TRPC3與心血管疾病的研究進展

胡國慶，李學文

典型瞬時受體電位通道(TRPCs)是一系列具有不同Ca2+選擇性的非選擇性陽離子通道，支持鈣離子在許多器官中的滲透，包括心臟、大腦和腎臟。本研究將對其與心血管病的關(guān)系及治療進展進行綜述。

1 TRPC3的分子結(jié)構(gòu)

TRPCs由TRPC1、TRPC2、TRPC3、TRPC4、TRPC5、TRPC6和TRPC7共7個哺乳動物型成員組成，基于序列相似性和功能分析，被進一步分為3組：TRPC1、TRPC4、TRPC5由Gαq偶聯(lián)受體和受體酪氨酸激酶激活，而TRPC3、TRPC6、TRPC7由二?；视?DAG)激活，TRPC2是一個假基因[1]。在人體組織中，TRPCs通常為G蛋白偶聯(lián)受體下游的信號轉(zhuǎn)導通路服務，與所有其他TRPC通道一樣，TRPC3具有6個跨膜段，氮(N)和碳(C)末端位于細胞質(zhì)中[2]。Fan等[3]用單粒子冷凍電子顯微鏡觀察了處于脂質(zhì)占據(jù)的非活性狀態(tài)的全長人TRPC3(hTRPC3)的結(jié)構(gòu)，TRPC3組裝成四聚體復合體，其中細胞質(zhì)末端相互作用形成一個倒鐘形的細胞質(zhì)層。四聚體組裝構(gòu)成了一個陽離子滲透路徑，即帶負電荷殘基的選擇性過濾器(848aa變體中的E630；UniProt中的異構(gòu)體3/Q13507-3)，從而確定孔域內(nèi)Ca2+的運輸，連接跨膜域5和6(TM5和TM6)。多個細胞質(zhì)調(diào)節(jié)域已被鑒定，包括C-端高度保守的富含脯氨酸和鈣調(diào)蛋白/IP3受體結(jié)合(CIRB)區(qū)域，使該通道能夠發(fā)揮多模式信號功能[4]。最初，該通道被發(fā)現(xiàn)與鈣池操縱的Ca2+內(nèi)流(store-operated Ca2+entry，SOCE)有關(guān)。Lichtenegger等[5]采用由結(jié)構(gòu)導向誘變和脂質(zhì)光藥理學組成的方法證明，TRPC3的脂質(zhì)信號傳導涉及1個位于通道孔域的側(cè)開孔，通過容納脂質(zhì)介質(zhì)來控制門控，與DAG敏感的親屬TRPC6和TRPC7一樣，TRPC3與一系列病理和疾病相關(guān)，包括腫瘤、神經(jīng)退行性疾病、心肌肥大、高血壓、心律失常等。

