間充質(zhì)干細(xì)胞治療下肢靜脈性潰瘍的應(yīng)用和機(jī)制

徐明媛，溫見(jiàn)燕，劉 鵬*

（1．北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部中日友好臨床醫(yī)學(xué)院，北京 100029；2．中日友好醫(yī)院 心臟血管外科，北京 100029）

下肢靜脈性潰瘍（venous leg ulcers，VLU）常由慢性靜脈疾病（chronic venous disease，CVD）引起，是下肢慢性靜脈功能不全（chronic venous insufficiency，CVI）嚴(yán)重和難治的表現(xiàn)。2014年，血管外科協(xié)會(huì)和美國(guó)靜脈論壇發(fā)布了相關(guān)臨床實(shí)踐指南，將VLU 定義為發(fā)生在靜脈高壓影響區(qū)域的腿部或足部開(kāi)放性皮膚病變[1]。其表現(xiàn)通常為位于足靴區(qū)的單發(fā)或多發(fā)的淺表潰瘍，邊緣形狀不規(guī)則，滲出液為黃白色，可見(jiàn)纖維及肉芽組織，壞死組織很少，伴有不同程度的疼痛、下肢浮腫、濕疹及瘙癢[2]。VLU 約占所有下肢潰瘍的70%，每年新發(fā)病率約為1.5%，是最常見(jiàn)的下肢潰瘍類型[3]。研究報(bào)告顯示，靜脈潰瘍平均需要6～12 個(gè)月的時(shí)間才能完全治愈，其中70%可能在閉合5年內(nèi)復(fù)發(fā)。近年研究人員對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞 （mesenchymal stem cells，MSCs） 治療皮膚損傷進(jìn)行了廣泛的研究并觀察到有益的效果。但這些研究主要集中于缺血性傷口、糖尿病傷口和輻照傷口，現(xiàn)就MSCs 治療VLU 其臨床應(yīng)用和機(jī)制做一綜述。

1 VLU 的病理過(guò)程概述

VLU 其發(fā)病的中心環(huán)節(jié)是靜脈高壓的形成。CVD 導(dǎo)致局部靜脈曲張，中膜結(jié)構(gòu)受到嚴(yán)重破壞，平滑肌細(xì)胞（smooth muscle cells，SMCs）失去收縮功能，并向分泌表型轉(zhuǎn)變，細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）中膠原蛋白水平增加，彈性蛋白水平降低，降低了靜脈收縮功能；內(nèi)皮的損傷和瓣膜破壞進(jìn)一步抑制了靜脈正常收縮的能力。靜脈收縮不良會(huì)導(dǎo)致靜脈纖維化，加之小腿肌肉泵功能不足最終形成靜脈高壓[4]，影響淺靜脈、深靜脈和介于兩者之間的穿支靜脈系統(tǒng)。

正常傷口愈合分為止血、炎癥、增殖、重塑4 個(gè)連續(xù)階段。VLU 的特征性階段為炎癥持續(xù)狀態(tài)，涉及白細(xì)胞（特別是巨噬細(xì)胞）以及多種趨化因子、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、金屬蛋白酶的活化和表達(dá)。在微循環(huán)中，血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，表面糖萼受到剪切應(yīng)力損傷，激活趨化因子（MCP-1和MIP-1）、黏附分子（ICAM-1、VCAM-1 和選擇素）、內(nèi)皮調(diào)節(jié)因子（NO）等，可誘導(dǎo)白細(xì)胞遷移[5]；靜脈高壓導(dǎo)致毛細(xì)血管床擴(kuò)張，內(nèi)皮窗孔擴(kuò)大，纖維蛋白原和紅細(xì)胞外溢，由于血液和組織液中的纖維蛋白溶解活性不足，纖維蛋白原形成大分子纖維蛋白沉積在毛細(xì)血管周圍，阻礙氧氣和其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)通過(guò)；同時(shí)紅細(xì)胞被降解，鐵離子冗余沉積在真皮間質(zhì)中，紅細(xì)胞降解產(chǎn)物、血紅蛋白中的鐵與間質(zhì)中的蛋白共同作為炎癥介質(zhì)傳導(dǎo)慢性炎癥信號(hào)，吸引巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞游走出血管；這些過(guò)程促進(jìn)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforming growth factor-β1，TGFβ1）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-1（interleukin-1，IL-1）等細(xì)胞因子產(chǎn)生增多，以及基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）的表達(dá)增加。毛細(xì)血管、毛細(xì)血管后小靜脈、間質(zhì)和淋巴管等微循環(huán)結(jié)構(gòu)可對(duì)過(guò)度反應(yīng)的炎癥途徑和細(xì)胞因子、趨化因子、MMPs、鐵自由基等物質(zhì)作出反應(yīng)[2]，導(dǎo)致皮膚和真皮損害。

