梅毒非特異性抗體再認識

夏德菊，許四宏，尹躍平

作者單位：210042 南京，中國醫(yī)學科學院皮膚病醫(yī)院/中國疾病預防控制中心性病控制中心（夏德菊、尹躍平）；100050 北京，中國食品藥品檢定研究院體外診斷試劑研究所（夏德菊、許四宏）

梅毒是由梅毒螺旋體（treponema pallidum，TP）感染引起的慢性、系統(tǒng)性性傳播疾病[1]。中國是梅毒高流行地區(qū)，據估計，全國有近三百萬梅毒患者，占全球梅毒感染者的15% 以上[2]。因為 TP 不能體外培養(yǎng)，其病原學檢測僅適合于一期、二期等有皮損癥狀的梅毒、且敏感性較低，所以梅毒診斷主要依靠血清學試驗，包括梅毒螺旋體特異性抗體檢測（梅毒螺旋體血清學試驗）和梅毒螺旋體非特異性抗體檢測（非梅毒螺旋體血清學試驗）[3-4]。前者主要針對梅毒螺旋體多肽抗原產生特異性的抗體，此類抗體產生較早，抗TP IgM 和 IgG 抗體可在梅毒感染 2 周和 4 周后產生，特異性抗體一經產生一般可終身維持陽性，不受梅毒病程和治療情況的影響[5]；梅毒螺旋體非特異性抗體一般在梅毒感染 6 周左右出現，傳統(tǒng)上結合梅毒螺旋體特異性抗體檢測用于梅毒的診斷以及用于隨訪治療效果[6]。隨著近些年臨床使用大數據信息分析以及一些學者的深入研究，發(fā)現梅毒非特異性抗體檢測意義較傳統(tǒng)認識上有新的發(fā)現，現綜述如下。

1 梅毒非特異性抗體的來源

梅毒非特異性抗體是于 1901年由 Wassermann 發(fā)現，因此早期也叫 Wassermann 抗體，亦稱之為反應素[7]。該抗體識別的是脂質抗原，主要是通過卵磷脂、心磷脂和膽固醇混合物來檢測，其中心磷脂是主要抗原組分[8-10]。此類抗體的來源一直存在很大爭議，主要分為兩派，Eagle 等學者認為反應素是針對梅毒螺旋體的磷脂組分而產生，證據為大量的臨床特異性數據[11-13]，且 TP 所含的脂類是蛋白的 1.3 倍，67.8% 為磷脂[14]。但反對意見認為任何動物或者人的組織都可以作為此類抗體的抗原，而且確實有一些未感染梅毒的人血清中也會檢測到反應素，因此以 Sachs 為代表的一些學者認為 TP 感染后引起宿主細胞破損，釋放組織半抗原，然后經 TP 蛋白活化成為全抗原，刺激機體產生自身免疫反應[15-17]。然而最近由廈門大學楊天賜教授團隊利用兔子感染模型證實，非特異性抗體的產生可能是由 TP 和宿主細胞的磷脂抗原共同參與誘導出的，研究表明 TP 自身磷脂抗原免疫原性很弱，只能刺激機體產生低滴度的梅毒非特異性抗體，而受損的宿主細胞磷脂抗原在刺激機體產生高滴度的反應素方面發(fā)揮重要作用[18]。該團隊分別利用滅活的TP、心磷脂和心磷脂-BSA 混合物、有活性的 TP 分別免疫兔子，結果發(fā)現滅活 TP 免疫組能產生非特異性抗體但滴度很弱（大多為 1:1 或者弱反應性），考慮到心磷脂具有抗原性，可能的原因是 TP 自身磷脂抗原免疫原性很弱。因為單獨心磷脂免疫組不能產生抗磷脂抗體，而心磷脂-BSA混合物免疫組能夠產生抗磷脂抗體，因此 TP 自身磷脂抗原免疫原性弱可能是因為未結合蛋白成分；加之之前研究發(fā)現 TP 外膜蛋白破損后也可以標記上 Wassermann 抗體，提示心磷脂抗原可能存在于 TP 的內膜[8]，這也可能是 TP自身磷脂抗原免疫原性弱的一個原因。該研究還發(fā)現滅活的梅毒螺旋體免疫組的抗體反應模式顯著不同于活性的梅毒螺旋體免疫組，后者可以更快誘導出更高滴度的梅毒非特異性抗體，且抗體是持續(xù)增長的，原因可能是活性 TP 可以持續(xù)增殖并破壞宿主細胞。且有研究發(fā)現，TP 的脂肪酸成分和感染組織相似，提示宿主來源的磷脂和其他脂類可能組合到梅毒螺旋體中，形成一個獨特的表位進而刺激產生梅毒非特異性抗體[16]。但究竟 TP 蛋白是否參與并增強了心磷脂的抗原性并未得到證實。