2 TRPC3的功能

2.1 TRPC3與心肌肥大 心肌肥大是導致心源性死亡的最重要的病理基礎，研究表明，TRPCs通過介導離子通道活性和下游信號在心肌肥大的病理過程中發(fā)揮重要作用。Nakayama等[6-7]運用基因測序、基因敲除、蛋白質(zhì)印跡等方法證明，在TRPC3轉(zhuǎn)基因小鼠的生長過程中，隨著小鼠年齡的增長，其左心室明顯擴張，并且通過測量發(fā)現(xiàn)其射血分數(shù)降低。當TRPC3壓力過載或TRPC3基因過度表達可引起心肌病理性肥大，從而得出心臟中TRPC3的過度表達通常會導致心肌病。Wu等[8]研究證明，TRPC3通道是病理性心肌肥大的必要介質(zhì)，蛋白激酶G(PKG)是一氧化氮(NO)或心鈉素環(huán)磷酸鳥苷(cGMP)信號通路的下游靶點，每條通路都對心肌肥大負性調(diào)節(jié)；在TRPC6的T11和S263、28、T70和S322位點上，TRPC3可被PKG直接磷酸化，TRPC3是心臟微域信號的關(guān)鍵調(diào)節(jié)者，通過鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶和活化T細胞的核因子(NFAT)等效應器來協(xié)調(diào)信號傳導，從而控制病理性肥大，通過進一步實驗證實，運用Pyr3可以選擇性抑制與壓力超負荷相關(guān)的病理性心肌肥大。Ma等[9]通過高鹽處理增加了心肌細胞中線粒體TRPC3的表達，并伴隨著線粒體鈣攝取的增加和活性氧(reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生的增多，抑制TRPC3會顯著減少高鹽誘導的ROS產(chǎn)生，通過刺激氧化磷酸化促進ATP產(chǎn)生，并增加心肌細胞線粒體中的酶活性；此外，TRPC3缺乏可以抑制體內(nèi)高鹽誘導的心肌肥厚，他們認為，長期高鹽飲食導致了心臟線粒體TRPC3的表達，增加了心臟肥大標志物心房鈉尿肽(ANP)、腦鈉尿肽(BNP)和b-肌球蛋白重鏈(b-MHC)的表達，并降低了ATP的產(chǎn)生和線粒體復合體Ⅰ和Ⅱ酶活性，TRPC3缺乏通過改善TRPC3介導的心肌線粒體功能障礙對抗高鹽飲食介導的心肌肥厚，因此，TRPC3可能是預防高鹽誘導的心臟損傷的新靶點。Bandleon等[10]發(fā)現(xiàn)FK506結(jié)合蛋白52(FKBP52)是TRPC3在心臟中的一種新的相互作用蛋白，F(xiàn)KBP52通過TRPC3碳末端的一個尚未描述的結(jié)合位點與TRPC3結(jié)合，并以肽基-脯氨酰順/反異構(gòu)酶依賴的方式調(diào)節(jié)TRPC3依賴的Ca2+信號，二者呈負相關(guān)，并認為二者的相互作用對于限制慢性心肌肥大刺激期間TRPC3依賴的信號傳導起著重要作用。

2.2 TRPC3與高血壓 血管平滑肌細胞(vascular smooth musclecells，VSMCs)通過調(diào)節(jié)血管直徑和血流來充當血壓的關(guān)鍵因素。離子通道啟動并調(diào)節(jié)收縮和VSMC張力，調(diào)節(jié)細胞內(nèi)Ca2+水平。L型電壓依賴性鈣通道(LTCC)是血管平滑肌細胞Ca2+內(nèi)流的主要途徑，而非選擇性陽離子通道也被認為是調(diào)節(jié)血管張力的重要角色，它調(diào)節(jié)膜電位或提供獨立于LTCC激活的Ca2+進入途徑。TRPC家族屬于血管平滑肌細胞表達的非選擇性陽離子通道家族，被認為是受體-操作通道(ROC)和拉伸-操作通道(SOCs)的分子組成部分其將DAG信號級聯(lián)途徑與LTCC激活聯(lián)系起來[11]。Liu等[12]通過免疫組化、基因敲除、蛋白質(zhì)印跡的方法研究表明，高血壓病人以及壓力超負荷大鼠和自發(fā)性高血壓大鼠模型中TRPC3水平升高。在自發(fā)性高血壓大鼠模型中，DAG和血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘導的Ca2+內(nèi)流在其病理狀態(tài)下升高。進一步研究表明，通過siRNA下調(diào)TRPC3，或應用高選擇性TRPC3抑制劑吡唑-3(Pyr3)，減少了DAG和AngⅡ誘導的SHR單核細胞Ca2+內(nèi)流[12-13]。TRPCs改變細胞內(nèi)Ca2+的分子機制被認為是AngⅡ和血管內(nèi)皮素(PE)刺激GPCRs，通過PIP2釋放DAG和IP3，隨后激活PLC。DAG刺激ROCs，包括TRPC3和TRPC6，導致細胞外Ca2+內(nèi)流。IP3通過SR/ER中的Ca2+釋放，隨后激活的TRPCs激活SOCE以應對細胞內(nèi)Ca2+儲存的耗竭。持續(xù)TRPC介導的Ca2+進入從而直接激活鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶NFAT通路，進而激活包括TRPC1、TRPC3和TRPC6在內(nèi)的基因表達[14]。以上研究均表明TRPC3與高血壓的發(fā)生呈正相關(guān)。

