細胞外囊泡(EVs)在ARDS中作用機制的研究進展

張紅偉，王 帥，張春媚，趙忠?guī)r

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 重癥醫(yī)學(xué)科，吉林 長春130033)

ARDS(急性呼吸窘迫綜合征)是以肺順應(yīng)性降低、呼吸衰竭、頑固性低氧血癥為特點的一類異質(zhì)性疾病的統(tǒng)稱，在重癥監(jiān)護室總發(fā)病率占10%，病死率高達35%-40%，彌漫性肺泡損傷是其病理特征性改變，表現(xiàn)為肺泡Ⅰ型上皮細胞破壞，Ⅱ型上皮細胞增殖、內(nèi)皮細胞壞死，而后進展為肺泡結(jié)構(gòu)功能改變，不可逆性肺纖維化。在炎癥反應(yīng)中，近些年研究發(fā)現(xiàn)致病微生物和免疫細胞分泌的細胞外囊泡在引發(fā)和調(diào)節(jié)ARDS病理反應(yīng)中具有重要作用。

1 細胞外囊泡分類和功能

細胞外囊泡樣分子最初是由Chargaff和West于1946年首次介紹出來，EVs在正常血漿中被認為是促凝血功能的血小板衍生顆粒[1]，1983年P(guān)hilip Stahl和Clifford Harding通過脈沖追逐(pulse-chase)和電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)多泡體與細胞膜融合釋放出小的膜泡,而后Johnston將這種囊泡定義為外泌體[2]。隨后的眾多研究者發(fā)現(xiàn)所有細胞都可以釋放EVs，由于研究方法、實驗標準、生物標本來源等不統(tǒng)一，研究者在對各囊泡的命名上也不一致，例如文中提到的微粒(microparticle)后來認為是屬于微泡范疇，ISEV先后在2014年和2018年發(fā)表關(guān)于EVs的最低標準要求，將該類囊泡樣物質(zhì)用EVs概念進行統(tǒng)稱。EVs大致可分為3類：外泌體(exosomes)40-200 nm、微泡(microvesicles)200-2 000 nm和凋亡小體(apoptotic bodies)500-2 000 nm；外泌體是內(nèi)吞體向內(nèi)凹陷形成多泡體(MVB)，后多泡體與細胞膜融合釋放出外泌體；微泡起源于細胞膜，是通過細胞膜向外出芽生成；凋亡小體是在細胞凋亡過程中發(fā)生細胞膜破裂時釋放。已證實的ESCRT(內(nèi)吞體分選轉(zhuǎn)運復(fù)合體)系統(tǒng)在多泡體的形成以及釋放外泌體中起著重要作用[3]。EVs與其母細胞具有相同表面標記蛋白，比如肺泡上皮細胞所衍生出的EVs具有表面活性蛋白(caveolin-1)，外泌體中富含上皮黏蛋白，黑色素瘤細胞微泡富含囊泡相關(guān)膜蛋白3(VAMP3)，外泌體富含轉(zhuǎn)鐵蛋白受體，但這種轉(zhuǎn)鐵蛋白受體在微泡中幾乎不存在[4]。但是目前來說不存在能識別EVs的唯一特定標記物，CD9、CD63、CD81和CD82等均可在外泌體和微泡中表達。

