黃角顆粒預(yù)處理對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)機(jī)制

熊 岳，李鐵成

急性心肌缺血是由多種原因引起的心臟血液灌注急劇減少或中斷，導(dǎo)致心臟供氧能力下降，心肌能量代謝異常，心臟不能正常工作的病理生理狀態(tài)。當(dāng)心肌發(fā)生急性缺血缺氧時(shí)，臨床主要表現(xiàn)為胸悶、胸痛、氣短、心悸、大汗等癥狀，嚴(yán)重時(shí)甚至出現(xiàn)呼吸困難。通過(guò)治療可以使閉塞的冠狀動(dòng)脈再通，缺血的心肌重新得到灌注，瀕臨壞死的心肌得以存活，損傷及壞死范圍縮小，減輕梗死后心肌重塑。但是再灌注治療有利也有弊，盡管再灌注獲益顯著，但血流的恢復(fù)和再供氧的最初幾分鐘內(nèi)常常加重了組織損傷和炎癥反應(yīng)，這種現(xiàn)象稱為心肌缺血再灌注損傷(myocardial ischemic reperfusion injury，MIRI)。中藥治療心肌缺血再灌注損傷因不良反應(yīng)低、療效確切，作用于疾病的多個(gè)環(huán)節(jié)而倍受重視，黃角顆粒是對(duì)腦缺血再灌注損傷具有明確保護(hù)作用的藥物[1]。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取體質(zhì)量220～250 g的SD雄性大鼠30只，大鼠均由錦州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCKK(遼)2009-0004，正常飼喂3 d。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 本實(shí)驗(yàn)所用黃角顆粒由大黃和水牛角兩味中藥按1∶2比例配制(錦州市中心醫(yī)院中醫(yī)科制劑室配制)；氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)、兔抗人p-JAK2多克隆抗體、兔抗人p-STAT3單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Amresco公司；蘇木精-伊紅(HE)染色、NBT染色試劑購(gòu)自金克隆(北京)生物技術(shù)有限公司；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、血清超氧化物歧化酶(SOD)和血漿丙二醛(MDA)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；肌鈣蛋白I(cTnI)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)含量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生科技技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組 30只大鼠正常飼養(yǎng)3 d，確定進(jìn)食、活動(dòng)及精神狀態(tài)均無(wú)異常后，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組及黃角顆粒組，每組10只。假手術(shù)組和模型組每天以10 mL/kg生理鹽水灌胃1次，連續(xù)灌胃5 d；黃角顆粒組每天以10 g/kg黃角顆粒溶液灌胃1次，濃度1 g/mL，連續(xù)灌胃5 d。

1.3.2 模型制備 實(shí)驗(yàn)周期結(jié)束后的當(dāng)天晚上給予大鼠禁食不禁水，第2天稱重。將大鼠仰臥位固定于實(shí)驗(yàn)架上，腹腔注射20%烏拉坦全身浸潤(rùn)麻醉，氣管插管，連接呼吸機(jī)，調(diào)節(jié)呼吸機(jī)參數(shù)(呼吸頻率55次/min，每100 g潮氣量1.5 mL)，同時(shí)將針形電極插入大鼠四肢皮下，連接心電圖機(jī)記錄心電圖，記錄標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)心電圖。開胸，充分暴露心臟，分離左冠狀動(dòng)脈前降支，除假手術(shù)組只開胸不行冠狀動(dòng)脈結(jié)扎外，其余各組將冠狀動(dòng)脈前降支前端用無(wú)創(chuàng)傷縫合線結(jié)扎[2]。結(jié)扎30 min后，予再灌注治療60 min。結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支后見Ⅱ?qū)?lián)心電圖ST段抬高，恢復(fù)心肌灌注后ST段回落50%以上為大鼠心肌缺血再灌注模型造模成功的標(biāo)志。

1.3.3 血清cTnI、CK-MB、SOD、MDA含量檢測(cè) 大鼠再灌注時(shí)間結(jié)束后，每只大鼠右心房取血，血液冰上靜置30 min后，3 000 r/min離心10 min，將上層血清置于-80 ℃冰箱中備用。酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)血清cTnI、CK-MB、SOD、MDA含量。