2 VLU 的壓力治療和外科治療

VLU 的治療主要針對(duì)慢性潰瘍和慢性靜脈功能不全2 方面。對(duì)不伴發(fā)動(dòng)脈疾病的靜脈性潰瘍患者，壓力治療是初始和長(zhǎng)期治療的標(biāo)準(zhǔn)治療方式。給予潰瘍的靜脈外部壓力可以使液體從組織間隙進(jìn)入血管和淋巴腔，并增強(qiáng)小腿肌肉泵的活動(dòng)能力，能夠減輕局部水腫和疼痛、改善靜脈回流、促進(jìn)愈合和防止復(fù)發(fā)[6]。用于壓力治療的裝置分為靜態(tài)壓縮、動(dòng)態(tài)壓縮和混合壓縮，壓力范圍分為輕度（＜20mmHg）、中度（20～40mmHg）、強(qiáng)（40～60mmHg）、極強(qiáng)（＞60mmHg）[7]，壓力治療6 個(gè)月后約有30%～75%的VLU 會(huì)愈合[1，3]。但壓力治療易致患者依從性不佳，使用不合規(guī)及隨訪頻率低，限制臨床醫(yī)生對(duì)癥狀惡化患者進(jìn)行干預(yù)。對(duì)于患有靜脈功能不全但不伴深靜脈阻塞的患者，可選用外科治療手段，包括開(kāi)放式手術(shù)、腔內(nèi)治療及微創(chuàng)手術(shù)等，淺靜脈反流可選擇高位結(jié)扎、剝脫或射頻消融[8]；若伴有穿支反流，則需要結(jié)扎功能不全的穿通靜脈。盡管進(jìn)行了適當(dāng)?shù)闹委?，VLU 仍有漫長(zhǎng)的愈合過(guò)程，并可多次復(fù)發(fā)，對(duì)于復(fù)發(fā)性潰瘍的處理需開(kāi)發(fā)新的治療方式。

3 細(xì)胞療法——MSCs 的治療潛力及應(yīng)用

MSCs 作為一種具備自我更新和多向分化能力的特殊細(xì)胞，其來(lái)源豐富，免疫原性低，能夠分化為多個(gè)譜系細(xì)胞，有潛力應(yīng)用于皮膚缺損的治療[9]。國(guó)際間充質(zhì)干細(xì)胞與組織干細(xì)胞委員會(huì)提出了用于實(shí)驗(yàn)室科學(xué)研究的MSCs最低標(biāo)準(zhǔn)：（1） 在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下時(shí)，MSCs 能貼壁生長(zhǎng)；（2）MSCs 必須表達(dá)基質(zhì)細(xì)胞相關(guān)抗原CD105、CD73 和CD90，并且不表達(dá)淋巴造血細(xì)胞相關(guān)抗原CD45、CD34、CD14/CD11b、CD79α 或CD19 和HLA-DR；3）MSCs 在 體外條件下可以誘導(dǎo)分化為成骨細(xì)胞，脂肪細(xì)胞和軟骨細(xì)胞。目前多項(xiàng)研究已證實(shí)MSCs 的應(yīng)用是治療VLU 較為理想的方案。

3.1 MSCs 在VLU 中的應(yīng)用

3.1.1 骨髓來(lái)源的細(xì)胞（bone marrow-derived cells，BMDCs）在VLU 中的應(yīng)用

骨髓是MSCs 的主要來(lái)源之一，在VLU 的治療中有一定的應(yīng)用。直接將骨髓抽吸物涂抹在潰瘍表面及注入其周圍，可觀察到真皮重建及潰瘍完全閉合；從骨髓抽吸物中分離出MSCs，在體外擴(kuò)增后將其以纖維蛋白噴霧的形式表達(dá)在潰瘍周圍，也可加速皮膚愈合；將骨髓浸潤(rùn)的膠原蛋白基質(zhì)覆蓋于潰瘍表面，可誘導(dǎo)出新鮮健康的肉芽組織；以上均表明BMDCs 在促進(jìn)潰瘍愈合中的有益作用。將處理過(guò)的自體BMDCs 多次注射到難治性潰瘍周圍中，可以觀察到潰瘍面積縮小和疼痛感降低，表明自體BMDCs療法安全可行有效[10]。