不同于細胞間直接接觸與細胞分泌的信號分子傳遞信息，EVs是細胞間通訊的第3種方式，是作為功能性細胞膜和胞質(zhì)蛋白、脂質(zhì)和核酸的細胞間轉(zhuǎn)移載體，它們可以通過囊泡表面膜蛋白與受體膜蛋白直接作用或者和受體細胞粘附融合后釋放內(nèi)部包裹的核酸、蛋白質(zhì)或脂類物質(zhì)等調(diào)控受體細胞的細胞功能[5]。在ARDS動物模型中發(fā)現(xiàn)EVs在肺內(nèi)免疫應(yīng)答和炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中處于重要地位[6]。EVs中的RNA主要包含了tRNA、rRNA、mRNA、miRNA、長鏈RNA等，這些均含有大量的3′UTR mRNA片段，并且有多個microRNA(miRNA)結(jié)合位點，提示EVs作為miRNA循環(huán)的載體調(diào)節(jié)受體細胞的基因轉(zhuǎn)錄和表達，這也是miRNA的研究在EVs中成為重點的原因[7]；相比對于RNA的大量研究，DNA成分在EVs中研究較少，最近有研究者對EVs中的dsDNA和組蛋白存在提出質(zhì)疑[8]；EVs中的脂類物質(zhì)主要包含磷脂酰絲氨酸、膽固醇、脂肪酸、神經(jīng)鞘磷脂、神經(jīng)酰胺等，是組成囊泡雙層脂質(zhì)膜的成分，不同類型的EVs其脂質(zhì)結(jié)構(gòu)也不相同。EVs中的蛋白質(zhì)成分包括了表面抗原(MHCI、MHCII)、粘附因子(比如整合素、乳凝集素、ICAM)、多種趨化因子和炎性細胞因子等(如IL-1β、IL-1α、IL-6、IL-8、IL-18、IL-32、TNF、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5和CCL20)，這些蛋白質(zhì)在細胞的免疫調(diào)節(jié)中有著重要作用。除此之外，針對EVs對蛋白質(zhì)和基因在細胞外環(huán)境中可以起到保護作用的特點，有研究認為可將其作為一種潛在生物標記物的來源，以及作為靶向藥或基因的載體，在治療上可能具有廣闊前景[4]。

2 病原微生物分泌的EVs在ARDS中的作用

微生物感染和ARDS密切相關(guān)，細菌EVs是在上世紀60年代的關(guān)于大腸桿菌的報道中首次提出的，1990年以后至今對細菌EVs的研究不斷增加，主要以研究革蘭陰性菌占多數(shù)，其產(chǎn)生EVs的途徑主要是通過擠壓的方式(pinching off)出膜，因為相比較革蘭陰性菌，革蘭陽性菌的細胞膜外有一層厚的肽聚糖細胞壁，囊泡如何出膜機制尚不清楚(真菌和分枝桿菌同樣也不清楚)，通常將革蘭陰性菌的EVs稱OMVs(Outer Membrane Vesicles)，可以攜帶毒力因子、DNA、RNA、免疫調(diào)節(jié)因子等。細菌EVs與宿主細胞作用有以下3種途徑：直接激活宿主受體、傳遞細菌EVs內(nèi)容物和完全融入宿主細胞細胞質(zhì)內(nèi)。OMVs通過病原體相關(guān)分子模式(PAMPs)誘導(dǎo)炎癥免疫應(yīng)答，PAMPs中的LPS、肽聚糖、鞭毛蛋白、孔蛋白以及脂蛋白與宿主細胞的TLR作用后，通過MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)促進炎性因子分泌[9]。最近的研究也證實了細菌的EVs具有可以將其內(nèi)容物轉(zhuǎn)移至宿主從而調(diào)節(jié)宿主先天免疫的能力。An等人發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌EVs中包含的α-溶血素是導(dǎo)致肺炎的重要毒力因子，而磷霉素可以通過降低MAPK(主要是ERK和p38途徑)磷酸化和抑制NLRP3炎癥相關(guān)蛋白表達來減輕肺部感染[10]。Schlatter等人報道金黃色葡萄球菌在PSM(酚溶性調(diào)節(jié)蛋白)作用下通過增加膜流動性促進金葡菌膜釋放含有LPS的EVs，囊泡破裂后LPS會激活TLR2介導(dǎo)的炎癥途徑[11]。有研究者在銅綠假單胞菌的研究中證實其分泌的OMVs內(nèi)所含有的sRNA可抑制人上皮細胞炎性因子IL-8表達和減弱小鼠肺內(nèi)KC細胞因子分泌和中性粒細胞募集[12]。有研究者報道了肺炎鏈球菌EVs的免疫調(diào)節(jié)能力，EVs通過被血清蛋白識別，結(jié)合補體系統(tǒng)C3b啟動補體替代途徑，形成補體復(fù)合物C5b-9，在人血清中加入肺炎鏈球菌EVs后導(dǎo)致巨噬細胞的吞噬活性減弱[13]。