1.3.4 心肌梗死面積測(cè)定 取血完成后，取下大鼠心臟，去除心房及右心室后將殘余心肌組織放入冰箱中，-20 ℃條件下冷凍1 h，待組織變硬后取出，于冠狀動(dòng)脈結(jié)扎線下沿平行于冠狀溝方向?qū)⑿募〗M織切成等厚的5片，再放入0.1% 氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)溶液中，在37 ℃水浴鍋中搖動(dòng)染色10 min。正常心肌經(jīng)NBT染色后為暗紫色，梗死部位心肌經(jīng)染色后為紅色或蒼白色，粗略估算心肌梗死面積。

1.3.5 TNF-α測(cè)定 在大鼠TNF-α單克隆抗體的酶標(biāo)孔中加TNF-α溫育。溫育后加入生物素標(biāo)記的抗TNF-α抗體，與鏈霉親和素-HRP結(jié)合形成免疫復(fù)合物，再經(jīng)過(guò)溫育和洗滌，加入底物A和B后變成藍(lán)色，而后在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。TNF-α濃度越高，顏色越深。放射免疫測(cè)量法測(cè)量TNF-α水平。

1.3.6 p-JKA2和p-STAT3檢測(cè) 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測(cè)p-JKA2和p-STAT3水平。取保存于-80 ℃的各組心肌組織100 mg，嚴(yán)格按照抗體使用說(shuō)明書的操作方法檢測(cè)蛋白水平并拍照保存結(jié)果。成像結(jié)果采用Image J 分析。

2 結(jié) 果

2.1 3組心肌梗死面積比較 假手術(shù)組均為正常心肌，模型組心肌梗死面積明顯增大，黃角顆粒組心肌梗死面積與模型組比較呈下降趨勢(shì)。詳見圖1。

圖1 3組心肌梗死面積比較

2.2 3組血清cTnI、CK-MB、SOD、MDA及TNF-α水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組血清cTnI、CK-MB、MDA、TNF-α水平明顯升高，SOD活性明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與模型組比較，黃角顆粒組血清cTnI、CK-MB、MDA、TNF-α水平明顯下降，SOD水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 3組血清cTnI、CK-MB、SOD、MDA及TNF-α水平比較 ()

2.3 3組p-JAK2和p-STAT3蛋白表達(dá)比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心肌組織中p-JAK2和p-STAT3的蛋白水平明顯增加(P<0.05)；與模型組比較，黃角顆粒組大鼠心肌組織中p-JAK2和p-STAT3的蛋白水平明顯增加(P<0.05)。詳見圖2、圖3。

模型組與假手術(shù)組比較，＊ P<0.05；黃角顆粒組與模型組比較，# P<0.05

模型組與假手術(shù)組比較，＊ P<0.05；黃角顆粒組與模型組比較，# P<0.05

3 討 論

黃角顆粒是由大黃和水牛角兩味中藥的破壁粉劑按照1∶2的比例配置而成，中藥大黃具有攻積滯、清濕熱、瀉火、涼血、祛瘀、解毒等功效；水牛角是中藥犀角的代用品，具有清熱解毒、涼血定驚的功效，二者合用有通腑解毒、涼血定驚之功效[3-4]。陳國(guó)華等[5]觀察黃角顆粒對(duì)大腦中動(dòng)脈栓塞的大鼠血漿中炎性因子的變化發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)提前給予黃角顆粒的大鼠與模型組比較，血清MDA、TNF-α、NO水平明顯降低，SOD水平有所升高，提示黃角顆?？梢杂行宄踝杂苫瑴p輕自由基對(duì)缺血大腦的進(jìn)一步損傷。潘宋斌等[3]通過(guò)建立大鼠腦缺血再灌注損傷模型，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)黃角顆粒預(yù)處理的大鼠與模型組比較，不僅可以抑制炎癥反應(yīng)，還可以使腦組織中的cleaved-Caspase 3、cleaved-Caspase 9和Bax的表達(dá)降低，說(shuō)明黃角顆粒對(duì)腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用還與減少細(xì)胞凋亡有關(guān)，而黃角顆粒在心肌缺血再灌注損傷中的應(yīng)用鮮有報(bào)道。