2 梅毒非特異性抗體的經典生物學假陽性

目前梅毒非特異性抗體的檢測方法主要有快速血漿反應素試驗（RPR）、梅毒甲苯胺紅不加熱血清反應素試驗（TRUST）以及性病研究實驗室試驗（VDRL），其原理基本相同，均采用牛的心磷脂為抗原，與卵磷脂和膽固醇按照一定的比例進行混合，組成 VDRL 抗原顆粒，當抗原與反應素相互作用時，出現凝集反應[9]，但這些方法在非梅毒患者也能檢測出梅毒非特異性抗體，傳統(tǒng)上將此現象稱為梅毒非特異性抗體的經典生物學假陽性（classical biological false-positive，CBFP）。有大量研究表明，梅毒特異性抗體檢測方法和非特異性抗體檢測方法都存在偶發(fā)性生物學假陽性，但前者發(fā)生 CBFP 的概率要顯著低于后者[9,19-20]。通過大量臨床樣本的回顧性分析發(fā)現梅毒非特異性抗體檢測方法在自然人群中發(fā)生 CBFP 的概率為 1%～2%[21-23]，其中主要和自身免疫疾病患者、HIV 感染者、孕婦以及靜脈注射毒品者關聯(lián)顯著[4]，而且女性 CBFP 發(fā)生率要高于男性，可能原因一方面是因為女性妊娠，其次是某些自身免疫疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)病率女性要顯著高于男性[21,23]；再者 60 歲以上人群的 CBFP 發(fā)生率要高于其他年齡組，可能是和這個年齡組人群的血清異常成分如抗核抗體、類風濕因子以及高丙種球蛋白等因素的增加有關[24-25]。一般認為低滴度的非特異性抗體人群易發(fā)生 CBFP，但高滴度的非特異抗體也有發(fā)生[25]。楊天賜團隊[26]發(fā)現，CBFP 的發(fā)生還和假孕、巨幼細胞性貧血、再生障礙性貧血、先天性心臟畸形、輸卵管炎和包皮過長的發(fā)生有關，其研究結果提示：假孕和再生障礙性貧血導致免疫球蛋白的升高，和抗磷脂抗體產生交叉反應；巨幼細胞性貧血和先天性心臟畸形可能導致宿主細胞受損，釋放磷脂抗原，進而產生假陽性反應[27]；輸卵管炎和包皮過長可能和細菌感染有關，因為細菌感染可能導致心磷脂三種抗體亞型血清水平的升高[28]。傳統(tǒng)上，根據 CBFP 的持續(xù)時間，分為急性 CBFP（小于 6 個月）和慢性 CBFP（大于 6 個月）[28]，楊天賜團隊發(fā)現，急性CBFP 主要和巨幼細胞性貧血有關，而慢性 CBFP 主要和再生障礙性貧血、先天性心臟畸形有關，但是在健康人群中，兩者都有發(fā)生，尤其是老年人和孕婦[26]。

