實時熒光定量PCR法在手足口病中的診斷價值

李文瑞 葉敏南 何月敬 梁健行 呂 芬 黎四平 張耀忠

1.廣東醫(yī)科大學附屬東莞兒童醫(yī)院檢驗科，廣東東莞 523320；2.廣東省東莞市兒科研究所，廣東東莞 523320

手足口病在醫(yī)學上較為多發(fā)，它主要是由腸道病毒感染而導致的傳染性疾病，近年來的臨床調查發(fā)現(xiàn)此病癥已成為兒童的常見疾病之一[1-2]，發(fā)病時間主要集中在春夏季，尤其是男童的數量明顯多于女童，但年齡越大的兒童，發(fā)病會越少[3]。其臨床癥狀主要表現(xiàn)為厭食、低熱、口腔、手部及足部出現(xiàn)小潰瘍，大部分兒童在患有手足口病后會自行康復，但也有少部分兒童的病情會進一步加重而引發(fā)肺水腫和心肌炎等并發(fā)癥，嚴重時還有可能導致兒童死亡[4-5]。臨床對手足口病的診斷依靠已經出現(xiàn)疾病或癥狀來判斷，癥狀不明顯時會導致漏診，影響治療，因此選擇一種安全有效的方式對其進行診斷，對于兒童的康復來說極為重要, QPCR 檢測是臨床上常見的一種檢測方法，本研究采用實時熒光定量PCR（QPCR）法檢測手足口病，評價其臨床價值，現(xiàn)將實驗結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019 年1—12 月我院手足口病兒童163 例作為本次研究的試驗組，其中女72 例，男91 例，年齡13 d ～8 歲，平均（4.7±2.9）歲，該組患者均符合《兒科手足口病理學診斷規(guī)范》中相關病癥的診斷標準[6]，其基本資料均完整登記。選取同期在我院體檢的161 例兒童作為對照組，其中女74 例，男87例，年齡21 d～7歲，平均（5.2±1.7）歲。

納入標準：①年齡在8 歲以下的兒童；②有手、口腔等出現(xiàn)皰疹且疑似手足口病的有關癥狀兒童；③完善腸道病毒PCR 相關檢查的兒童。排除標準：①存在基礎性疾病或嚴重精神障礙的兒童；②有其他病毒性感染兒童；③未完善腸道病毒PCR 相關檢查的兒童。兩組兒童一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

1.2 儀器與試劑

實時熒光定量PCR 檢測采用ABI7500 熒光定量PCR 儀（美國賽默飛）對CoxA16、EV、EV71 進行檢測，擴增反應條件：40℃ 25 min，1 個循環(huán)；94℃ 3 min，1 個循環(huán)；93℃ 15 s，55℃ 45 s，40 個循環(huán)。試劑采用中山大學達安基因股份有限公司原裝試劑。

1.3 方法

標本采集：采集兒童糞便標本6 ～9 g，立即放入專用采便管內，0 ℃冰壺保存，30 min 內送檢。核酸提取及檢測等所有操作均說明書進行，操作人員都取得相應資格證。陽性結果需同時滿足下列3項：①陰性質控品。無典型S 型擴增曲線或無Ct 值；②陽性質控品。呈典型S 型擴增曲線且Ct ≤30；③檢測樣本結果呈S 型擴增曲線且Ct 值≤34.9。

1.4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0 對實驗數據進行分析處理，計數資料用[n（%）]表示，采用χ2檢驗，計量資料用（）表示，采用t檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

試驗組163 例兒童中實時熒光定量PCR 檢測陽性144 例，其中女61 例，男83 例，陽性為144 例（88.34%），對照組161 例兒童中陽性3 例，陽性為3 例（1.86%），兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（χ2=21.873，P=0.000 ＜0.05）。對 照 組144 例 手足口病患兒中主要以腸道病毒EV 為主，有102 例（70.83%），其次是CA16，有33 例（22.92%），最后是EV71，有9 例（6.25%）。

3 討論

手足口病是由于腸道病毒感染而導致起的兒童傳染病，潛伏期大約為1 周左右[7-8]，其發(fā)病時間分布較為廣泛，并且不存在明顯的地區(qū)性，每年的春夏秋冬均有發(fā)病的可能，但在我國以夏秋季為高發(fā)季節(jié)，在疾病的爆發(fā)期間，托兒所及幼兒園呈現(xiàn)集體感染，其具有極強的傳染性，主要通過患者的咽喉分泌物、皰疹液、唾液、糞便進行傳播，能夠在短時間內形成較大的規(guī)模流行[9]。我國目前出現(xiàn)手足口病的兒童年齡通常在5 歲以下并且以男童為主[10]，而大部分兒童的發(fā)病時間都在每年的5—10 月，兒童的發(fā)病持續(xù)時間通常在2 ～7 d，尤其是2 ～4 歲的兒童發(fā)病率最高，隨著兒童年齡的增長，發(fā)病率會逐漸降低[11]。有文獻報道腸道病毒中的EV71 病毒感染兒童，隨著其感染癥狀的不斷發(fā)展，會出現(xiàn)較為明顯的神經系統(tǒng)并發(fā)癥[12-13]，具有較大的危害性以及致死率。

QPCR 技術是核酸檢測中常用方法，這種技術不僅具有普通PCR 的高靈敏性，并且在檢驗過程中將熒光探針應用于其中，同時具有DNA 雜交的高特異性和光譜技術的高精確性[14]，檢測過程中總時長大約2.5 h，加快了檢測時間，對于手足口病患者的確診及治療提供了相應的證據，也為患者后續(xù)的治療工作開展提供了參考依據[15]。在本研究結果中顯示試驗組163 例兒童中QPCR 檢測陽性144 例，陽性率為88.34%，對照組161 例兒童中陽性3 例，陽性率1.86%，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），對照組有3 例陽性可能是癥狀不明顯的手足口病。我們研究還發(fā)現(xiàn)，手足口患者中主要以腸道病毒EV 為主，有102 例（70.83%）。因此將QPCR 檢測方案應用于手足口病的檢測中，患兒的診斷陽性率與實驗室病理檢查結果無明顯差異。

綜上所述，實時熒光定量PCR 對手足口病的早期診斷有較高的臨床價值，對于后續(xù)的治療工作有積極意義，值得臨床上推廣使用。