3 免疫細胞分泌的EVs在ARDS中的作用

ARDS的發(fā)病機制中，免疫細胞是其中必不可少的環(huán)節(jié)，參與炎癥介質(zhì)的表達和調(diào)節(jié)，肺內(nèi)固有免疫細胞包括了肺泡上皮細胞、肺泡巨噬細胞、中性粒細胞、內(nèi)皮細胞、血小板等，他們之間可以通過各自分泌的EVs在ARDS中傳遞炎癥信號。

3.1 免疫細胞EVs參與模式識別受體(PRRs)相關(guān)信號通路

PRRs是人體固有免疫系統(tǒng)中的重要環(huán)節(jié)，是抵御病原微生物入侵的第一道防線，固有免疫細胞上的PRRs通過識別PAMP(病原相關(guān)分子模式)和DAMPs(損傷相關(guān)分子模式)等危險信號來調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)，PRRs分4種不同類型：TLRs、CLRs(C型凝集素受體)、RLRs(甲酸誘導(dǎo)基因(RIG)-Ⅰ型受體)和NLRs[14]。關(guān)于ARDS的EVs研究主要涉及TLRs和NLRs兩種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。TLRs的特點是N端富含亮氨酸重復(fù)序列(LRRs)，細胞質(zhì)內(nèi)含有Toll/IL-1R同源區(qū)(TIR)，Toll樣受體在大部分免疫細胞中都有表達，能夠識別外源性配體(如細菌的脂多糖、胞壁酸、肽聚糖以及細菌和病毒的核酸等)和內(nèi)源性配體(宿主細胞在組織損傷或者應(yīng)激下釋放的多種蛋白如融合蛋白、纖維連接蛋白、纖維蛋白原、熱休克蛋白以及透明質(zhì)酸等)，TLR4主要識別LPS或內(nèi)毒素，TLR2主要識別LTA、PGN，在與配體識別后構(gòu)象改變，將信號傳遞至下游。NLRs有NACHT和LRR兩個結(jié)構(gòu)域，當(dāng)PAMP與LRR結(jié)合后，NLR構(gòu)象改變，暴露出NACHT結(jié)構(gòu)域，NLR分子N端的效應(yīng)結(jié)構(gòu)域與激酶或caspase結(jié)合后開始活化。

3.1.1免疫細胞EVs激活Toll樣受體信號通路 Lee[6]將ARDS小鼠分為非感染組(高氧和鹽酸)和感染組(LPS和肺炎球菌)，處死后提取BALF中的EVs發(fā)現(xiàn)感染組EVs主要來源于肺泡巨噬細胞,非感染組EVs來源于肺上皮細胞，為研究EVs的功能，分別將提取出的EVs注射進健康小鼠氣管內(nèi)，發(fā)現(xiàn)感染組肺泡巨噬細胞的TLR6、TLR9、CD80、IL-1β和IL-10基因表達上調(diào)，非感染組EVs刺激巨噬細胞TLR2、IL-6、TNF-α表達增加，而且除肺炎鏈球菌外，高氧、鹽酸、LPS、肺炎假單胞菌刺激產(chǎn)生的EVs都上調(diào)了巨噬細胞MyD88基因的表達，并且TLR2和TLR6都是NF-κB的重要受體，表明EVs可以通過TLRs-MyD88-NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑刺激巨噬細胞在肺內(nèi)的炎癥反應(yīng)。

