基于Notch信號(hào)通路探討中醫(yī)藥干預(yù)缺血性腦卒中的研究進(jìn)展

周劍英，何思錦，顧力華，謝 青

缺血性腦卒中是由多種因素誘發(fā)腦組織局部血流灌注減少或完全中斷，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞處于缺氧缺血狀態(tài)的神經(jīng)內(nèi)科常見疾病類型，病人主要臨床表現(xiàn)為不同程度的神經(jīng)功能損傷，如失語、偏癱等[1]。流行病學(xué)報(bào)道顯示，我國(guó)缺血性腦卒中發(fā)病率為2萬～3萬，而致死致殘率為30%～40 %，病人出院后常合并肢體運(yùn)動(dòng)功能障礙，在影響自身工作生活質(zhì)量的同時(shí)，亦給家庭和社會(huì)帶來極大負(fù)擔(dān)[2]。針對(duì)神經(jīng)再生是缺血性腦卒中具有神經(jīng)功能恢復(fù)的難點(diǎn)及核心問題，通過Notch信號(hào)通路，調(diào)節(jié)具有自我更新能力的神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化是腦缺血后神經(jīng)再生的主要分子機(jī)制。近年來，由于中醫(yī)藥防治腦卒中具有不良反應(yīng)少、療效佳等優(yōu)勢(shì)，在急性期、恢復(fù)期的臨床治療中得到廣泛應(yīng)用。然而，其作用機(jī)制尚未明確，一定程度上限制了中醫(yī)藥在治療缺血性腦卒中方面的發(fā)展[3]。因此，本研究從 Notch 信號(hào)通路對(duì)調(diào)節(jié)具有自我更新能力的神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化角度，探討中醫(yī)藥治療缺血性腦卒中的可能機(jī)制。

Notch基因于1917年被Morgan等發(fā)現(xiàn)，它的突變將導(dǎo)致果蠅翅膀出現(xiàn)缺口(Notch)，得名由此而來。Notch廣泛存在于從無脊椎動(dòng)物到哺乳動(dòng)物等多個(gè)生物，并精確調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡，在細(xì)胞生長(zhǎng)和生理功能等方面發(fā)揮著重要作用，Notch信號(hào)通路在缺血性腦卒中發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

1 Notch信號(hào)通路概述

經(jīng)過長(zhǎng)期的進(jìn)化，成熟的大腦使用了一系列通路來管理認(rèn)知功能，例如Notch信號(hào)通路。Notch信號(hào)通路主要包括受體(Notch1、Notch2、Notch3、Notch 4)、配體(Delta like 1 即 DLL1、DLL3、DLL4 和 Jagged 1、Jagged 2)、CSL-DNA 結(jié)合蛋白以及其他效應(yīng)分子和調(diào)節(jié)分子。Notch通路的多個(gè)組成部分在血管系統(tǒng)中表達(dá)，缺乏這些組成部分的小鼠表現(xiàn)出胚胎致死性和血管重塑缺陷[4]。經(jīng)典的Notch信號(hào)通路的激活途徑是通過相鄰細(xì)胞的Notch配體與受體結(jié)合，Notch受體蛋白經(jīng)過3次剪切，由胞內(nèi)段(NICD)釋放入胞質(zhì)，形成NICD/CSL轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合體，并進(jìn)入細(xì)胞核與轉(zhuǎn)錄因子CSL結(jié)合，從而激活堿性-螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄抑制因子家族的靶基因(如Hes1、Hes等)發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[5]。Notch 信號(hào)通路在神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化的調(diào)節(jié)中具有重要作用，是一條高度保守的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化潛能為缺血性腦卒中神經(jīng)修復(fù)與重塑提供了可能，Notch 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化具有重要調(diào)節(jié)作用[6]。