2.3 TRPC3與心律失常 心律失常是一組心臟電活動不規(guī)律的情況，有超過100次/min的快速型心律失常、也有低于60次/min的緩慢型心律失常。TRPC家族廣泛存在于心房和心室，在心臟電活動中調(diào)節(jié)心臟起搏、傳導、心室活動和收縮力。Harada等[15]發(fā)現(xiàn)心房顫動(AF)時通過激活活化T細胞核因子介導的microRNA-26的下調(diào)，從而增加了TRPC3的表達，此外，AF誘導了成纖維細胞增殖和分化過程中對于TRPC3的依賴，可能是通過介導Ca2+進入來刺激細胞外信號調(diào)節(jié)激酶信號。TRPC3阻斷劑可在持續(xù)AF的狗模型中阻止AF基質(zhì)的形成。Duzen等[16]通過對比47例非瓣膜病心房顫動病人和47例性別、年齡相匹配的竇性心律對照組的mRNA，發(fā)現(xiàn)對照組中的TRP通道表達水平較低，證明TRP通道的基因表達升高與非瓣膜病心房顫動的發(fā)病機制有關(guān)。

2.4 TRPC3與心力衰竭 心力衰竭是指由于心臟的收縮功能和(或)舒張功能發(fā)生障礙，不能將靜脈回心血量充分排出心臟，導致靜脈系統(tǒng)血液淤積，動脈系統(tǒng)血液灌注不足，從而引起心臟循環(huán)障礙的癥候群。目前認為，由于細胞外基質(zhì)蛋白沉積引起的間質(zhì)纖維化導致的心臟僵硬，是射血分數(shù)保留的心力衰竭的主要臨床結(jié)果。ROS是由線粒體呼吸鏈的缺陷和還原型輔酶Ⅱ(NADPH)氧化酶(Nox)的激活而產(chǎn)生的。在大多數(shù)心臟病理生理條件下，ROS的產(chǎn)生會加劇心臟重構(gòu)和功能障礙。TRPC3介導Ca2+內(nèi)流激活了蛋白激酶C(PKC)，PKC磷酸化p47phox(存在于胞質(zhì)中的亞基，主要調(diào)控Nox2復合物的形成)，引起Nox2酶的激活。TRPC3不僅可調(diào)控Ca2+通道，還有蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑的作用，TRPC3可阻止Nox2的蛋白酶體穩(wěn)定性下降，二者的相互正調(diào)控使應激心臟的ROS生成異常增加，導致心肌細胞和心肌成纖維細胞RhoA途徑激活，最終導致心臟纖維化[17]。第二信使環(huán)磷酸腺苷(cAMP)在調(diào)節(jié)心肌細胞存活和死亡中起關(guān)鍵作用。cAMP可以通過刺激與不同膜相關(guān)腺苷酸環(huán)化酶偶聯(lián)的各種G蛋白偶聯(lián)受體產(chǎn)生，碳酸氫鹽直接刺激可溶性腺苷酸亦可產(chǎn)生。不同的環(huán)核苷酸磷酸二酯酶可以催化環(huán)磷酸腺苷的降解。不同來源的cAMP在心肌細胞中具有不同或相反的功能。例如，β1腎上腺素能受體(β1-AR)衍生的環(huán)磷酸腺苷促進心肌細胞死亡，而腺苷2型受體(A2R)衍生的環(huán)磷酸腺苷則相反。PDE是一個酶的超家族，PDE1代表人類心肌中最高的PDE活性，PDE1C在病理性心臟重塑中如心肌肥大、心肌纖維化等起致病作用[18]。Zhang等[19]證明TRPC3來源的Ca2+激活PDE1C對心臟保護性A2R來源的cAMP信號產(chǎn)生負調(diào)節(jié)作用。G蛋白偶聯(lián)受體信號由b-arrestins負調(diào)節(jié)，b-arrestins是銜接分子，也激活不同的細胞內(nèi)信號通路。Liu等[20]揭示了TRV120027，一種血管緊張素Ⅱ受體1型(AT1R)的b-arrestin-1偏向激動劑，通過與瞬時受體電位陽離子通道亞家族C3(TRPC3)偶聯(lián)刺激急性兒茶酚胺分泌，證明長期抑制腎上腺b-arrestin-1功能將有助于某些病理條件下心力衰竭的治療。以上表明，TRPC3在心臟重構(gòu)的發(fā)展中起著關(guān)鍵作用。

