線粒體自噬對心力衰竭的作用及相關中藥研究進展

李偉利，王曉平，張雪峰，邵明燕，陳 旭，馬 林，張 倩，李 春，王 勇

心力衰竭并不是一個獨立的疾病，而是各種心臟疾病(冠心病、高血壓及特發(fā)性心肌病等)發(fā)展的終末階段，其特征是心臟不能維持足夠的血液輸出，是目前主要的公共健康問題[1]。由于心臟的高能量需求，線粒體占心肌細胞體積至少30%，線粒體功能障礙導致的能量代謝異常已成為心力衰竭的主要病理機制和干預環(huán)節(jié)[2]。線粒體自噬在心力衰竭中發(fā)揮重要作用，與線粒體動力共同維持著心臟線粒體的更新與質(zhì)量控制，為心臟持續(xù)收縮提供能量[3]。中藥通過作用于線粒體自噬治療心力衰竭的研究在近年來備受關注，相關研究日益增多[4-5]。本研究分析線粒體自噬在心力衰竭中的重要作用，總結線粒體自噬主要參與蛋白分子和信號通路，綜述中藥通過這些蛋白分子和信號通路治療心力衰竭的研究進展。

1 自噬與線粒體自噬概述

自噬指真核細胞吞噬自身胞質(zhì)蛋白或細胞器并使其包被進入囊泡形成自噬體，自噬體進一步與溶酶體融合形成自噬溶酶體，最終降解其所包裹的內(nèi)容物的過程[6]。生命體借此維持能量代謝平衡及細胞環(huán)境穩(wěn)定，調(diào)控細胞的更新和生長發(fā)育。另外，有關細胞“自噬作用”的研究于2016年獲得了諾貝爾醫(yī)學/生理學獎。線粒體自噬是細胞特異性并選擇性降解線粒體的過程，在心力衰竭情況下有顯著改變，因此，線粒體自噬對心力衰竭的作用機制研究受到人們的廣泛關注[7]。目前，多數(shù)研究集中于受損線粒體被識別吞噬的分子機制。哺乳動物的線粒體自噬識別機制主要依靠兩種線粒體膜蛋白標記物[8]，一種是富集于線粒體外膜且介導線粒體蛋白泛素化，從而促進泛素化的線粒體被接頭蛋白識別。接頭蛋白能夠將線粒體上的泛素與吞噬泡上的微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule associated protein 1 light chain 3，LC3)連接，從而促進吞噬泡吞噬降解線粒體。最典型的是PTEN誘導激酶1(PTEN-inducible putative kinase 1，PINK1)/ E3泛素連接酶(parkinson juvenile disease protein 2，Parkin)通路。另一種是功能上作為LC3的受體，與吞噬泡上的LC3結合域(LC3-interacting region，LIR)連接而被吞噬泡識別吞沒，包括：NIP3樣蛋白X(NIP3-like protein X，Nix)/腺病毒E1B 19 kDa 相互作用蛋白3樣(BNIP3L)、腺病毒E1B19 kDa相互作用蛋白3(BNIP3)、FUN14結構域包含蛋白1(FUN14 domain containing 1，F(xiàn)UNDC1)、Bcl2-L-13、抑制素2(PHB2)和心磷脂等。

