平足蛋白在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中作用的研究進展

宋燕珂，郭迎雪，孫 瑩，李 峣，汪 敏，趙麗艷

(吉林大學(xué)第二醫(yī)院 檢驗科，吉林 長春130041)

平足蛋白(PDPN)是一種Ⅰ型跨膜黏液型糖蛋白，在多種組織中均有表達，并在個體發(fā)育中起著關(guān)鍵作用。近年的研究顯示，PDPN在多種惡性腫瘤中表達上調(diào)，并且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系，可能成為人類腫瘤治療的一個新靶點。本文對PDPN在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中的作用和可能機制進行簡要綜述。

1 概述

PDPN是一種具有大量O-糖苷鍵的Ⅰ型唾黏蛋白樣的跨膜糖蛋白[1-2]。PDPN mRNA首次在小鼠成骨細胞MC3T3-E1中被鑒定，最初被確定為E11抗原，后因其在腎小球臟層上皮細胞(足細胞)中的低水平表達與足細胞足突的變平有關(guān)，而被命名為PDPN[3]。

1.1 PDPN的結(jié)構(gòu)人PDPN由162個氨基酸組成,包括一個高度糖基化的氨基末端胞外結(jié)構(gòu)域、一個高度保守的跨膜結(jié)構(gòu)域和一個短的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域。胞外區(qū)域富含O-糖苷鏈，存在三個串聯(lián)重復(fù)的保守氨基酸序列(EDxxVTPG)，這一序列被命名為血小板聚集結(jié)構(gòu)域(PLAG)，是PDPN介導(dǎo)血小板聚集和激活的關(guān)鍵基序[2,4]。PDPN的PLAG區(qū)域第52位蘇氨酸糖基化位點處連接有一個去唾液酸化corel結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)對PDPN的血小板聚集活性至關(guān)重要，當該處蘇氨酸發(fā)生O-糖基化時，PDPN可與血小板表面的C型凝集素樣受體2(CLEC-2)結(jié)合，從而激活血小板，而該過程不需要血漿的參與[4-5]。PDPN的跨膜結(jié)構(gòu)域含有一個在進化上高度保守的序列(GXXXG)，研究發(fā)現(xiàn)，該結(jié)構(gòu)域可介導(dǎo)PDPN在脂筏中的定位及誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)[2,6]。PDPN的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域僅含有9個氨基酸，其中前兩個近膜氨基酸殘基(RK)是PDPN與ERM[埃茲蛋白(ezrin),radixin和膜突蛋白(moesin)]蛋白家族成員中ezrin和moesin結(jié)合的主要殘基。PDPN與ERM蛋白結(jié)合可促進EMT及細胞的遷移和侵襲[7]。此外，PDPN與ERM蛋白的相互作用還能促進一種與癌細胞侵襲有關(guān)的特殊細胞表面突起(侵襲性偽足)募集PDPN，并促進侵襲性偽足的穩(wěn)定[8]。除了基本氨基酸外，PDPN的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域還含有2個保守的絲氨酸殘基(人類蛋白中的S157和S161)，它們可能是蛋白激酶的磷酸化位點。研究發(fā)現(xiàn)，磷酸化可以改變PDPN胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域氨基酸的構(gòu)象，這兩種絲氨酸同時磷酸化可抑制細胞遷移[9]。

1.2 PDPN的表達

1.2.1PDPN在正常組織的表達 PDPN在個體發(fā)育中起著關(guān)鍵作用，對淋巴系統(tǒng)、肺和心臟等的發(fā)育至關(guān)重要。在生理狀態(tài)下，多種正常組織細胞均表達PDPN，如Ⅰ型肺泡細胞、腎臟足細胞、淋巴管內(nèi)皮細胞、腹膜間皮細胞、骨細胞、成骨細胞和脈絡(luò)膜叢的室管膜細胞等[1,3,10-11]。胚胎發(fā)育期間PDPN激活CLEC-2可促使淋巴管從血液循環(huán)系統(tǒng)中分離出來，PDPN缺失的小鼠淋巴管無法從血液系統(tǒng)正常分離，從而出現(xiàn)異常的淋巴管系統(tǒng)[12]。研究表明，PDPN在發(fā)育中的神經(jīng)管中也有表達，其與CLEC-2相互作用影響神經(jīng)血管的表型，在胚胎發(fā)育過程中，PDPN和CLEC-2缺陷的小鼠均表現(xiàn)出神經(jīng)血管完整性的缺陷[13]。在動物模型中，PDPN表達缺失與足細胞足突的變平、蛋白尿和腎小球選擇性通透性降低有關(guān)[14]。