3 梅毒非特異性抗體的異質性

梅毒非特異性抗體主要是識別心磷脂抗原產生抗心磷脂抗體（anticardiolipin antibody，ACA），如上述 CBFP 的發(fā)生主要和抗磷脂抗體綜合征（antiphospholipid syndrome，APS）和自身免疫疾病相關[4]。已知 APS 和自身免疫疾病檢測的 ACA 主要是 β2-GPI 依賴型，即抗原抗體的結合反應需要 β2 糖蛋白；而感染性疾病血清中檢測到的 ACA 主要是 β2-GPI 非依賴型[29-31]，因此探究梅毒患者和發(fā)生CBFP 的患者血清中的 ACA 是否一致對解釋 CBFP 的發(fā)生起著關鍵作用。楊天賜團隊[32]選取了 146 例 CBFP 患者（排除和APS 相關的患者），465 例梅毒患者（排除其他感染性疾病和自身免疫病）和 64 例 APS 患者（排除梅毒感染和自身免疫?。?，對血清中的 β2-GPI 依賴型 ACA 進行檢測，研究發(fā)現在 CBFP 患者組 β2-GPI 依賴型 ACA 的陽性率為 22.6%，和 APS 患者組無明顯差異，但梅毒患者組的 β2-GPI 依賴型 ACA 的陽性率僅有 3.87%，此水平在健康人群中的陽性率范圍內（1%～5%）。且非特異性抗體滴度水平和 β2-GPI 依賴型 ACA 的陽性率水平并無相關性，提示梅毒患者主要產生的是 β2-GPI 非依賴型 ACA，β2-GPI 依賴型 ACA 在 CBFP 患者中占據很大比例，所以梅毒患者和 CBFP 患者中的 ACA 具有異質性。

4 梅毒非特異性抗體的前帶現象

前帶現象主要指高滴度的梅毒非特異性抗體干擾了抗原-抗體形成晶狀網格體進而形成肉眼可見的凝集反應，導致假陰性反應，有研究者稱之為“hook 效應”。前帶現象一般是因為血清未經稀釋引起，并且可以發(fā)生于梅毒感染的各個階段[4]，有研究表明，此現象在梅毒人群的發(fā)生率為0.2%～2%[33-34]。一般認為，前帶現象主要由高滴度的梅毒非特異性抗體引起，但是有最新研究發(fā)現中等滴度以及弱滴度的非特異性抗體也能產生前帶現象[9]。楊天賜團隊[35]通過對 46856 例梅毒患者樣本的回顧性分析也證實前帶現象發(fā)生率為 0.83%，且大約 31% 的前帶現象樣本的 RPR 滴度小于 1:16。而且大量研究發(fā)現前帶現象還和二期梅毒、早期潛伏梅毒、神經梅毒[4]、HIV 感染[35-36]以及妊娠有關[37-38]，其中 HIV 感染可能和 B 細胞異常活化導致高濃度抗體產生有關，而二期梅毒和早期潛伏梅毒可能和高滴度的梅毒非特異性抗體產生有關，但神經梅毒和妊娠人群中前帶現象升高的原因還有待進一步探究。為了消除前帶現象，需要對樣本進行稀釋后檢測，但部分實驗室為了節(jié)約人力和成本，并未嚴格用稀釋樣本來檢測，因此指導臨床醫(yī)生對梅毒疑似患者要結合梅毒非特異性抗體滴度檢測結果進行綜合判斷。