2 線粒體自噬的分子機制

2.1 PINK1/Parkin介導的線粒體自噬 PINK1和Parkin介導的線粒體自噬是目前哺乳動物中建立最完整、研究最為清楚的機制。PINK1是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，其N端有靶向于線粒體的信號。通過外膜轉位酶(translocase of the outer membrane，TOM)和內(nèi)膜轉位酶(translocase of the inner membrane，TIM)，PINK1進入并固定于線粒體內(nèi)膜轉位酶上。在未受損線粒體內(nèi)，PINK1不斷地被基質(zhì)加工蛋白(matrix processing peptidase，MPP)和早老素相關菱形樣蛋白(presenilin-associated rhomboid-like，PARL)降解[9-10]。當線粒體受損時(去極化、非折疊蛋白增加等)，PINK1進入線粒體內(nèi)膜受阻而在線粒體外膜堆積[11]。此時，PINK1與TOM形成700 kDa的復合物，且自磷酸化于絲氨酸228和絲氨酸402位點[12-13]。激活的PINK1募集Parkin至受損線粒體，Parkin進一步介導線粒體外膜蛋白泛素化，促進泛素化的線粒體被接頭蛋白識別。接頭蛋白將線粒體上的泛素與吞噬泡上的LC3連接，最終吞噬降解線粒體。接頭蛋白在線粒體自噬中發(fā)揮重要作用，目前報道的有p62、NBR1、optineurin、NDP52和TAX1BP1[14]。PINK1募集并激活Parkin一直都是研究領域的重點，Gladkova等[15]報道了線粒體的磷酸-泛素是Parkin募集的原因，且PINK1不斷磷酸化Parkin導致了Parkin的激活。Wang等[16]報道AMP依賴的蛋白激酶α2[adenosine 5′-monophosphate (AMP)-activated protein kinase α2，AMPKα2]磷酸化PINK1絲氨酸495位點，從而增強PINK1的活性。然后，激活的PINK1磷酸化線粒體外膜上的融合蛋白2(mitofusin2，MFN2)，作為Parkin的線粒體受體[17]。也有報道稱PINK1介導了線粒體上泛素(包括Parkin泛素樣區(qū)域)的絲氨酸65位點磷酸化[18-19]，泛素的磷酸化直接激活Parkin而促進線粒體蛋白進一步被Parkin泛素化[20]。然而，也有研究證明在心肌細胞PINK1-/-時，Parkin依然能夠被募集激活[21]，說明除PINK1外，存在其他能夠激活Parkin從而激活線粒體自噬的通路。因此，有報道稱除了上述典型的PINK1/Parkin通路，PINK1和Parkin還參與了其他的線粒體蛋白清除機制。例如，Parkin促進含纈氨酸蛋白(valosin containing protein，VCP)/p97募集至受損線粒體，該酶提取泛素化蛋白用于蛋白酶體降解[22]；Parkin和PINK1還參與運送線粒體源性囊泡(mitochondria-derived vesicles，MDV)至溶酶體降解清除受損線粒體[23]。

2.2 Nix/BNIP3L和BNIP3 BNIP3和BNIP3L/Nix作為多功能的線粒體外膜蛋白，最初被鑒定為促凋亡的BH3-only蛋白。在心肌組織中，BNIP3和Nix的表達分別受到缺氧和Galphaq依賴性信號的調(diào)節(jié)而促進心肌細胞凋亡，導致心功能下降[24]。然而，BNIP3和Nix最廣為人知的是其作為線粒體自噬的調(diào)節(jié)因子，其可以作為線粒體自噬受體定位于線粒體外膜，通過其LIR與LC3結合，直接將吞噬泡招募至線粒體介導線粒體自噬。Kubli等[25]報道了心臟缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)后，氧化應激誘導BNIP3同源二聚化而激活線粒體自噬。此外，BNIP3和Nix還可能通過破壞Bcl-2和Beclin1的相互作用而直接激活細胞自噬[26]。

2.3 FUNDC1 FUNDC1是一種高度保守的線粒體外膜蛋白，廣泛表達于各種細胞、組織和器官，尤其心臟。作為線粒體自噬受體，其通過與LC3相互作用介導線粒體自噬。在正常壓力條件下，F(xiàn)UNDC1被SRC激酶和酪蛋白激酶2(casein kinase 2，CK2)磷酸化，降低其對LC3的親和力。在缺氧和線粒體膜解耦劑處理等應激條件下，F(xiàn)UNDC1被unc-51樣自噬激酶(unc-51 like autophagy activating kinase 1，ULK1)對其絲氨酸17位點磷酸化和磷酸甘油酸變位酶5(phosphoglycerate mutase family member 5，PGAM5)對其絲氨酸13位點去磷酸化而激活，增強了其LIR與LC3的結合而促進線粒體自噬[27-28]。因此，在缺氧和線粒體膜解耦劑處理等條件下，線粒體自噬以依賴于FUNDC1的方式發(fā)生。Zhang等[29]報道，在缺血/再灌注誘導的低氧條件下，心臟FUNDC1介導的線粒體自噬增加，血小板活性受損，缺血/再灌注的心臟損傷減少。

