合成增加以及降解減少導(dǎo)致的。

經(jīng)過(guò)18周訓(xùn)練后，SHR-M組的TGF-β1、p-Smad2/3和CTGF下降，說(shuō)明膠原合成減少。本研究還發(fā)現(xiàn)，與SHR-S組比較，SHR-M組的MMP-9表達(dá)量增加，而TIMP-1表達(dá)量減少，表明TIMP-1對(duì)MMP-9的抑制作用得到解除，膠原降解增加，這與Kwak等[38]針對(duì)衰老大鼠的研究結(jié)果一致。由于TGF-β1還能夠通過(guò)上調(diào)TIMPs表達(dá)量而抑制MMPs活性[39]，故MCE下調(diào)TGF-β1對(duì)膠原降解起間接促進(jìn)作用。總之，MCE改善SHR腎臟纖維化是膠原降解增加以及合成減少共同作用的結(jié)果，而TGF-β1-p-Smad2/3和MMP-9/TIMP-1則是有氧運(yùn)動(dòng)發(fā)揮腎臟保護(hù)效應(yīng)的關(guān)鍵靶點(diǎn)。然而18周HIE后，TGF-β1、p-Smad2/3和CTGF表達(dá)量與SHR-S組并無(wú)顯著性差異，說(shuō)明長(zhǎng)期HIE對(duì)膠原合成并無(wú)作用。這與Benito等[40]的研究不同，該研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)健康大鼠心肌纖維化，同時(shí)伴TGF-β1表達(dá)量增加，可能與動(dòng)物模型（SHR vs. 健康大鼠）、組織類型（腎臟 vs 心臟）以及運(yùn)動(dòng)方式（HIE vs 持續(xù)高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)）等因素有關(guān)。值得注意的是，本研究還發(fā)現(xiàn)，SHR-HIE組的TIMP-1和MMP-9蛋白表達(dá)量較SHR-S組有所減少，似乎說(shuō)明TIMP-1對(duì)MMP-9的抑制效應(yīng)減弱。然而Yang等[41]的研究進(jìn)一步顯示，MMPs與TIMPs之間的動(dòng)態(tài)平衡（用兩者的比值表示）是膠原分解代謝的決定因素。本研究中SHR-HIE組的MMP-9/TIMP-1比值變小，說(shuō)明TIMP-1對(duì)MMP-9的抑制作用進(jìn)一步增強(qiáng)，膠原降解減少。因此，長(zhǎng)期HIE通過(guò)抑制膠原降解而加重腎臟纖維化，但對(duì)膠原合成并無(wú)顯著影響。

3.3? 長(zhǎng)期MCE和HIE對(duì)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響

成纖維細(xì)胞是腎臟中的主要間質(zhì)細(xì)胞，在病理狀態(tài)下，成纖維細(xì)胞增殖并分化為成肌纖維細(xì)胞，后者合成膠原蛋白的量是前者的5倍。α-SMA蛋白表達(dá)量是成纖維細(xì)胞向成肌纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的特異性標(biāo)志物。組織纖維化根據(jù)有無(wú)細(xì)胞缺失和壞死分為反應(yīng)性纖維化和替代性纖維化兩種類型[42]，前者膠原異常增多并沉積在細(xì)胞間質(zhì)與血管周圍，但無(wú)明顯實(shí)質(zhì)細(xì)胞缺失和壞死，α-SMA蛋白表達(dá)量無(wú)明顯變化，通過(guò)一定的干預(yù)手段可得到改善甚至逆轉(zhuǎn)，而替代性纖維化則存在大量實(shí)質(zhì)細(xì)胞壞死，同時(shí)伴有α-SMA明顯增加，該類型無(wú)法逆轉(zhuǎn)。

在本研究中，MCE能夠部分阻止SHR誘導(dǎo)的α-SMA表達(dá)量增加，表明MCE可抑制成纖維細(xì)胞向成肌纖維細(xì)胞分化，進(jìn)一步改善膠原代謝穩(wěn)態(tài);然而HIE雖然加重腎臟纖維化，但α-SMA表達(dá)量卻并未較SHR-S組進(jìn)一步增加，說(shuō)明高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的腎臟纖維化不存在成纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，故屬于反應(yīng)性纖維化類型。TGF-β1的作用廣泛，除能夠促進(jìn)膠原合成外，還可誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞向成肌纖維細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，因此，HIE未進(jìn)一步激活TGF-β1可能是α-SMA表達(dá)量無(wú)顯著性變化的原因之一。Aschar-Sorbbi等[43]同樣發(fā)現(xiàn)，小鼠6周高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)后成纖維細(xì)胞數(shù)量顯著增加，但成肌纖維細(xì)胞數(shù)量并未增加。Benito等[40]針對(duì)心臟組織的研究證實(shí)，長(zhǎng)期高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)心肌纖維化，后者在停訓(xùn)8周后完全逆轉(zhuǎn)。據(jù)此推斷，本研究SHR-H組大鼠若及時(shí)停訓(xùn)或?qū)⑦\(yùn)動(dòng)強(qiáng)度降低并輔以其他治療手段，其腎臟纖維化嚴(yán)重程度將得以緩解。因此，在高血壓腎病患者運(yùn)動(dòng)康復(fù)期間監(jiān)測(cè)α-SMA的變化有助于評(píng)價(jià)運(yùn)動(dòng)效果并及時(shí)調(diào)整運(yùn)動(dòng)方案，以確保運(yùn)動(dòng)的安全性和有效性。

4? ?結(jié)論與建議

長(zhǎng)期MCE通過(guò)維持膠原代謝穩(wěn)態(tài)（即促進(jìn)降解并降低合成）以及抑制成纖維細(xì)胞向成肌纖維細(xì)胞分化而減輕SHR腎臟纖維化并改善腎功能;長(zhǎng)期HIE則進(jìn)一步破壞膠原穩(wěn)態(tài)平衡（抑制膠原降解，但對(duì)膠原合成無(wú)影響）加重SHR腎臟纖維化，其機(jī)制可能與高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)的應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)，然而由于HIE并未造成成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化以及腎功能繼續(xù)惡化，故屬于反應(yīng)性纖維化且可能具有可逆性。

本研究結(jié)果至少說(shuō)明，HIE并非適用于任何人群，或者針對(duì)不同人群存在最佳的HIE方案，心血管疾病患者尤其是體適能水平較低者采用HIE方案應(yīng)持謹(jǐn)慎態(tài)度，運(yùn)動(dòng)中應(yīng)加強(qiáng)醫(yī)務(wù)監(jiān)督，根據(jù)身體機(jī)能狀態(tài)循序漸進(jìn)地調(diào)整運(yùn)動(dòng)負(fù)荷。今后的研究應(yīng)進(jìn)一步探索不同人群實(shí)施HIE的安全性和有效性，對(duì)其進(jìn)行運(yùn)動(dòng)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估并優(yōu)化運(yùn)動(dòng)方案。因此，目前MCE仍然是高血壓腎病患者運(yùn)動(dòng)康復(fù)的最佳方式，長(zhǎng)期HIE的健康效應(yīng)有待更多實(shí)證支撐。

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