5 梅毒非特異性抗體的血清固定現象

青霉素用于梅毒治療已有 50年的歷史，其治療效果的評價一直以來都是通過梅毒非特異性抗體滴度的變化進行監(jiān)測[39]，因為有大量研究表明梅毒患者經過足夠正規(guī)程序治療后，其非特異性抗體會下降，傳統(tǒng)上認為抗體滴度有4 倍增長或下降代表著感染或治療有效，但是部分梅毒患者經驅梅治療 1年后，其非特異性抗體在很長的時間內一直持續(xù)于低滴度的狀態(tài)而不轉陰（或未出現 4 倍增長或下降），此現象稱為血清固定或血清抵抗[40-42]。該現象的發(fā)生機制以及影響因素一直以來都很困擾臨床醫(yī)生，早期研究主要集中于 HIV 感染梅毒患者的治療效果評價，發(fā)現 HIV感染者梅毒治療依從性不好，非特異性抗體下降緩慢[43-44]。近些年有研究者分別進行了非 HIV 共感染的不同臨床階段的梅毒患者治療效果的評價，發(fā)現病程、性別、年齡和起始非特異性抗體滴度和血清治療效果相關[3,44]。對于許多梅毒患者，血清應答狀態(tài)隨著治療過程的變化而變化，所以時間點的選取對于評價治療效果很關鍵[45]，一般對于早期梅毒患者，治療后 6 個月內梅毒非特異性抗體滴度至少有4 倍下降或轉陰，對于潛伏或晚期梅毒患者，治療 12 個月內梅毒非特異性抗體滴度至少有 4 倍下降或轉陰，這些稱為血清治愈[46]。有研究稱 15%～20% 的早期梅毒患者在治療后 6 個月會出現血清固定[44-45]，楊天賜教授認為血清固定發(fā)生率在一期梅毒、二期梅毒、隱性梅毒、三期梅毒中逐漸遞增，且其發(fā)現在治療的前 6 個月血清治愈率隨著時間上升而上升，但 6～12 個月，血清治愈率變化不大，提示血清固定現象不會隨著時間延長而下降，所以梅毒治療的評估建議隨訪至 12 個月[3]。老年人的血清固定現象明顯升高，可能和老年人免疫系統(tǒng)削弱和免疫抑制的增強，進而影響了梅毒治療過程中抗體的應答反應有關[47]。許多研究表明有較高基礎滴度（>1:8）的梅毒非特異性抗體患者發(fā)生血清固定幾率會降低，可能高滴度的起始抗體預示著宿主對TP 的免疫應答更強烈，更有助于清除 TP，楊天賜教授也證實了這一點，但 Se?a 則發(fā)現較低滴度（≤ 1:32）的非特異性抗體更容易出現血清治愈甚至轉陰，因此一些專家認為治療后血清固定的發(fā)生可能因為機體持續(xù)的免疫應答反應而不是因為宿主細胞里殘余的 TP[47]，因此對非特異性抗體滴度與病原體感染壓力和機體免疫應答的關系的探究有助于理解梅毒治療后抗體變化規(guī)律。上海皮膚病醫(yī)院的周平玉教授認為判斷梅毒血清固定應先排除治療不規(guī)范和再感染，梅毒血清固定是一種梅毒螺旋體感染過程中的特有免疫狀態(tài)，增加治療劑量和次數并不能改變其血清固定的事實，因此無需過度治療[48]。也有學者認為血清固定和用藥類型、劑量和注射方式有關，與機體的免疫功能有關[49]。王千秋團隊發(fā)現血清固定還和細胞因子以及 TP 亞型有關，對早期梅毒患者治療后的 12 個月隨訪發(fā)現，血清固定組的驅化因子和 14i/a 基因型占比較高[50]。近年來發(fā)現神經梅毒與血清固定現象關聯(lián)顯著，一項 205 例的血清固定人群的調查發(fā)現有 56.1% 的患者為神經梅毒，提示在經過 6～12 個月的治療后出現血清固定的人群要考慮神經梅毒的可能性[51-52]。