2.4 Bcl2-L-13 線粒體外膜蛋白Bcl2-L-13是一種酵母自噬相關蛋白32(autophagy-related protein 32，Atg32)的哺乳動物同源物，也可以作為線粒體自噬受體介導線粒體自噬。其能夠偶聯(lián)或通過特定的WXXI功能基序與LC3結合，以一種不依賴于Parkin的方式促進線粒體自噬[30]。此外，Bcl2-L-13還以不依賴于裂變調(diào)節(jié)劑動力相關蛋白1(dynamin-related protein 1，Drp1)的方式調(diào)節(jié)線粒體分裂，這主要由其保守的BH結構域促成[30]。Bcl2-L-13對線粒體自噬和分裂的雙重作用可能有助于提高清除受損線粒體的協(xié)調(diào)性和效率性。Murakawa等[31]報道，在哺乳動物中，Bcl2-L-13與ULK1復合物、微管相關蛋白輕鏈3B(LC3B)結合而促進饑餓誘導的線粒體自噬發(fā)生。因此，ULK1復合物在Bcl2-L-13介導的線粒體自噬中起著重要作用。

2.5 心磷脂 心磷脂存在于線粒體內(nèi)膜，許多研究報道了其作為線粒體自噬、分裂、代謝和凋亡的關鍵中介者的作用，且對維持心血管健康尤為重要[32]。據(jù)報道其在線粒體損傷時轉位至線粒體外膜而標記受損線粒體被識別，并與LC3直接相互作用[33]。然而，氧化的心磷脂積累在線粒體外膜會導致促凋亡蛋白Bax的釋放，線粒體滲透性轉運通道(mitochondria permeability transition pore，MPTP)打開而釋放促凋亡因子細胞色素C，最終導致細胞死亡[34]。

2.6 PHB2 最近發(fā)現(xiàn)的線粒體自噬受體是PHB2。PHB2雖具有LIR但位于線粒體內(nèi)膜，通常LC3無法到達，因此，其介導的線粒體自噬依賴于能夠導致線粒體外膜(OMM)破裂的OMM蛋白降解機制。例如，Parkin介導的泛素-蛋白酶體降解機制。哺乳動物細胞中，Parkin介導的線粒體自噬也需要PHB2，尤其在應對寡霉素/抗霉素誘導的應激反應時[35]，然而這是否能夠延伸到其他應激源還有待確定。

3 線粒體動力對線粒體自噬發(fā)生發(fā)展的作用

線粒體動力在線粒體質(zhì)量控制中起著關鍵作用，研究表明線粒體外膜的Mfn1和Mfn2、內(nèi)膜的視神經(jīng)萎縮癥蛋白1(optic atrophy 1，Opa1)調(diào)控線粒體融合，而Drp1、Fis1和線粒體分裂因子(mitochondria fission factor，MFF)調(diào)控線粒體分裂。越來越多的研究表明，線粒體分裂在一定程度上促進線粒體清除，而融合則抑制線粒體自噬。Song等[36]證實了線粒體動力在體內(nèi)線粒體周轉中的重要性，其對小鼠心臟特異性Drp1、融合蛋白1(MFN1)和MFN2敲除，線粒體動力被完全破壞，導致線粒體體量顯著增加、肌細胞畸變和心肌肥厚的發(fā)生。其中，線粒體的分裂對于分離功能失調(diào)的線粒體被自噬清除是非常重要的。在線粒體損傷時，分裂往往會產(chǎn)生不均等的子線粒體，有助于損傷成分與健康的細胞器分離。線粒體分裂可被Drp1調(diào)控，在應對壓力時，其從胞液轉移到線粒體內(nèi)，從而促進線粒體分裂和自噬[37]。Shirakabe等[38]報道，Drp1下調(diào)誘導線粒體融合而抑制線粒體分裂和自噬，從而加重壓力誘導的心力衰竭。

4 線粒體自噬的檢測

目前，線粒體自噬檢測方法主要有透射電鏡技術、免疫金標記技術(線粒體和自噬體標記蛋白抗體共定位)、熒光標記基因轉染技術(mCherry/mRFP-GFP-LC3、mKeima)、熒光探針標記技術(Mitotracker、LysoTracker)、免疫熒光技術(CypD、Hsp60、Lamp1/2)、免疫印跡技術。然而，大多數(shù)方法只適用于體外培養(yǎng)的活細胞檢測，體內(nèi)線粒體自噬檢測方法成為線粒體自噬研究領域的一大障礙。最近出現(xiàn)了幾種可以監(jiān)測和量化體內(nèi)組織線粒體自噬通量的方法：MitoTimer、mt-Keima和mito-QC熒光蛋白轉基因技術[39]，這3種熒光蛋白都可以定位于線粒體而準確地測量線粒體自噬活性。MitoTimer是一種對時間敏感的熒光蛋白，在蛋白成熟過程(48 h內(nèi))中，其發(fā)射的熒光由綠色不可逆轉地變?yōu)榧t色，綠色、黃色和紅色的線粒體分別對應于新合成的線粒體、中間線粒體和舊線粒體[40]，由不同熒光的比例來反映線粒體的周轉率。mt-mKeima和mito-QC都是對pH敏感的線粒體熒光探針。mt-mKeima在酸性和中性條件下分別發(fā)射紅色和綠色熒光，當線粒體自噬體與酸性溶酶體融合后Keima蛋白的熒光信號由綠色轉為紅色。mito-QC由串聯(lián)的mCherry-GFP與線粒體外膜蛋白FIS1序列融合而形成。在穩(wěn)態(tài)條件下，mito-QC呈現(xiàn)紅色和綠色熒光，而線粒體被傳遞到溶酶體時，GFP(綠色)淬滅，mCherry(紅色)仍舊穩(wěn)定[41]。兩者都可以用于實時動態(tài)監(jiān)測線粒體自噬過程。有研究通過小鼠頸靜脈注射AAV9-Mito-Keima和AAV9-Lamp1-YFP制備了mt-mKeima和Lamp1雙轉基因小鼠用于實時監(jiān)測心臟線粒體自噬通量[42]。