1.1 Notch信號(hào)通路對(duì)缺血性腦卒中神經(jīng)分化與再生的影響 缺血性腦卒中發(fā)生后，會(huì)出現(xiàn)神經(jīng)元腫脹，壞死甚至凋亡。1992年，Reynolds等先后從胎鼠和成鼠紋狀體分離得到神經(jīng)干細(xì)胞，哺乳動(dòng)物“成年中樞神經(jīng)系統(tǒng)不再具有神經(jīng)細(xì)胞新生能力”的傳統(tǒng)認(rèn)識(shí)被打破。成年哺乳動(dòng)物神經(jīng)干細(xì)胞主要聚集區(qū)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中側(cè)腦室壁的腦室下區(qū)和海馬齒狀回的顆粒下層被證實(shí)[7]。Alhajzen等[8]通過小鼠缺血模型的研究發(fā)現(xiàn)，Notch配體DLL4在正常灌注的微血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)較弱，而缺血后在發(fā)芽的毛細(xì)血管最前端表達(dá)增強(qiáng)。DLL4-Notch信號(hào)通過干預(yù)血管分支形態(tài)發(fā)生來調(diào)節(jié)側(cè)支血管的形成。DLL4還通過干預(yù)動(dòng)脈功能和結(jié)構(gòu)來影響血管灌注，其信號(hào)激活在再灌注期間血管分支的重組中非常重要[9]。腦缺血后恢復(fù)期神經(jīng)再生是重要的環(huán)節(jié)，已有實(shí)驗(yàn)證明此過程中有Notch信號(hào)通路的參與，如果抑制Notch信號(hào)通路，腦內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元的過程也受阻，這表明腦缺血損傷后Notch信號(hào)通路被激活，并且在神經(jīng)干細(xì)胞存活、增生和分化過程中均發(fā)揮重要作用[10]。郭娜等[11]通過建立PC12誘導(dǎo)的神經(jīng)元樣細(xì)胞氧糖剝奪(OGD)體外腦缺血模型，觀察Notch受體在腦缺血損傷中的表達(dá)變化及其配體Jagged1對(duì)缺血損傷的影響，發(fā)現(xiàn)OGD的PC12 細(xì)胞在3 h、6 h、9 h、12 h、16 h、24 h的不同時(shí)間點(diǎn)Notch1 mRNA的表達(dá)量與正常組比較均明顯升高；與對(duì)照組相比，外源性Jagged1干預(yù)可導(dǎo)致正常及缺血神經(jīng)元的存活率下降，可見腦缺血損傷過程有Notch信號(hào)通路的參與。

1.2 Notch信號(hào)通路對(duì)腦缺血后血管損傷的影響 神經(jīng)再生和突觸發(fā)生的首要條件是微血管的新生，這對(duì)神經(jīng)功能的恢復(fù)有決定性作用。內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和重塑是血管新生的主要過程，涉及多條信號(hào)通路分子和生長(zhǎng)因子，其中一條是Notch信號(hào)通路。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子是血管生長(zhǎng)因子中重要的一員，能增加血管通透性、促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管形成[12]。有研究表明，Notch信號(hào)通路的配體 DLL4通過表達(dá)可抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子信號(hào)，血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移會(huì)因此減少。Kikuchi等[13]采用沒有血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的小鼠后肢缺血模型，發(fā)現(xiàn)匹伐他汀可以通過Notch1介導(dǎo)血管生成和動(dòng)脈形成。Notch信號(hào)通路可以調(diào)節(jié)血管生成下游的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和上游的肝配蛋白 B2(ephrin B2)，胚胎和產(chǎn)后體內(nèi)的血管形成主要有內(nèi)皮ephrinB2反向信號(hào)的參與。由此可見，Notch 信號(hào)通路是調(diào)控成年人血管新生的重要組成部分。

2 中醫(yī)藥治療缺血性腦卒中Notch信號(hào)通路的相關(guān)研究

2.1 Notch 信號(hào)通路作用靶點(diǎn)的研究 研究顯示，通過應(yīng)用大腦中動(dòng)脈阻塞術(shù)(MCAO)制備大鼠缺血性腦卒中模型提示，補(bǔ)腎生髓法和益氣活血法兩種中藥復(fù)方能夠抑制Notch信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路Notch1、Jagged1 mRNA或蛋白的過高表達(dá)，增強(qiáng)額頂葉或海馬CA1 區(qū)Notch3 mRNA及蛋白表達(dá)，促進(jìn)腦卒中后神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)，影響神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化[14-15]。馮珂等[16]應(yīng)用同樣實(shí)驗(yàn)提示健脾益智膠囊可能通過增加 Notch1、Jagged1蛋白及基因的表達(dá)，以促進(jìn)缺血后神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化。應(yīng)用雙側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎法制備血管性癡呆大鼠模型發(fā)現(xiàn)，首烏益智膠囊能保護(hù)神經(jīng)元，維持海馬神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能的完整，減輕腦缺血對(duì)海馬神經(jīng)元的損傷，增加Notch 信號(hào)通路中Notch1、靶基因Hes3及轉(zhuǎn)導(dǎo)-轉(zhuǎn)錄活化因子 Stat3 mRNA 的表達(dá)[17-18]。趙雅寧等[19]應(yīng)用4-血管阻斷法制備腦卒中大鼠模型，結(jié)果提示參芎化瘀膠囊可增加 Notch1、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子蛋白的表達(dá)，提高神經(jīng)細(xì)胞存活率，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能。陳聘婷等[20]證明丹龍醒腦方能通過上調(diào)腦卒中大鼠海馬區(qū) Notch1、Notch2 及 Hes1、Hes5 mRNA及蛋白表達(dá)水平，促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖。張葉華[21]研究提示，補(bǔ)陽還五湯可能通過增強(qiáng)腦缺血后伴抑郁大鼠腦內(nèi)Notch信號(hào)通路上Notch1、Jaggged1、Hes1及Hes5的表達(dá)，調(diào)節(jié)神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化。由此可見，應(yīng)用補(bǔ)腎益氣、活血化瘀等中醫(yī)藥對(duì)治療缺血性腦卒中有一定的療效，其作用機(jī)制與Notch信號(hào)通路的調(diào)控作用相關(guān)。

