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    結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)(T-SPOT.TB)在HIV合并肺結(jié)核人群中的診斷性能研究

    2021-05-25 10:41:46孫雪娟
    關(guān)鍵詞:分子生物學(xué)結(jié)核結(jié)核病

    閆 峰,孫雪娟

    (長春市傳染病醫(yī)院,吉林 長春130062)

    獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)是由人類免疫缺陷病毒(HIV)感染引起的以特異性細(xì)胞免疫功能受損為主要特點(diǎn)的全身性疾病,因其免疫力低下,常常合并各種機(jī)會(huì)性感染,結(jié)核分枝桿菌(MTB)感染是其最常見的機(jī)會(huì)性感染[1-2]。 HIV陽性患者感染MTB后,結(jié)核病發(fā)病率較 HIV 陰性患者增加30倍[3-4]。據(jù)世界衛(wèi)生組織提供數(shù)據(jù)顯示,2017年HIV陽性患者因結(jié)核病死亡例數(shù)為30萬例(26.6-33.5萬)[5]。有文獻(xiàn)報(bào)道,HIV合并結(jié)核病的患者臨床結(jié)核中毒癥狀不明顯,影像學(xué)表現(xiàn)也不典型,傳統(tǒng)的檢驗(yàn)方法如抗酸染色鏡檢、結(jié)核菌素試驗(yàn)、MTB細(xì)菌培養(yǎng)以及分子生物學(xué)檢測等的準(zhǔn)確性都較低[6]。本文旨在探討結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)(T-SPOT.TB) 在HIV合并結(jié)核病診斷中的應(yīng)用價(jià)值,以期為臨床準(zhǔn)確、快速診斷提供參考依據(jù)。

    1 資料與方法

    1.1 研究對象

    選取2018年1月至2019年9月期間,長春市傳染病醫(yī)院收治的HIV陽性患者512例,其中依據(jù)中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(WS 288-2017)確診或臨床診斷為肺結(jié)核病患者195例,肺部其他疾病患者317例(對照組),性別包括男419例,女93例;年齡13-79歲,年齡中位數(shù)41歲。分別收集入院抗結(jié)核治療以及抗病毒治療前(ART)第1次抽取的外周血進(jìn)行T-SPOT.TB檢測,以及痰液/體液樣本進(jìn)行病原學(xué)檢測,對檢測結(jié)果進(jìn)行回顧性分析。

    1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

    所有患者均在吉林省,長春市CDC確認(rèn)為HIV抗體陽性,診斷標(biāo)準(zhǔn)符合2005年國家AIDS診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]。

    1.3 結(jié)核病診斷分組及標(biāo)準(zhǔn)

    根據(jù)臨床表現(xiàn)(發(fā)熱、咳嗽、胸痛、呼吸困難等)、影像學(xué)表現(xiàn)(斑片、結(jié)節(jié)、縱隔淋巴結(jié)腫大等)以及病原學(xué)檢測結(jié)果,病原學(xué)檢測方法包括痰涂片、痰培養(yǎng)、分子生物學(xué)檢測,其中任意一項(xiàng)結(jié)果陽性定義為病原學(xué)陽性,所有病原學(xué)結(jié)果均為陰性定義為病原學(xué)陰性。

    1.4 主要試劑和儀器

    T-SPOT.TB試劑盒(英國Immunotec公司)及配套儀器試劑。分子生物學(xué)檢測試劑包括:①結(jié)核分枝桿菌rpoB基因和突變檢測試劑盒(Gene-Xpert)[賽沛(上海)商貿(mào)有限公司]。②結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸(DNA)檢測試劑盒(LAMP法)[榮研生物科技(中國)有限公司]。

    1.5 方法

    1.5.1T-SPOT.TB ①外周血樣本處理 采用T-SPOT.TB試劑盒,檢測分泌IFN- γ的T細(xì)胞,嚴(yán)格按照試劑說明書操作,常規(guī)分離外周血單個(gè)核細(xì)胞,用細(xì)胞培養(yǎng)基MD AIM-V將細(xì)胞懸起,計(jì)數(shù)后細(xì)胞濃度調(diào)至2.5×106個(gè)/ml。② T-SPOT.TB樣本測定:在預(yù)先包被有抗γ-干擾素單抗的孔中加入0.1 ml的細(xì)胞懸液,每份樣品設(shè)置4個(gè)檢測孔,分別為陰性對照(無血清培養(yǎng)基)、陽性對照(植物血凝素)、抗A[主要成分為早期分泌抗原靶6(ESAT-6)]、抗B[主要成分為培養(yǎng)濾液蛋白10(CFP-10)],各50 μl,樣品加好后放入HF151UV CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)16-20 h,洗板,加顯色液、終止液,判讀結(jié)果。

    1.5.2陽性結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) ①空白對照孔斑點(diǎn)數(shù)為0-5個(gè)時(shí),且(抗原A或抗原B孔的斑點(diǎn)數(shù))-(空白對照孔斑點(diǎn)數(shù))≥6;②空白對照孔斑點(diǎn)數(shù)6-10個(gè)且(抗原A或抗原B孔的斑點(diǎn)數(shù))≥2×(空白對照孔斑點(diǎn)數(shù))。如果上述標(biāo)準(zhǔn)不符合且陽性質(zhì)控對照孔正常時(shí),結(jié)果為“陰性”。

