中醫(yī)藥防治阿爾茨海默病研究新的切入點(diǎn)
——外泌體

陳慧澤，孟勝喜

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一種起病隱匿、進(jìn)行性發(fā)展的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。伴隨著各國人口老齡化的加劇，AD的患病率也在逐年攀升，到2050年每33 s就有可能出現(xiàn)1例新的AD病人，但目前尚無針對AD病因的治療藥物[1]。中醫(yī)藥具有多層次、多靶點(diǎn)、多途徑、多環(huán)節(jié)作用和副作用小的特點(diǎn)，在防治AD方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢[2]。不容樂觀的是，目前對AD的病因病機(jī)、中醫(yī)證候及治療等方面的研究仍局限于“還原論”的思維模式，制約了AD的中醫(yī)藥現(xiàn)代研究發(fā)展。

外泌體(exosomes)最早于1981年由Trams等在透射電鏡下發(fā)現(xiàn)，并于1987年被 Johnstone等命名[3]。外泌體的直徑在40～100 nm，主要由脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和遺傳物質(zhì)組成，蛋白質(zhì)和遺傳物質(zhì)是外泌體發(fā)揮生物學(xué)功能的有效成分[4]。幾乎所有細(xì)胞都可以分泌外泌體，外泌體在體液中分布非常廣泛，從支氣管肺泡灌洗液、血液、尿液、腦脊液、血清和母乳中均發(fā)現(xiàn)有外泌體，外泌體的來源不同，其表面分子也迥然不同[5-6]。外泌體在細(xì)胞間的信息傳遞中起重要作用，也參與體內(nèi)的生理及病理過程[7]。

近年來，外泌體已成為AD發(fā)病機(jī)制、診斷及治療的研究熱點(diǎn)，也成為AD潛在的病理介質(zhì)、標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)[8-9]。外泌體的出現(xiàn)為中醫(yī)藥防治AD提供了良好的切入點(diǎn)，也將會成為AD中醫(yī)藥研究的重要方向。

1 外泌體用于AD的診斷

在臨床癥狀出現(xiàn)前AD的潛伏期較長，目前的治療措施對AD病情的延緩也難以令人滿意。因此，AD的早期診斷及預(yù)防尤為重要，發(fā)現(xiàn)和篩選早期診斷的AD標(biāo)志物也更為關(guān)鍵。與中醫(yī)“治未病”的思想一致。

中醫(yī)診治病人一般通過四診(望、聞、問、切)來進(jìn)行辨病、辨證?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)常常采用視、觸、叩、聽等診斷方法，生化檢測，影像學(xué)檢查以及蛋白組學(xué)、基因組學(xué)、代謝組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、基因測序等微觀途徑來分析生命的本質(zhì)規(guī)律。不管在生理還是病理狀態(tài)下，細(xì)胞都可以分泌出相應(yīng)的外泌體，而后者包含的物質(zhì)則可以代表細(xì)胞或系統(tǒng)一定的生理病理狀態(tài)。把外泌體的內(nèi)容物當(dāng)作一種生物標(biāo)志物來診斷疾病，與中醫(yī)辨證論治中微觀辨證的理念相吻合。一項(xiàng)進(jìn)行10年的有關(guān)AD早期診斷的病例對照研究提示，定量檢測外泌體中磷酸化的Tau蛋白和β淀粉樣蛋白(amyliod β-protein，Aβ)有可能在臨床癥狀出現(xiàn)前提前10年診斷AD[10]。作為細(xì)胞間通訊的新興介體，外泌體通過3種方式(自分泌、旁分泌和內(nèi)分泌)傳遞生物信息，轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸內(nèi)容物至靶細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理活動。外泌體研究為微觀分子學(xué)，但其宏觀、整體表達(dá)形式的特點(diǎn)非常類似于中醫(yī)辨證的整體性、變化性。在機(jī)體內(nèi)，細(xì)胞不同，其包含的物質(zhì)也不同，其分泌的外泌體內(nèi)容物、細(xì)胞在不同生理病理狀態(tài)下也有差異。外泌體具有特異的生物信息，可以介導(dǎo)疾病的進(jìn)程，因此，是潛在的生物標(biāo)志物[11]。對外泌體中特異的分子標(biāo)志物進(jìn)行檢測，將健康與疾病狀態(tài)下外泌體中物質(zhì)的差異進(jìn)行比較，可以很好地應(yīng)用于疾病的診斷[12]。血液與體液中的外泌體容易分離，也有很好的穩(wěn)定性，因此常作為檢測疾病的標(biāo)志物。

miRNA是外泌體的重要組成部分，在調(diào)節(jié)靶細(xì)胞中起著非常重要的作用。外泌體中的miRNA比游離miRNA更適合作為標(biāo)志物。不同細(xì)胞源性外泌體可以帶有具有自身特性的miRNA[13]。在AD的病理和生理過程中，多種細(xì)胞源性外泌體可以通過miRNA進(jìn)行參與[14]。