1.2.2PDPN在腫瘤組織中的表達及其作用 PDPN在多種腫瘤中表達上調(diào)，在不同腫瘤的發(fā)生發(fā)展中可能起不同的作用。研究表明，PDPN在鱗狀細胞癌[10]、膠質(zhì)母細胞瘤[15]、骨肉瘤[16]、膀胱癌[17]、間皮瘤[18]、精原細胞瘤[19]等腫瘤細胞或(和)癌相關(guān)成纖維細胞(CAFs)的表面呈不同程度上調(diào)。過表達PDPN與腫瘤進展及侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)，尤其是在乳腺癌[20]、口腔鱗狀細胞癌[21]和膠質(zhì)母細胞瘤[15]等。然而有研究表明，在宮頸鱗狀細胞癌[22]、結(jié)直腸癌[23]和肺鱗狀細胞癌[24]等腫瘤中PDPN的表達可能為良好的預(yù)后因素，此外，最近的一項研究表明，細胞膜或細胞質(zhì)高表達PDPN可能對唇鱗狀細胞癌患者的預(yù)后有利[25]。MISHIMA等[15]通過組織微陣列(TMA)技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，PDPN在高級別星形細胞瘤中的表達水平較高，而在低級別星形細胞瘤中的表達水平較低，認為PDPN可能是高級別星型細胞瘤預(yù)后的標志物。有研究表明，在高級別膠質(zhì)瘤中，PDPN在膠質(zhì)瘤內(nèi)和膠質(zhì)纖維酸性蛋白陽性星形膠質(zhì)細胞中呈高表達，Western blot結(jié)果顯示PDPN高表達于腫瘤邊緣，而非腫瘤核心[26]。在膠質(zhì)瘤患者中，PDPN的高表達與預(yù)后較差有關(guān)，并且與瘤內(nèi)血小板聚集和靜脈血栓栓塞(VTE)風(fēng)險增加有關(guān)。在小鼠膠質(zhì)瘤模型中，使用抗PDPN抗體治療可抑制腫瘤的生長，提高生存率[27]。

2 PDPN促進腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移及可能的機制

2.1 PDPN與CLEC-2相互作用激活血小板VTE是癌癥患者常見的危及生命的并發(fā)癥，膠質(zhì)瘤患者在整個疾病過程中發(fā)生VTE的風(fēng)險特別高[28]。一項研究發(fā)現(xiàn)，在原發(fā)性腦瘤患者(主要是高級別膠質(zhì)瘤)中，PDPN高表達的腫瘤患者發(fā)生VTE的風(fēng)險約為PDPN陰性腫瘤患者的6倍，說明PDPN與腦腫瘤患者發(fā)生VTE密切相關(guān)。該研究用Gli16(一種表達PDPN的細胞系)和AMCH(一種不表達PDPN的細胞系)兩種不同的膠質(zhì)母細胞瘤細胞系對人血小板進行體外共培養(yǎng)實驗，發(fā)現(xiàn)與PDPN陰性的AMCH細胞相比，PDPN陽性的Gli16細胞誘導(dǎo)的血小板聚集明顯更高，抗PDPN抗體NZ-1幾乎完全降低了Gli16細胞誘導(dǎo)的血小板聚集，而在對照組未觀察到這種現(xiàn)象。此外，在與人血小板共培養(yǎng)實驗中，PDPN陽性的Gli16細胞誘導(dǎo)血小板釋放高水平的血小板因子4(PF4)，該過程可被PDPN抗體NZ-1抑制，而PDPN陰性的AMCH細胞僅輕度釋放PF4。這些結(jié)果表明，表達PDPN的膠質(zhì)母細胞瘤細胞系Gli16誘導(dǎo)的血小板聚集是通過PDPN介導(dǎo)的[29]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，血小板聚集需要膠質(zhì)瘤細胞中的PDPN，而不是星形膠質(zhì)細胞中的PDPN，該研究還發(fā)現(xiàn)腫瘤內(nèi)聚集的血小板位于血管內(nèi)和腫瘤微環(huán)境內(nèi)，提示血小板可以離開血液循環(huán)直接接觸腫瘤細胞[30]。