LPS與單核/巨噬細胞上的TLR4結(jié)合，可以釋放大量的TNF-α和IL-1β，但在同等條件下，人肺微血管內(nèi)皮細胞卻基本不釋放TNF-α和IL-1β，主要是以IL-6、IL-8、ICAM-1和選擇素E等中性粒細胞趨化因子為主[15]。有人[16]同時用肺內(nèi)皮細胞EVs和LPS處理小鼠模型，導(dǎo)致肺和全身IL-1β和TNF-α水平升高，中性粒細胞的募集和組織MPO水平的提高。用TNF-α體外刺激人肺微血管內(nèi)皮細胞(HLMVEC)和小鼠內(nèi)皮細胞(MLEC)后釋放出的EVs會激活NF-κB和PPAR介導(dǎo)的ICAM-1途徑，促進炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[17-18]。與之相似的是Soni[19]在用LPS誘導(dǎo)的ARDS小鼠BALF中提取巨噬細胞EVs，將巨噬細胞EVs在體外與小鼠上皮細胞培養(yǎng)4 h后,檢測到上皮細胞分泌的ICAM-1和KC(也叫CXCL-1)含量增加，在培養(yǎng)液中加入TNF抗體后ICAM-1表達受抑制，說明肺泡巨噬細胞EVs中的腫瘤壞死因子參與介導(dǎo)了肺上皮細胞炎癥的表達。研究者發(fā)現(xiàn)人血小板可以通過激活內(nèi)皮細胞直接參與內(nèi)毒素所引起的炎癥反應(yīng)，血小板分泌的EVs中含有成熟的IL-1β，依賴TLR4途徑誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞VCAM-1的表達增加[20]。

3.1.2免疫細胞EVs激活NLRP3炎癥小體 NLRP3炎癥小體是一種蛋白復(fù)合物，由NLRP3受體、銜接蛋白ASC和pro-caspase1組成，炎癥小體被激活后，ASC構(gòu)象改變，激活pro-caspase1，活性caspase-1釋放白介素1家族蛋白，誘導(dǎo)巨噬細胞分泌IL-1β。在炎癥反應(yīng)中，巨噬細胞上的TLR4識別病原體后，產(chǎn)生IL-1β前體，同時巨噬細胞識別損傷細胞釋放的ATP，通過NLRP3炎性小體激活caspase-1，使IL-1β前體轉(zhuǎn)變?yōu)镮L-1β參與炎癥反應(yīng)[21]。EVs可以調(diào)節(jié)NLRP3炎癥小體，參與ARDS的炎癥反應(yīng)過程。Zhang在LPS氣道滴注后的ARDS小鼠BALF中發(fā)現(xiàn)升高的EVs主要來源于巨噬細胞，同時在體內(nèi)和體外實驗中EVs含有的miR-223/142均大量增加，在抑制炎癥方面miR-223和miR-142分別通過抑制NLRP3和ASC，協(xié)同抑制巨噬細胞NLRP3炎癥小體活化[22]。

有研究者對LPS誘導(dǎo)的小鼠ARDS模型的BALF進行檢測，發(fā)現(xiàn)其EVs所含有的miRNA-466家族表達增加。隨后他們將含有miRNA-466g和466m-5p基因轉(zhuǎn)染到小鼠骨髓源性巨噬細胞(BMDMs)，一組用LPS和ATP刺激骨髓源性巨噬細胞，另一組在此基礎(chǔ)上予以NLRP3抑制劑，證實miRNA-466家族是通過激活NLRP3炎癥小體來加重ARDS的肺內(nèi)炎癥[23]。除此之外，Haneklaus等研究者發(fā)現(xiàn)miR-223和miR-BART15可以調(diào)節(jié)EB病毒感染的小鼠NLRP3炎癥小體和IL-1β的產(chǎn)生，主要表現(xiàn)為miR-223可以靶向與NLRP3 3’UTR結(jié)合，限制單核細胞炎癥小體激活，miR-223的過度表達阻止了NLRP3蛋白的積累，并抑制炎癥細胞產(chǎn)生IL-1β；其次miR-BART15與NLRP3 3’UTR具有相同靶向位點，通過已感染的B細胞釋放包含miR-BART15的外泌體來抑制非感染細胞的NLRP3炎癥小體[24]。