AD病人體內(nèi)的外泌體中不同種類RNA的改變也使其成為AD新型診斷標(biāo)志物。Lugli等[15]比較AD病人與健康個(gè)體血漿外泌體中miRNA，發(fā)現(xiàn)這兩者具有差異，miRNA-193b是淀粉樣前質(zhì)蛋白(APP)基因的調(diào)節(jié)因子，腦脊液中提取的外泌體所含miRNA-193b的數(shù)量改變，使AD的早期診斷成為可能[16]。

外泌體作為介質(zhì)，促進(jìn)細(xì)胞間通訊，并通過將其內(nèi)容物傳遞給靶細(xì)胞來重新編程受體細(xì)胞，目前傳統(tǒng)提取基因組需要骨髓活檢，但是人們可以輕松從外周血中獲得外泌體，因而外泌體可以作為無創(chuàng)生物標(biāo)志物的優(yōu)先候選物。

2 外泌體用于AD的中醫(yī)證候規(guī)范化

中醫(yī)藥治療AD具有一定優(yōu)勢和特點(diǎn)，但也存在一些不足，如中醫(yī)藥辨證及療效評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)尚不統(tǒng)一，辨證分型也比較復(fù)雜[17]。中醫(yī)證候是辨證論治的基礎(chǔ)，也是中醫(yī)理論體系的重要內(nèi)容，研究中醫(yī)證候是中醫(yī)藥現(xiàn)代化的關(guān)鍵部分。中醫(yī)證候是一個(gè)動態(tài)變化的過程，具有多變性、復(fù)雜性、模糊性、隱匿性等特點(diǎn)。因此，如何將中醫(yī)證候規(guī)范化勢必將成為中醫(yī)藥現(xiàn)代化發(fā)展的方向。

外泌體具有穩(wěn)定性、廣泛性、特異性、靶向性、運(yùn)輸性、通訊性、透膜性、免疫原性等特點(diǎn)，與中醫(yī)證候的恒動觀、整體觀、辨證論治思維極度相似，又能巧妙地應(yīng)對AD中醫(yī)證候的多變性、復(fù)雜性、模糊性、隱匿性等特點(diǎn)，對揭示AD的證候本質(zhì)有巨大優(yōu)勢[18-22]。

在AD的中醫(yī)證候研究中引入外泌體，將拓展和加深對AD中醫(yī)證候的認(rèn)識，有可能揭示中醫(yī)辨證論治AD的本質(zhì)。在中醫(yī)辨證的基礎(chǔ)上，獲得組織或血清標(biāo)本，觀察和分析其與對照基因表達(dá)譜的不同，能夠從整體上分析外泌體在不同證型中的表現(xiàn)，從而歸納總結(jié)出AD中醫(yī)證型的本質(zhì)規(guī)律。中醫(yī)藥對AD的作用主要在于異?；虻谋磉_(dá)調(diào)控，因此，外泌體有可能成為直接或間接作用的靶標(biāo)。

外泌體作為臟腑相關(guān)的物質(zhì)基礎(chǔ)，可以溝通兩者間的信息[23]。將外泌體引入中醫(yī)證候機(jī)制的研究中，以微觀辨證的思維作為橋梁，分析外泌體在中醫(yī)證候發(fā)生過程中的變化，將對中醫(yī)證候微觀辨證的現(xiàn)代生物機(jī)制研究非常有益。

3 外泌體用于AD的治療

中醫(yī)藥在治療AD方面具有獨(dú)特的作用和優(yōu)勢。傳統(tǒng)中醫(yī)藥雖有完整的理論體系和良好的臨床療效，但其制劑多局限于湯劑、丸劑及散劑等，缺點(diǎn)是有效成分溶解度低、生物利用度不高、療程長、效果較慢等[24]。因此，尋找科學(xué)、有效、現(xiàn)代化的給藥方式，將是今后中醫(yī)藥治療AD的重要途徑。外泌體作為一種天然、新型藥物傳遞系統(tǒng)的載體，在AD的診治及預(yù)后中均可以發(fā)揮重要的作用。

外泌體作為藥物載體具有免疫原性低、固有穩(wěn)定性好、傳遞效率高、能透過血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)等優(yōu)點(diǎn)。因此，外泌體作為藥物遞送載體具有獨(dú)特的天然優(yōu)勢。近年來，有關(guān)外泌體遞送藥物的研究逐漸增多，外泌體的來源不同，其靶向性也不同，一些小分子的化學(xué)藥物及基因藥物等已經(jīng)被成功載入外泌體，在AD的治療中將發(fā)揮出巨大的潛能[25]。Alvarez-erviti等[26]首次利用骨髓源樹突狀細(xì)胞作為外泌體的來源運(yùn)送siRNA，透過血腦屏障達(dá)到中樞神經(jīng)系統(tǒng)，從而證實(shí)了外泌體作為藥物載體的可行性。在給小鼠喂食藥用植物金銀花后，在小鼠的血清和尿液中可以檢測到金銀花miRNA[27]。在給小鼠喂食中藥湯劑，然后全面分析進(jìn)入小鼠組織中的中藥miRNA，可以在其肺組織中發(fā)現(xiàn)大量來自中藥的miRNA，經(jīng)過對來自NCBI GEO數(shù)據(jù)庫的健康人體組織miRNAseq原始數(shù)據(jù)樣本和半枝蓮、柴胡、穿心蓮、紫花地丁、黃芩等10種中藥的miRNA數(shù)據(jù)庫miRBase進(jìn)行篩選鑒定，證實(shí)“中藥miRNA能夠跨界轉(zhuǎn)運(yùn)”[28]。