5 中藥通過線粒體自噬治療心力衰竭的研究進展

在多種心臟疾病研究中，報道了許多中藥活性成分作用于心肌線粒體自噬上游通路或線粒體自噬關鍵蛋白而調(diào)節(jié)線粒體自噬，起到心臟保護作用。例如，葒草苷[4]、小檗堿[5]作用于線粒體自噬腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路調(diào)節(jié)自噬平衡而保護心臟；紫荊黃酮通過抑制胞內(nèi)PI3K/Akt通路而發(fā)揮心肌保護作用[43]；針對線粒體自噬中的PINK1/Parkin通路，大蒜辣素[44]、白藜蘆醇[45]具有激活作用，而葒草苷具有抑制作用[46]，分別促進心肌線粒體自噬或抑制心肌線粒體自噬過度激活，保護心??；丹酚酸B[47]、梓醇[48]、人參皂苷[49]等能夠促進心肌自噬關鍵蛋白(LC3、Beclin1、p62)的表達而促進自噬，發(fā)揮心肌保護作用；而香青蘭總黃酮[50]顯著減少心肌自噬關鍵蛋白的表達而抑制自噬過度激活，同樣能夠發(fā)揮心肌保護作用?？傊鶕?jù)對自噬的作用，目前研究報道的能夠調(diào)節(jié)自噬發(fā)揮心肌保護作用的中藥活性成分大致分為兩類：促進自噬和抑制自噬。然而無論是促進自噬還是抑制自噬過度激活，這些中藥復方或活性成分都能夠維持線粒體自噬平衡而發(fā)揮心肌保護作用，但其產(chǎn)生促進或抑制作用的藥理機制仍需深入研究。

6 小結與展望

本研究通過全面總結分析線粒體自噬的分子機制及其對心臟疾病的作用，為中藥治療心力衰竭提供更多研究環(huán)節(jié)。線粒體自噬的主要分子機制包括PINK1/Parkin通路和線粒體自噬受體(Nix、BNIP3、FUNDC1、Bcl2-L-13、Cardiolipin、PHB2)介導的線粒體自噬。其中對PINK1/Parkin介導的線粒體清除機制研究最為清楚，涉及典型的PINK1/Parkin通路、泛素-蛋白酶體降解系統(tǒng)和MDV通路等多個機制影響線粒體質(zhì)量控制。近年來，對線粒體自噬受體的研究日益增多，尤其是在心臟疾病發(fā)生及其中藥應用的分子機制研究領域。對于線粒體自噬的檢測，目前大多數(shù)線粒體自噬檢測技術只適用于離體培養(yǎng)細胞，可靠的體內(nèi)線粒體自噬檢測方法成為線粒體自噬研究領域的一大障礙，因此，能夠監(jiān)測和量化體內(nèi)組織線粒體自噬通量的方法與技術亟待開發(fā)。許多中藥通過作用于AMPK、mTOR、PI3K、Akt等線粒體自噬上游蛋白，調(diào)節(jié)PINK1、Parkin、LC3、p62、Beclin1等線粒體自噬關鍵蛋白的表達以控制線粒體質(zhì)量，對心臟起到潛在的保護作用。以確有療效的中藥為模板，篩選基于線粒體自噬進而改善心肌能量代謝的有效中藥/分子，以期為臨床心力衰竭的治療提供新的靶點和潛在的治療藥物。