CLEC-2被認為是PDPN的內(nèi)源性受體，腫瘤細胞表達的PDPN通過與血小板表面的CLEC-2結(jié)合，誘導(dǎo)血小板聚集，促進腫瘤的轉(zhuǎn)移[31]。CLEC-2胞內(nèi)域包含一個YXXL序列，在未受刺激的血小板中，有很大比例的CLEC-2以二聚體的形式存在，并在受到刺激后轉(zhuǎn)化為更高級的結(jié)構(gòu)[32]。當PDPN胞外區(qū)域的PLAG結(jié)構(gòu)域第52位蘇氨酸被O-糖基化時，PDPN可與血小板表面的CLEC-2結(jié)合，結(jié)合后的CLEC-2發(fā)生二聚化，以酪氨酸激酶(Src)依賴的方式促進YXXL基序中單個保守酪氨酸殘基的磷酸化，該酪氨酸的磷酸化啟動了與脾酪氨酸激酶(Syk)結(jié)合，從而啟動信號級聯(lián)，導(dǎo)致PLCγ和SLP-76的激活,從而誘導(dǎo)血小板聚集，該過程需要鈣離子的參與[5,33]。

在腫瘤細胞血行轉(zhuǎn)移中，血管內(nèi)絕大多數(shù)腫瘤細胞會在循環(huán)中死亡，它們在到達遠處組織的實質(zhì)之前，就暴露在剪切應(yīng)力下，并被自然殺傷細胞(NK細胞)清除。目前認為，血小板聚集引起腫瘤細胞的擴散轉(zhuǎn)移可能是通過以下方式：①聚集的血小板可將腫瘤細胞包裹，使腫瘤細胞免受血流剪切力的破壞及免疫細胞的殺傷作用，從而有利于腫瘤的轉(zhuǎn)移；②腫瘤細胞誘導(dǎo)的血小板聚集可能通過促進癌細胞與血管內(nèi)皮的黏附而促進腫瘤細胞外滲，在機體的第二部位形成轉(zhuǎn)移灶；③激活的血小板可釋放許多生長因子，可能促進腫瘤的生長。此外，血小板顆粒的釋放也可能影響腫瘤微環(huán)境，有助于轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的形成；④分泌的血管生成因子[如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)]能夠刺激腫瘤血管生成[31,34]。

2.2 PDPN與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移

2.2.1PDPN與腫瘤細胞EMT的關(guān)系 轉(zhuǎn)移是癌癥相關(guān)死亡的主要原因，腫瘤細胞EMT是惡性腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的重要分子機制。EMT使上皮細胞極性和黏附功能喪失，使靜止的上皮細胞能夠以單細胞獲得遷移特性，伴隨特征性的分子標志物的改變?nèi)鏓-鈣黏蛋白下調(diào)，N-鈣黏蛋白和波形蛋白上調(diào)[35]。研究發(fā)現(xiàn)在MDCK細胞中插入PDPN基因可誘導(dǎo)EMT過程，其可能機制為，PDPN胞內(nèi)區(qū)域中的近膜氨基酸簇可與ERM蛋白結(jié)合，兩者的結(jié)合不僅能夠介導(dǎo)PDPN錨定于肌動蛋白細胞骨架，也可激活RhoA，RhoA活性的上調(diào)可導(dǎo)致Rock介導(dǎo)的ERM磷酸化，進一步穩(wěn)定ERM蛋白的活性構(gòu)象，從而進一步加強PDPN對細胞骨架的錨定，促進EMT及細胞的遷移和侵襲[7,36]。ERM蛋白作為整合膜蛋白和肌動蛋白骨架之間的連接物，磷酸化導(dǎo)致其構(gòu)象改變，暴露了肌動蛋白和其他蛋白的結(jié)合位點[11]。PDPN促進EMT和細胞遷移的另一個必要條件是其與脂筏的聯(lián)系。PDPN在脂筏中的定位是由跨膜區(qū)域的GXXXG基序介導(dǎo)的，該跨膜區(qū)域的突變或替換均可導(dǎo)致PDPN無法定位于脂筏，從而阻斷PDPN誘導(dǎo)的EMT[2]。此外，有研究表明，PDPN與CD44在侵襲性癌細胞系的細胞突起處協(xié)同上調(diào)并且相互作用，當PDPN胞外區(qū)域發(fā)生正確糖基化時，CD44可與PDPN結(jié)合，從而促進PDPN誘導(dǎo)的細胞遷移[37]。