3.1.2 脂肪來(lái)源的基質(zhì)細(xì)胞 （adipose-derived stromal cells，ADSCs）在VLU 中的應(yīng)用

脂肪組織和骨髓組織一樣，均來(lái)自于中胚層，含有大量的細(xì)胞基質(zhì)成分。1964年Rodbell 采用蛋白酶消化和梯度離心的方法，由脂肪組織中分離得到富含細(xì)胞成分，并將其命名為基質(zhì)血管成分（stromal vascular fraction，SVF）。2001年，Zuk 等通過(guò)系列研究證實(shí)，SVF 中的細(xì)胞成分具有多細(xì)胞系分化能力。ADSCs 也是多能干細(xì)胞，具有與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相似的特性，它們能表達(dá)相同的表面標(biāo)志物，具有相似的基因表達(dá)譜和相似的分化潛能。ADSCs 在脂肪組織中大量存在，且易于分離和擴(kuò)增，可以替代骨髓來(lái)源的干細(xì)胞。

Maslowski 等[11]將富含ADSCs 的細(xì)胞濃縮物皮下植入到傷口及傷口周圍，進(jìn)而評(píng)估自體ADSCs 移植治療慢性靜脈淤積性潰瘍的安全性和潛在療效。他們觀察到75%的潰瘍有所改善，傷口大小與傷口愈合程度之間呈高度負(fù)相關(guān)性，且潰瘍愈合與評(píng)估的其它參數(shù)沒(méi)有相關(guān)性，治療過(guò)程中也沒(méi)有觀察到嚴(yán)重的副作用，表明ADSCs 的自體移植可能是一種安全且有希望的治療慢性靜脈潰瘍的方法。Zollino 等[12]的研究表明，SVF 中CD34+/CD45-非造血細(xì)胞的百分比與愈合時(shí)間呈負(fù)相關(guān)，可能是治療的預(yù)測(cè)指標(biāo)。Kavala 等人[13]的研究納入了31 例接受了外科手術(shù)而6 個(gè)月后未顯示潰瘍治療獲益的患者，將自體SVF 注入到潰瘍及其周圍，并加用彈性繃帶治療，能夠降低一年復(fù)發(fā)率。Larsen 等[14]將富含自體ADSCs 的高密度脂肪抽吸物置于OASIS 傷口基質(zhì)敷料上，每日局部滴入噻嗎洛爾，聯(lián)合壓力治療，使30年VLU 患者的潰瘍完全上皮化，并持續(xù)愈合了15 個(gè)月以上；進(jìn)一步研究證明，噻嗎洛爾能降低局部微生物感染誘導(dǎo)ADSCs 產(chǎn)生IL-6、IL-8 的水平。也有個(gè)例研究證明MSCs 移植產(chǎn)生的免疫排斥反應(yīng)較小。

3.1.3 胎盤MSCs 在VLU 中的應(yīng)用

一項(xiàng)前瞻性的單臂研究比較了局部應(yīng)用冷凍保存的人胎盤組織聯(lián)合標(biāo)準(zhǔn)治療與單純標(biāo)準(zhǔn)治療的差異[15]，結(jié)果顯示聯(lián)合治療能夠使53%的標(biāo)準(zhǔn)治療無(wú)效的VLU 實(shí)現(xiàn)潰瘍完全愈合，80%的VLU 潰瘍面積減少一半，這表明胎盤來(lái)源的MSCs 可輔助治療慢性難治性VLU。

3.2 MSCs 的作用機(jī)制

在慢性傷口環(huán)境中，MSCs 能通過(guò)多種機(jī)制減輕炎癥持續(xù)反應(yīng)： 減少促炎細(xì)胞因子IL-1、IL-6 和TNF-α 的分泌，同時(shí)增加抗炎細(xì)胞因子IL-10 的釋放[16]，具有顯著的抗炎能力；誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞從有極強(qiáng)促炎活性的M1 型轉(zhuǎn)變?yōu)镸2 型[17]，后者能促進(jìn)傷口愈合和ECM 沉積，減輕鐵過(guò)載引起的組織破壞；分泌抗炎蛋白TSG-6[18]及激活巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-10[19]等機(jī)制來(lái)抑制炎癥反應(yīng)，增強(qiáng)機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)作用。MSCs 還能通過(guò)旁分泌機(jī)制產(chǎn)生許多組織修復(fù)介質(zhì)[20]，包括堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子 （basic fibroblast growth factor，bFGF）、角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子（keratinocyte growth factor，KGF）、TGF-β、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（hepatocyte growth factor，HGF）和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等，誘導(dǎo)細(xì)胞遷移和增殖，促進(jìn)血管新生，重建正常的血液供應(yīng)，為表皮和真皮細(xì)胞的遷移和增殖提供了有利的微環(huán)境。MSCs 還可通過(guò)分泌金屬蛋白酶組織抑制劑 （tissue inhibitors of metalloproteinase，TIMP），抑制MMP-2 和MMP-9，保護(hù)ECM 和內(nèi)皮細(xì)胞免受破壞。除了分泌可溶性分子外，MSCs 也能釋放外泌體，參與細(xì)胞內(nèi)通訊[21]，促進(jìn)表皮細(xì)胞的遷移和生長(zhǎng)、抑制免疫、促進(jìn)血管新生、抑制瘢痕形成[22，23]。