3.2 免疫細胞EVs激活JAK-STAT信號通路JAK-STAT信號具有轉(zhuǎn)導(dǎo)多種細胞因子和生長因子的作用，其機制主要為JAKs和STATs的酪氨酸磷酸化，隨后以二聚體形式轉(zhuǎn)移到細胞核調(diào)節(jié)特定DNA序列表達，而大多數(shù)STAT相關(guān)基因具有促進炎癥反應(yīng)的功能。革蘭陰性桿菌產(chǎn)生的LPS通過激活STAT3信號導(dǎo)致急性肺損傷，研究者用小分子STAT3抑制劑LLL12發(fā)現(xiàn)在LPS誘導(dǎo)的ARDS小鼠模型中LLL12不但抑制STAT3的激活，同時也抑制多種炎癥因子的表達如IL-1β、IL-6、TNF-α等[25]。相反的是SOCS中的蛋白會通過抑制JAK蛋白的磷酸化負調(diào)節(jié)JAK-STAT信號系統(tǒng)[26]，Bourdonnay報道巨噬細胞在外泌體和微泡中分別分泌SOCS1和SOCS3，經(jīng)肺泡上皮細胞攝取吸收后抑制STAT活化[27]。

3.3 免疫細胞EVs激活Rho/ROCK信號通路Rho/ROCK信號通路通過Rho與GTP結(jié)合激活下游ROCK，使ROCK底物磷酸化，調(diào)節(jié)內(nèi)皮及組織細胞通透性、收縮及生長作用。Moon[28]提取高濃度氧誘導(dǎo)的ARDS小鼠BALF后發(fā)現(xiàn)，來源于肺泡上皮細胞的EVs中Caspase-3可以激活肺泡巨噬細胞的炎癥表達，而EVs中升高的Caspase-8蛋白對IL-6、TNF-α和MIP-2沒有顯著影響，和Caspase-3也不存在協(xié)同作用。為了研究其具體機制，研究者分別加入p38、MAPK、ROCK1和JNK抑制劑，發(fā)現(xiàn)只有ROCK1抑制劑可持續(xù)抑制肺泡巨噬細胞中IL-6、TNF-α和MIP-2的分泌。從而確定源于肺泡上皮細胞的EVs中caspase-3主要是通過ROCK1途徑激活肺泡巨噬細胞。

3.4 免疫細胞EVs參與ARDS凝血改變機制在ARDS和膿毒癥等嚴重肺內(nèi)感染常伴隨體內(nèi)凝血功能改變及微血栓形成，肺泡巨噬細胞、肺泡上皮細胞、中性粒細胞及血小板的EVs都不同程度的參與了凝血過程。目前認為含有組織因子的EVs介導(dǎo)凝血改變是通過經(jīng)典的外源性凝血途徑(TF-FVIIa復(fù)合物-FXa-FIIa-FIa)和外源性凝血的替代途徑(依賴P選擇素途徑)這兩種路徑實現(xiàn)的[29]。Falati[30]發(fā)現(xiàn)巨噬細胞來源的EVs在血小板P選擇蛋白和PSGL-1介導(dǎo)下相互作用激活血小板聚集。P選擇蛋白和PSGL-1是血管粘附分子，白細胞釋放的EVs中所含有的組織因子和PSGL-1可以在損傷的血管壁上聚集并參與血小板血栓形成[31]。研究者發(fā)現(xiàn)源自于肺泡上皮細胞的EVs中包裹的組織因子是ARDS病理過程中促進凝血活性的主要來源，在ARDS中肺泡上皮細胞可通過釋放含有組織因子的EVs促進肺內(nèi)凝血，并由此推測這種改變可能與ARDS中肺泡內(nèi)纖維蛋白形成以及后續(xù)的纖維蛋白沉積有關(guān)[32]。動物研究發(fā)現(xiàn)血漿中組織因子也來源于血小板釋放的EVs，血小板EVs的表面積與血小板相差巨大，但是促凝血活性幾乎等同于血小板，主要原因是EVs單位面積上結(jié)合的磷脂酰絲氨酸、CD61、CD62P和FX的密度是活化血小板的數(shù)倍[33]。

4 總結(jié)

EVs 的發(fā)現(xiàn)代表了一種新的細胞間通訊模式，在ARDS中參與著炎癥信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)控，本文著重介紹ARDS的炎癥反應(yīng)和信號通路中病原微生物以及先天固有免疫細胞的各EVs所扮演的角色，實際上EVs在ARDS中的作用遠不止于此，了解了EVs在ARDS病理過程中的作用，為今后疾病的診斷及治療中提供理論依據(jù)。