2.2 Notch信號(hào)通路對(duì)腦缺血性細(xì)胞凋亡的影響 目前已知調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的途徑主要有線粒體通路、死亡受體通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路3種。大量研究已證實(shí)，局灶性腦缺血后所發(fā)生的神經(jīng)元凋亡主要通過以下兩種途徑：由Bc1-2家族基因、Caspase家族基因參與的以線粒體為中心的內(nèi)源性凋亡途徑；由Fas基因參與的以死亡受體為介導(dǎo)的外源性凋亡途徑[22]。因此，對(duì)上述細(xì)胞凋亡基因的干預(yù)可作為腦缺血治療的潛在靶點(diǎn)。現(xiàn)階段針對(duì)中醫(yī)藥干預(yù)缺血性腦卒中細(xì)胞凋亡的研究主要集中在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)領(lǐng)域，臨床研究開展相對(duì)較少。閔珉[23]通過對(duì)銀杏葉提取物對(duì)全腦缺血再灌注損傷大鼠的保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，銀杏葉提取物中的有效成分EGb761可抑制全腦缺血及其再灌注損傷所導(dǎo)致的大鼠神經(jīng)元凋亡，該作用可能與增加Bcl-2/Bax比值、減少促凋亡蛋白Bax的表達(dá)和增加抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)有關(guān)，其抗凋亡作用可能與非磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)依賴的蛋白激酶B(Akt)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。

2.3 Notch信號(hào)通路對(duì)免疫調(diào)節(jié)的作用 桑芪首烏方是云南省名中醫(yī)陸家龍臨床應(yīng)用數(shù)十年的經(jīng)驗(yàn)方，方中制首烏，味苦、甘，性微溫，歸肝腎經(jīng)，善補(bǔ)肝腎，益精血；桑寄生味苦、性平，歸肝腎經(jīng)，補(bǔ)腎養(yǎng)血而可益肝腎、強(qiáng)筋骨之功效，偏走于肢體筋脈，可治療中風(fēng)病之肢體強(qiáng)急拘攣或筋骨羸弱癱軟諸癥；配伍黃芪等以益氣活血化瘀，諸藥配伍、合用，肝腎得補(bǔ)，精血得旺，髓海得充，瘀去絡(luò)通，且滋補(bǔ)而不留邪，降瀉而不傷正，補(bǔ)中有瀉，寓瀉于補(bǔ)[24]。黃芪多糖、黃芪甲苷為“桑茂首烏”片中的主要成分[25]。王振綱等[26]研究發(fā)現(xiàn)黃芪煎劑能夠影響小鼠體內(nèi)環(huán)核苷酸的水平，使小鼠血漿環(huán)磷酸腺苷(cAMP)含量增加、環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)含量減少，可能是黃芪增強(qiáng)小鼠腹腔內(nèi)巨噬細(xì)胞吞噬功能導(dǎo)致。高建峰等[27]在研究黃芪多糖對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞內(nèi)cAMP、cGMP的影響實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖可抑制cAMP產(chǎn)生，促進(jìn)cGMP生成，從而降低cAMP/cGMP比例，提示其可能是通過影響脾臟淋巴細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)而實(shí)現(xiàn)免疫調(diào)節(jié)作用。王文平等[28]研究發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷可通過NO-cGMP途徑增加動(dòng)脈組織cGMP含量，改善內(nèi)皮依賴性血管舒張作用。

3 小 結(jié)

Notch信號(hào)通路在促進(jìn)膠質(zhì)再生、維持神經(jīng)干細(xì)胞的增殖中具有重要作用，是腦生發(fā)區(qū)調(diào)節(jié)神經(jīng)干細(xì)胞分化和維持平衡的主要分子機(jī)制。Notch信號(hào)通路上相關(guān)分子相互作用，通過Notch通路上其他相關(guān)分子抑制神經(jīng)再生、抑制神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元及少突膠質(zhì)細(xì)胞分化，是一條信號(hào)抑制性轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。本研究對(duì)近年來中醫(yī)藥治療缺血性腦卒中作用機(jī)制進(jìn)行總結(jié)，得出中成藥如健脾益智膠囊、首烏益智膠囊治療缺血性腦卒中療效顯著，其作用機(jī)制與Notch信號(hào)通路對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的調(diào)控作用密切相關(guān)。在神經(jīng)系統(tǒng)中，除Notch通路外的多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與調(diào)控腦缺血后腦內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化進(jìn)程，各條信號(hào)通路通過串話的方式，實(shí)現(xiàn)信號(hào)通路之間的交流，共同發(fā)揮調(diào)控作用。

綜上所述，中醫(yī)藥治療缺血性腦卒中與 Notch 信號(hào)通路對(duì)缺血性腦神經(jīng)干細(xì)胞增殖與分化調(diào)控作用相關(guān)，從Notch信號(hào)通路等與其他信號(hào)通路進(jìn)行研究是今后中醫(yī)藥治療缺血性腦卒中的研究重點(diǎn)。