3.3 總結(jié)

細(xì)胞療法在VLU 中的應(yīng)用目前僅限于對(duì)標(biāo)準(zhǔn)治療無(wú)反應(yīng)的患者，可被視為壓力治療和外科治療的補(bǔ)充。MSCs來(lái)源廣泛、易于獲取、同種移植免疫排斥很小，相比于其他干細(xì)胞，更具有治療潛力。對(duì)骨髓而言，隨著年齡的增長(zhǎng)，MSCs 的數(shù)量和分化潛能下降，且獲取骨髓是有創(chuàng)性操作，會(huì)給供者帶來(lái)一定的傷害，獲取的骨髓中含有許多造血組織，分離純化困難，造成材料浪費(fèi)；人類胎盤組織MSCs 制成生物產(chǎn)品價(jià)格昂貴，沒(méi)有成本-效益分析，可能存在倫理問(wèn)題，研究和應(yīng)用尚存在困難；而脂肪來(lái)源的MSCs 原料更加廣泛，可多次自體取材，并發(fā)癥少，培養(yǎng)成功率高，集落數(shù)量最多，基于其綜合優(yōu)勢(shì)，脂肪來(lái)源的MSCs 可作為治療VLU 最佳細(xì)胞來(lái)源。臍帶血MSCs 增殖能力最強(qiáng)、免疫原性低、獲取容易[24]，在皮膚缺陷小鼠模型中減少成纖維細(xì)胞的積聚，減輕疤痕形成，但目前尚無(wú)治療VLU 的臨床應(yīng)用證據(jù)。MSCs 應(yīng)用途徑有很多，包括注射、涂抹、噴霧等方式，盡管研究結(jié)果提示上述途徑均能夠發(fā)揮治療作用，但因其最終存活的MSCs 數(shù)量有限，因此療效并不十分理想。相比之下，干細(xì)胞條件培養(yǎng)基能收集MSCs 分泌的大量細(xì)胞因子，生物工程支架能補(bǔ)充損傷修所需的基質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)成分，聯(lián)合使用富血小板血漿[25]、含MMPs 抑制劑的傷口敷料[26]等這些應(yīng)用途徑能最大限度的發(fā)揮MSCs 的治療作用。另外MSCs 的生物學(xué)特性具有可塑性，通過(guò)對(duì)MSCs 進(jìn)行低氧預(yù)處理、生物活性分子預(yù)處理、基因修飾預(yù)處理和力學(xué)刺激預(yù)處理等[27]，使其生物效能增強(qiáng)，功能達(dá)到最大化。

4 展望

VLU 的病理生理機(jī)制復(fù)雜，愈合周期長(zhǎng)，復(fù)發(fā)率高。MSCs 作為一種具備自我更新和多向分化能力的特殊細(xì)胞，多項(xiàng)研究均證實(shí)其在傷口修復(fù)和組織再生中的重要作用，有潛力應(yīng)用于治療VLU。MSCs 易于獲取，并發(fā)癥少，在VLU 患者中應(yīng)用均表現(xiàn)出較好的治療效果。但要將其廣泛地用于VLU 的治療仍有幾個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題需要解決： ①M(fèi)SCs治療VLU 的分子機(jī)制仍不十分明確，需要進(jìn)一步探究；②需要進(jìn)一步研究以確定最佳的MSCs 細(xì)胞來(lái)源和細(xì)胞治療方式；③MSCs 治療下肢靜脈潰瘍的周期和不良反應(yīng)仍不明確，仍需更多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以及大樣本人體實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證；④加用細(xì)胞治療的時(shí)期仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)確定。