有學(xué)者用巨噬細(xì)胞外泌體攜帶姜黃素來改善AD癥狀也取得了一定成功，較好地改善了AD小鼠的認(rèn)知和學(xué)習(xí)能力[29]。Qi等[30]利用血漿外泌體攜帶槲皮素(Exo-Que)提高了槲皮素(Que)的腦靶向性和生物利用度，與游離Que相比，Exo-Que通過抑制細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶5(CDK5)介導(dǎo)的Tau蛋白磷酸化和減少不溶性神經(jīng)原纖維纏結(jié)(NFTs)的形成，較好地緩解了AD的癥狀，提示其具有治療AD的作用。

另外，腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞衍生的外泌體可以通過上調(diào)AD小鼠模型中P-糖蛋白(P-gp)，增強(qiáng)清除Aβ，從而有效改善其認(rèn)知功能障礙[31]。外泌體生物標(biāo)志物對神經(jīng)退行性疾病的臨床前診斷和臨床試驗(yàn)中治療反應(yīng)的評估也發(fā)揮了重要作用[32]。

本課題組選擇2018年1月—2019年1月上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院收治的52例AD病人作為研究對象，采集其空腹靜脈血制備血清標(biāo)本。以Exo Quick試劑盒提取外泌體，并以鈾鉛雙染色法處理后的組織塊置于電鏡下鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，52例AD病人血清外泌體的直徑為(96.25±22.18)nm。因此，驗(yàn)證了AD病人的血清中的確含有外泌體。

本課題組遵循中醫(yī)理論，經(jīng)過長期臨床探索，總結(jié)出治療AD療效明確的中藥復(fù)方恒清Ⅱ號方(專利號：ZL201910371018.5)[33-35]。前期通過動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與3月齡C57BL/6J小鼠(即對照組)比較，同月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD模型小鼠(即模型組)不僅海馬組織中的 miRNA-29c水平明顯下降，而且模型組小鼠的腦脊液和外周血外泌體中的miRNA-29c水平也明顯下降(P<0.01)；經(jīng)過恒清Ⅱ號方干預(yù)8周的AD模型小鼠(即治療組)海馬組織中的 miRNA-29c水平高于模型組小鼠，治療組小鼠的腦脊液和外周血外泌體中的miRNA-29c水平也高于模型組小鼠，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。本課題組的研究表明外泌體內(nèi)miRNA-29c將有可能成為AD診斷的生物標(biāo)志物。中藥復(fù)方恒清Ⅱ號方可能通過上調(diào)AD小鼠海馬組織中的miRNA-29c水平及其腦脊液和外周血外泌體中的miRNA-29c水平，從而改善APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因AD小鼠的認(rèn)知功能。

4 小 結(jié)

外泌體共有的細(xì)胞蛋白質(zhì)決定了外泌體的標(biāo)志性存在，而其不同來源特有的成分又決定了外泌體功能的各異性。對來源不同的外泌體攜帶的內(nèi)容物進(jìn)行研究，篩選出特異的分子標(biāo)志物，將為AD的診斷與治療提供新的方法。隨著精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)、納米技術(shù)、組學(xué)技術(shù)、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)等的飛速發(fā)展，中藥自身具有多途徑、多靶點(diǎn)等作用特點(diǎn)，對中藥有效成分的分離提純后將藥物通過適宜的方法導(dǎo)入外泌體，有望實(shí)現(xiàn)中藥的靶向用藥及對靶器官的精準(zhǔn)干預(yù)[36-39]。

中醫(yī)藥防治AD的現(xiàn)代研究極需特異性的指標(biāo)評價(jià)。不管是中藥單味藥還是中藥復(fù)方，均為多靶點(diǎn)、多途徑參與AD治療。外泌體源性miRNA具有高度特異性，外泌體作為載體，攜帶miRNA及蛋白質(zhì)，參與細(xì)胞通訊。因此，通過外泌體途徑研究AD病理生理過程、中醫(yī)辨證內(nèi)涵、療效評價(jià)機(jī)制等將具有重要的醫(yī)學(xué)意義。且中醫(yī)理論的物質(zhì)基礎(chǔ)與外泌體之間存在關(guān)聯(lián)性，中醫(yī)理論能為外泌體研究AD提供明確的指向性[40]。因此，外泌體不僅為今后研究AD發(fā)生發(fā)展規(guī)律、證候規(guī)范化、中藥載體、治療方法及藥物等提供新的切入點(diǎn)，而且也為中醫(yī)藥現(xiàn)代化發(fā)展提供了新思維和新思路。