2.2.2PDPN可以在不發(fā)生EMT的情況下促進腫瘤侵襲 在癌癥進展過程中，EMT對于單細胞的侵襲和早期癌細胞的擴散起著至關(guān)重要的作用[35]，然而在對Rip1Tag2小鼠β細胞腫瘤的研究發(fā)現(xiàn)，PDPN在沒有發(fā)生EMT的情況下可以促進癌細胞的遷移。在該模型中，PDPN將侵襲模式從單細胞侵襲EMT轉(zhuǎn)變?yōu)闊oEMT的集體侵襲，這些腫瘤細胞表面仍表達E-鈣黏蛋白。在分析的臨床樣本中觀察到盡管維持上皮特異性黏附分子，癌細胞仍會侵襲周圍組織，因此盡管這些癌細胞有遷移和浸潤周圍組織的能力，但它們并未受到EMT的影響[38]。

2.2.3PDPN促進細胞外基質(zhì)(ECM)重構(gòu)和癌細胞侵襲 為了侵襲和轉(zhuǎn)移，癌細胞必須降解和重塑細胞外基質(zhì)，包括基底膜和間質(zhì)基質(zhì)?；啄な俏挥谏掀ず蛢?nèi)皮細胞下的一種致密的、片狀的特化類型的ECM，是防止惡性細胞傳播的屏障，基底膜斷裂和失調(diào)是許多惡性腫瘤的特征[39]。

研究表明，PDPN存在于癌細胞表面形成的富含肌動蛋白且具有針對性蛋白水解活性的侵襲性偽足的黏附環(huán)中，并促進侵襲性偽足對基質(zhì)的降解。PDPN募集到侵襲性偽足的黏附環(huán)需要與脂筏結(jié)合，ERM蛋白在PDPN和肌動蛋白核心周圍的肌動蛋白細胞骨架之間起連接作用，介導(dǎo)PDPN定位于侵襲性偽足，而PDPN又可增強侵襲性偽足募集ERM蛋白的能力。功能性研究表明，PDPN通過RhoC-ROCK-LIMK途徑調(diào)節(jié)絲切蛋白(cofilin)的活性促進侵襲性偽足的成熟和穩(wěn)定，從而促進ECM的有效降解[8]。

在ECM降解過程中基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)起著重要作用。在侵襲性腫瘤中，PDPN表達與MMPs相關(guān)，甚至在腫瘤細胞突起處共定位。已有研究表明，PDPN表達可增強MMP2、MMP14(也稱為MT1-MMP)等的表達，從而刺激口腔SCC細胞的侵襲[21]。此外有研究表明基質(zhì)細胞(尤其是CAFs)也通過MMPs參與癌細胞的轉(zhuǎn)移。PDPN可能激發(fā)CAFs破壞和重構(gòu)腫瘤微環(huán)境，使腫瘤細胞沿著CAFs形成的路徑遷徙到新的區(qū)域[40]。

2.2.4其他 研究表明，PDPN可能促進腫瘤淋巴管的生成，但其具體機制尚未闡明，可能涉及PDPN介導(dǎo)的促淋巴管生成生長因子或細胞因子的分泌如內(nèi)皮生長因子C(VEGF-C)、內(nèi)皮生長因子D(VEGF-D)和CCL21等[11]。但SUZUKI等[41]發(fā)現(xiàn)肺鱗癌細胞系中PDPN的表達可能通過下調(diào)VEGF-C抑制腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤相關(guān)淋巴管生成。此外，研究表明，PDPN是外泌體和微囊泡的組成部分，腫瘤細胞和CAFs可將含有蛋白質(zhì)和mRNA的胞外囊泡分泌到腫瘤微環(huán)境中，含有PDPN的外泌體在體外可以刺激淋巴管生成[42]。最近一項研究表明，PDPN可能限制CD8+腫瘤浸潤淋巴細胞(TILs)在腫瘤微環(huán)境中的生存，從而有利于腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移[43]。