6 梅毒非特異性抗體的篩查診斷價值

由于梅毒非特異性抗體是梅毒感染后最初發(fā)現的一種抗體，早期認為其來源為針對梅毒螺旋體的磷脂組分而產生，具有較高的特異性[9]，加之檢測此抗體的方法簡單、成本低廉，所以梅毒非特異性抗體實驗最早用于梅毒的初篩。但隨著對非特異性抗體的認識提高以及梅毒特異性抗體檢測方法的實現，為了提高診斷特異性，梅毒診斷采取了串聯(lián)試驗策略，即用非特異性抗體試驗進行初篩，出現陽性再用特異性抗體檢測進行確認，該程序也稱為梅毒傳統(tǒng)診斷程序[6,53]，該診斷程序被美國 CDC 和我國《性傳播性疾病臨床診療指南》（2007年）推薦使用。但如前所述，非特異性抗體檢測方法面臨較高的經典生物學假陽性現象和前帶現象，且有文獻報道，一期梅毒以及晚期隱性梅毒中非特異性抗體方法檢測敏感性較低，導致了梅毒篩查的假陽性和假陰性問題。González 等[54]曾采用傳統(tǒng)的診斷程序對 792 例梅毒篩查血清進行檢測，發(fā)現有 22 例梅毒患者造成漏診。楊天賜教授團隊在 24 124 例梅毒檢查中，臨床確診了 2749 例梅毒患者，其中 665 例患者非特異性抗體陰性而特異性抗體陽性。如果采用傳統(tǒng)診斷程序，這 665 例梅毒患者將被漏診，漏診率高達 24.2%[55]。因此，美國公共衛(wèi)生實驗室協(xié)會、英國健康保護局、國際性傳播感染聯(lián)合會以及歐洲大多數國家目前推薦梅毒逆序診斷程序[56-58]，即以一種梅毒特異性抗體試驗進行初篩，陽性再用非特異性抗體方法確認，如果結果不一致再用另一種特異性抗體試驗復核，該程序顯著提高了梅毒診斷的特異性和靈敏度，而且現在很多特異性抗體檢測方法均實現了自動化和高通量檢測，大大降低了人工勞動成本。梅毒逆序診斷程序目前在國內也得到了很多專家認可，新版《性傳播疾病實驗室檢測指南》也推薦使用。但是楊天賜教授團隊通過一個大數據量的橫斷面調查研究（總共對 24 124 例進行檢測，梅毒患病率為 11.4%）發(fā)現，如果將逆序診斷程序中的梅毒非特異性抗體試驗去除，該程序和逆序診斷程序均有較高的準確度，可達 99.93%，兩者一致性（Κappa 值）為 0.996[55]。該團隊認為，在排除了傳統(tǒng)生物學假陽性后，非特異性抗體陽性的患者，其特異性抗體一定陽性；而特異性抗體陽性的患者，其非特異性抗體不一定陽性，因此，逆序診斷程序中特異性抗體初篩后，再用非特異性抗體做確認，可能是多余的試驗，非特異性抗體實驗更適用于臨床梅毒治療效果的監(jiān)測，該程序已被 2014年的歐洲指南以及 2015年的加拿大公共衛(wèi)生實驗室指南所推薦，所以其稱為 ECDC 診斷程序[4,59]。但該診斷程序只在梅毒高發(fā)病人群進行了驗證，在低流行地區(qū)該診斷程序是否依舊有較高的準確性還有待考量。在我國，梅毒屬于乙類傳染病，是我國血源篩查的必檢項目，所以梅毒血源篩查試劑不同于臨床診斷試劑（按照醫(yī)療器械實行注冊檢驗）是按照藥品進行嚴格管理，實行批簽發(fā)，梅毒非特異性抗體檢測試劑由于歷史原因最早用于血源篩查，至今一直實行批簽發(fā)，每年耗費大量人力和物力成本，但考慮到該試劑的敏感性以及特異性可能對我國血液的安全性和利用率的影響，加之逆序診斷程序在國內的認可，目前梅毒非特異性抗體檢測試劑已極少用于血源篩查，所以該試劑批簽發(fā)模式有待考量。