3 TRPC3與心血管疾病的治療

早期識別和表述TRPC3通道功能的試驗是基于非特異性通道阻滯劑，常用的受體介導的Ca2+內(nèi)流的非選擇性抑制劑維拉帕米或SKF96365，由于其靶位范圍廣，這些阻斷劑僅有限地用于天然組織中TRPC3的研究，不適用于治療應用的開發(fā)。Kiyonaka等[21]合成并表征了一系列吡唑衍生物，形成一種新的吡唑3(Pyr 3)TRPC通道抑制劑，對TRPC3有明顯的靶向性，此后被廣泛應用于各項實驗。Schleifer等[22]鑒定了其他吡唑衍生物，包括選擇性TRPC3阻斷劑(Pyr10)，而其另一項篩選研究確定了兩種有效且選擇性的TRPC通道噻唑抑制劑，這些化合物被命名為GSK2332255B(GSK255B)和GSK2833503A(GSK503A)，即苯胺基噻唑。Seo等[23]在心臟肥大和重塑的動物模型中對GSK255B和GSK503A進行了測試，這兩種新開發(fā)的選擇性TRPC3/6雙阻滯劑對AngⅡ、內(nèi)皮素-1和PE激活的心肌細胞肥大信號具有明顯的抑制作用，在HEK293T細胞以及在新生兒和成人心肌細胞中這種現(xiàn)象呈劑量依賴性。其他的TRPC3阻斷劑，如去甲孕酯、HC-C3A等，選擇性尚不明確[24]。目前，對TRPC3合成激活劑的相關(guān)研究有限，因大多數(shù)TRPC3相關(guān)病理與表型的表達增強或功能增強有關(guān)。因此，藥物開發(fā)活動主要集中在通道的選擇性拮抗劑或阻斷劑上?，F(xiàn)出現(xiàn)一種高空間精度干預的非常規(guī)方法稱為光藥理學，偶氮苯是一種構(gòu)象柔性的光敏結(jié)構(gòu)，其位于DAG的脂族側(cè)鏈中，結(jié)構(gòu)和活性由光可逆地控制，這使其成功應用于研究TRPC細胞特異性功能以及配體-蛋白質(zhì)相互作用和通道激活-失活動力學的工具中，光藥理學的發(fā)展能夠為TRPC3的研究提供新手段，可能為臨床心血管疾病的治療提供新思路、新方法[25-26]。

4 小 結(jié)

由TRPC3通道介導的心臟重塑的病理機制仍有待充分探索，特別是關(guān)于SOCE和ROCE過程。由于一系列下游TRPC3信號機制，Ca2+超載可引起許多病理后果。對TRPC3結(jié)構(gòu)認識的加深會進一步提高對心血管疾病病理過程的認識，光藥理學的發(fā)展則為未來的臨床應用提供更多可能。眾多研究表明，TRPC3可能是一個理想的治療心血管疾病的靶點，對TRPC3信號通路的進一步探索以及對其如何調(diào)節(jié)促纖維化因子的激活和產(chǎn)生的進一步理解，將有助于心血管疾病靶向治療的發(fā)展。