3 PDPN在腫瘤治療中可能的意義

PDPN與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系，可能成為人類腫瘤治療的一個新靶點。近年研究者正探討抑制PDPN活性對腫瘤的防治作用。

3.1 以胞外結(jié)構(gòu)域為治療靶點

3.1.1抑制腫瘤相關(guān)血栓形成 抑制血小板活化的藥物可以抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移，然而針對激活血小板的腫瘤特異性途徑即PDPN-CLEC-2軸治療，可抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的同時避免患者術(shù)前和術(shù)后出血的風(fēng)險。

相關(guān)抗體可被用來破壞PDPN-CLEC-2的相互作用。例如，NZ-1抗體及其衍生物如NZ-8抗體、NZ-12抗體以及其他與PDPN胞外PLAG結(jié)構(gòu)域結(jié)合的抗體(如MS-1)[34,44]。研究表明NZ-1抗體能以劑量依賴性的方式抑制膠質(zhì)瘤細胞相關(guān)PDPN引起的血小板聚集[27]。

此外，合成的化合物也被用來阻止PDPN-CLEC-2的相互作用。一種新型的無細胞毒性的5-硝基苯甲酸化合物“2CP”被證明能有效抑制PDPN介導(dǎo)的血小板聚集和腫瘤細胞誘導(dǎo)的血小板活化，并且能在擴大順鉑治療效果的同時降低出血的風(fēng)險[45]。

3.1.2靶向治療 研究表明，當癌細胞表達PDPN時，其糖基化模式似乎發(fā)生了改變，這促使了一種抗人PDPN的腫瘤特異性單克隆抗體(CasMab)的產(chǎn)生，LpMab-2與PDPN表達的癌細胞發(fā)生反應(yīng)，但與正常細胞沒有反應(yīng)，因此這種高度特異性的試劑為靶向癌細胞上的PDPN提供了可能[46]。最近有研究表明，chLpMab-2和chLpMab-23均具有抗腫瘤活性[47]。最近一項研究開發(fā)了一種新的靶向PDPN的光療法，該研究將抗PDPN抗體NZ-1與酞菁染料結(jié)合，形成一種抗體-光敏劑結(jié)合物，利用近紅外光免疫療法(NIR-PIT)，靶向治療表達PDPN的惡性間皮瘤[48]。

此外，凝集素也可用于靶向轉(zhuǎn)化細胞上的PDPN，如懷槐種子凝集素(MASL)，研究表明MASL可以與PDPN表達相關(guān)的方式抑制細胞遷移，可用于對抗口腔鱗狀細胞癌和其他表達PDPN的癌癥[49]。

3.2 以胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域為治療靶點如上所述，胞質(zhì)域的兩個絲氨酸同時磷酸化可抑制細胞的遷移，因此可以針對這一點來減少癌細胞的轉(zhuǎn)移。研究表明，蛋白激酶A (PKA)和細胞周期蛋白依賴性激酶5 (CDK5)可協(xié)同磷酸化PDPN的胞內(nèi)絲氨酸以抑制細胞運動。雙硫侖(disulfifiram)和CARP-1功能模擬物等可誘導(dǎo)PDPN磷酸化并抑制PDPN介導(dǎo)的細胞遷移[9]。

3.3 PDPN CAR-T細胞針對PDPN的嵌合抗原受體-T(CAR-T)細胞正被開發(fā)用于治療癌癥。最近一項關(guān)于膠質(zhì)母細胞瘤的研究表明，靶向PDPN的CAR-T細胞可減少小鼠腦內(nèi)原位膠質(zhì)母細胞瘤[50]。

4 總結(jié)

PDPN不僅在個體發(fā)育中起著重要作用，還在多種腫瘤中表達上調(diào)，并參與多種腫瘤的發(fā)展及侵襲、轉(zhuǎn)移，但其在不同腫瘤中發(fā)揮不同的作用。PDPN在腦膠質(zhì)瘤中表達上調(diào)，并參與腦膠質(zhì)瘤患者VTE的形成等過程，與膠質(zhì)瘤患者的不良預(yù)后有關(guān)，但其在膠質(zhì)瘤中的具體作用仍待進一步研究。由于PDPN在惡性腫瘤進展中發(fā)揮重要作用，越來越多的研究嘗試將其作為治療靶點，從而開發(fā)出新的靶向藥物，為腫瘤的臨床治療提供新的思路。