7 梅毒非特異性抗體的治療監(jiān)測價值

由于 TP 不能體外培養(yǎng)，因此梅毒治療效果的評價一直以來沒有金標準，但有很多文獻證實梅毒非特異性抗體滴度變化和梅毒治療過程相關性很高[4,9,44,60]，所以各個國家的梅毒診療指南中，都將梅毒非特異性抗體滴度的下降作為治療有效性的一個指標，但如前述，血清固定人群的處理一直都困擾著臨床醫(yī)師。近些年陸續(xù)有學者發(fā)現和傳統(tǒng)認識有沖突的地方：周平玉教授發(fā)現未經治療的梅毒患者也會出現非特異性抗體滴度 4 倍下降；17 例二期梅毒患者即使經過了足量的驅梅治療且非特異性抗體滴度有 4 倍下降，但仍然發(fā)展為神經梅毒[61]；Holman 等[62]發(fā)現大約 20% 的梅毒患者在經過 14 天的正規(guī)治療后非特異性抗體不僅沒有降低反而升高，這些發(fā)現越來越沖擊非特異性抗體的治療監(jiān)測作用。因此楊天賜教授團隊第一次利用兔子模型評價 TP自然感染過程和青霉素治療后的非特異性抗體的滴度變化，研究發(fā)現無論是否經過青霉素治療，感染兔子的非特異性抗體都是先升高然后降低，有的甚至會轉陰，非特異性抗體滴度的這種變化更像是在梅毒感染過程中一個自然免疫過程[63]。該團隊利用兔子感染試驗（RIT），即在感染第 30、60 和 180 天取兔子腘窩淋巴結，用生理鹽水抽提，然后免疫新的兔子觀察抗體陽轉和感染癥狀以評估是否存在活性梅毒并評估治療效果。研究發(fā)現在治療組 30 天雖然大部分兔子的非特異性抗體未有 4 倍滴度下降，但 RIT 均為陰性，提示治療有效；而在非治療組，絕大部分兔子在感染第30、60 和 180 天的 RIT 為陽性，提示仍有感染力，但是大部分兔子的非特異性抗體滴度已經有 4 倍降低，所以綜合考慮，非特異性抗體滴度 4 倍降低和治療有效性的相關性值得進一步探索，但是兔子試驗能否代表真實的人體感染狀態(tài)尚有存疑，而且招募梅毒感染患者不進行治療以觀察血清學變化是不人道而且有違倫理，直接用 TP 感染人體更是道德喪失，所以尋找一個有效的評估梅毒治療效果的監(jiān)測指標還有很長的路要走。

8 梅毒非特異性抗體新探索

有研究發(fā)現，非特異性抗體的滴度和神經梅毒的發(fā)生率相關，上海復旦大學的盧洪洲教授和 Libois 認為梅毒和 HIV 共感染人群的 TRUST 抗體滴度在 1:16 或 1:32以上是無癥狀神經梅毒進行腰穿取腦脊液檢測的一個指標[64-65]；而楊天賜教授認為在 HIV 陰性的梅毒感染人群中，神經梅毒的發(fā)生除了和非特異性抗體滴度相關外，和特異性抗體 TPPA 的滴度也顯著相關，其認為 RPR 抗體滴度在 1:4 以上且 TPPA 的滴度在1:2560 以上，是判斷HIV 陰性的梅毒感染人群是否發(fā)生神經梅毒的一個有效指標，能大大降低不必要的侵襲性腰穿[66]。目前，非特異性檢測方法均為手工操作，臨床使用增加了大量人力成本，已有部分研究采用了自動化檢測方法，FDA 已批準兩個自動化的非特異性抗體檢測試劑，和傳統(tǒng)手工檢測方法相比，自動化檢測方法一致性較好，其中獲批的伯樂試劑的一致率為100%，陽性預測值范圍為 95%～100%，陰性預測值范圍為99.1%～100%[67-68]，而且大大節(jié)省了人力、提高了通量，但其在定量滴度檢測時還有一定局限性，不能對每一份樣本進行終點滴度的檢測。此外，及時的診斷和治療是防止梅毒進一步擴散的必要條件，尤其是胎傳梅毒，但在一些非洲國家，治療資源有限，因此快速區(qū)分現癥感染和既往感染或治療后梅毒具有重要意義。所以近些年梅毒特異性抗體和非特異性抗體雙通道快檢試劑已陸續(xù)開發(fā)研究，在多個國家對美國的一個商品化的梅毒篩查和確診試劑進行評估，結果顯示和參比試劑相比，特異性和靈敏度均較好，但是此試劑的性能受RPR 滴度以及前帶現象和血清固定影響，所以試劑的推廣應用還需要綜合考慮梅毒在當地的流行情況以及監(jiān)管和衛(wèi)生政策制定[69-73]。

9 結語

本文從梅毒非特異性抗體來源、類型、生物學假陽性、血清固定、診斷篩查和治療監(jiān)測方面的傳統(tǒng)認知和最新進展進行了詳細綜述，但梅毒非特異性抗體從基礎到臨床有太多的未知，深入研究梅毒非特異性抗體的來源、類型、生物學假陽性以及血清固定的發(fā)生機制，有利于理解梅毒疾病狀態(tài)和非特異性抗體的關系、神經梅毒和隱性梅毒的發(fā)生這些難題，并幫助制定梅毒診療新策略。