心肌缺血再灌注損傷是指發(fā)生急性缺血的心肌在重新恢復(fù)血液灌注后，心肌細(xì)胞損傷反而加重，損傷范圍進(jìn)一步擴(kuò)大，同時(shí)影響心臟的功能、代謝和結(jié)構(gòu)。研究發(fā)現(xiàn)，可能與氧自由基的產(chǎn)生增多、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡有關(guān)[6-8]。本研究從黃角顆粒減輕腦缺血再灌注損傷出發(fā)，進(jìn)一步證實(shí)其對(duì)心肌缺血再灌注損傷具有同樣的保護(hù)作用。cTn及心肌酶譜是判定心肌損傷及壞死最常用的生化指標(biāo)，cTn包括cTnC、cTnI和cTnT 3個(gè)亞型，其中cTnI僅存在于心肌，有100%的心肌特異性[9]。心肌酶譜是判定心肌壞死敏感性較高的特異性生化指標(biāo)，CK-MB不僅可以用于判斷心肌梗死，同時(shí)可以判定溶栓治療后梗死相關(guān)的動(dòng)脈是否再通。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，發(fā)生心肌缺血再灌注損傷后大鼠血清中的cTnI及CK-MB水平明顯升高(P<0.01)，而經(jīng)過(guò)黃角顆粒預(yù)處理后的大鼠能夠明顯降低血清cTnI及CK-MB水平(P<0.05)，可有效減少酶類物質(zhì)釋放入血，降低缺血再灌注后的心肌損傷。自由基的異常增多在心肌缺血再灌注損傷的病理過(guò)程中發(fā)揮著十分重要的作用。在正常生理狀態(tài)下，SOD等抗氧化酶作為人體內(nèi)關(guān)鍵的氧自由基清除劑，能有效清除超氧自由基，使其轉(zhuǎn)變成氧分子和水，當(dāng)心肌發(fā)生急性缺血時(shí)，SOD活性減弱，體內(nèi)氧自由基無(wú)法迅速清除，氧自由基的不斷堆積使生物膜發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，導(dǎo)致一系列脂質(zhì)自由基和降解產(chǎn)物MDA的產(chǎn)生，致使心肌細(xì)胞受損，加重細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能障礙，因此，細(xì)胞內(nèi)SOD的活性以及MDA含量能夠準(zhǔn)確反映氧自由基的含量，是判斷細(xì)胞損傷程度的標(biāo)志[10]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)黃角顆粒預(yù)處理的大鼠較模型組SOD含量明顯增加(P<0.05)，MDA含量明顯下降(P<0.05)，說(shuō)明黃角顆粒能夠有效清除氧自由基，減少炎性因子的釋放，降低炎癥反應(yīng)，減少心肌細(xì)胞損傷。TNF-α等炎性因子的大量釋放可反饋性產(chǎn)生氧自由基，導(dǎo)致氧自由基堆積，細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能受損。TNF-α由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，是參與炎癥反應(yīng)的重要因子，缺血再灌注時(shí)大量表達(dá)與分泌，并可通過(guò)自分泌方式作用于其他巨噬細(xì)胞，引起更多巨噬細(xì)胞的活化，從而放大炎癥反應(yīng)，其表達(dá)水平快速升高，進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞壞死，加重心肌組織損傷[11-12]。本研究結(jié)果顯示，發(fā)生心肌缺血再灌注損傷后大鼠血清中TNF-α水平明顯增高(P<0.01)，經(jīng)過(guò)黃角顆粒預(yù)處理后的大鼠血清TNF-α水平明顯減少(P<0.05)，減輕缺血再灌注損傷。

JAK/STAT信號(hào)通路是調(diào)控細(xì)胞免疫、增殖、分化、凋亡等多種病理生理過(guò)程的重要細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[13]。大量研究表明，JAK2/STAT3信號(hào)通路是炎癥反應(yīng)中的經(jīng)典通路，可通過(guò)對(duì)下游眾多靶點(diǎn)發(fā)揮調(diào)控作用，如糖原合成酶激酶3、核轉(zhuǎn)錄因子κB、內(nèi)皮型一氧化氮合酶以及TNF-α等[14-16]。發(fā)生急性心肌缺血后，可快速導(dǎo)致JAK2和STAT3磷酸化，從而使 JAK/STAT信號(hào)通路激活，并發(fā)揮內(nèi)源性心肌保護(hù)作用。本研究結(jié)果表明，給予黃角顆粒藥物組大鼠的p-JAK2和p-STAT3的蛋白水平表達(dá)明顯增加，說(shuō)明黃角顆粒能夠激活JAK/STAT信號(hào)通路的傳導(dǎo)，從而對(duì)缺血后的心肌起到一定保護(hù)作用。