    1.5.3結(jié)核菌涂片抗酸染色 采用結(jié)核菌染色液試劑盒(熒光金胺O法),檢查樣本中結(jié)核分枝桿菌,嚴(yán)格按照操作說明書操作。

    1.5.4結(jié)核菌培養(yǎng) ①樣本處理:取痰標(biāo)本1-3 ml加入處理管中,加1-2倍體積4%NaOH溶液,旋渦震蕩30-60 s,室溫靜置,并開始計(jì)時(shí)15 min。接種0.1 ml至培養(yǎng)基斜面,每份標(biāo)本接種兩支培養(yǎng)基,保持斜面水平向上,在培養(yǎng)箱37℃中培養(yǎng)24 h后將培養(yǎng)基豎直放置,繼續(xù)培養(yǎng)。②結(jié)果判讀:接種后第3天、第7天至以后每周觀察1次并記錄結(jié)果,如有菌落生長,則進(jìn)行涂片鏡檢以鑒別污染菌,至第8周末仍無菌落生長,報(bào)告分枝桿菌培養(yǎng)陰性。

    1.5.5LAMP法 ①樣本測定:采用結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群核酸(DNA)檢測試劑盒定性檢測樣本中結(jié)核分枝桿菌復(fù)核群核酸(DNA),采集含膿性部分的合適的痰標(biāo)本40-60 μl,嚴(yán)格按照試劑說明書操作。②LAMP結(jié)果判讀:在確認(rèn)陽性對照發(fā)出綠色熒光,陰性對照沒有發(fā)出熒光后對樣本進(jìn)行判讀,陽性:發(fā)出綠色熒光,陰性:未發(fā)出熒光。

    1.5.6Gene-Xpert檢測 ①痰樣本測試前處理:痰液中加入1-2倍體積4%NaOH,搖勻,室溫靜止30 min使樣本液化,按樣本處理試劑:樣本(V∶V)2∶1的比例混合倒進(jìn)50 ml帶有螺旋蓋子的前處理管中,用力震蕩10-20次,室溫下靜置15 min。②結(jié)果判讀:結(jié)核分枝桿菌檢出高、結(jié)核分枝桿菌檢出中、結(jié)核分枝桿菌檢出低、結(jié)核分枝桿菌檢出極低為陽性結(jié)果,結(jié)核分枝桿菌未檢出為陰性結(jié)果。

    1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    采用Excel表建立數(shù)據(jù)庫,由專人對數(shù)據(jù)進(jìn)行提取并轉(zhuǎn)入數(shù)據(jù)庫。采用SPSS25.0統(tǒng)計(jì)軟件對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 T-SPOT.TB檢測結(jié)果分析

    195例確診或臨床診斷為HIV陽性合并肺結(jié)核的患者中,T-SPOT.TB檢測陽性143例,敏感性為73.33%;317例HIV陽性肺部其它疾病患者中,T-SPOT.TB檢測陰性275例,特異性為86.75%。見表1。

    表1 HIV合并結(jié)核病患者T-SPOT.TB檢測結(jié)果

    2.2 T-SPOT.TB與分子生物學(xué)檢測結(jié)果比較分析

    進(jìn)行分子生物學(xué)檢測的樣本包含42例Gene-Xpert檢測樣本以及56例LAMP檢測樣本,共計(jì)98例,其按照臨床診斷結(jié)果分為肺結(jié)核組44例,肺部其它疾病組54例,將其與T-SPOT.TB的結(jié)果進(jìn)行比較顯示:T-SPOT.TB檢測的敏感性77.27%(34/44) 高于分子生物學(xué)檢測敏感性47.73%(21/44),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.194,P<0.05)。T-SPOT.TB檢測特異性87.04%(47/54)與分子生物學(xué)檢測特異性96.3%(52/54)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(χ2=3.030,P>0.05)。兩者聯(lián)合檢測,診斷HIV合并肺結(jié)核的敏感性為90.9%(40/44),特異性為81.5%(44/54)。見表2。

    表2 T-SPOT.TB與分子生物學(xué)檢測結(jié)果比較分析

    本研究肺部疾病對照組(317例)包含5例臨床診斷為非結(jié)核分枝桿菌 (NTM)的患者,T-SPOT.TB在5例患者檢測結(jié)果都是陰性,特異性100%(5/5),提示在HIV人群利用T-SPOT.TB結(jié)果區(qū)分結(jié)核分枝桿菌感染與NTM感染可能存在一定的價(jià)值[8]。

    采用受試者工作特征曲線(簡稱“ROC曲線”)分析診斷HIV合并結(jié)核的最佳界值,T-SPOT.TB檢測的ROC曲線下面積是0.879,當(dāng)取T-SPOT.TB在面積最大時(shí)ROC曲線拐點(diǎn)值5為界值時(shí),診斷結(jié)核病的敏感度為83.1%(162/195),特異性為84.5%(268/317)(圖1)。

    圖1 T-SPOT.TB與病原學(xué)檢測的受試者工作特征曲線

    3 討論

    3.1 T-SPOT.TB在HIV人群合并結(jié)核病的診斷價(jià)值

    結(jié)核分枝桿菌感染是人類免疫缺陷病毒(HIV)感染者最為常見的機(jī)會(huì)性感染,兩者共感染可加速各自的疾病進(jìn)程[9]。及時(shí)發(fā)現(xiàn) HIV患者合并結(jié)核感染,對于 HIV感染合并結(jié)核病患者的有效治療具有積極的意義。T-SPOT.TB是采用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù),測定在結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激下受試者外周血樣本中釋放IFN-γ的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞數(shù)量,該方法在結(jié)核感染診斷中的價(jià)值已被越來越多的臨床研究證實(shí),敏感性可高達(dá)約90%[10-12]。但HIV患者屬于免疫功能異常人群,T-SPOT.TB作為基于免疫學(xué)的檢測方法檢測性能可能受到影響,致使該檢測方法診斷HIV合并結(jié)核病人群的結(jié)核靈敏度受到限制[13-14]。本研究結(jié)果顯示,在HIV陽性肺結(jié)核人群中,T-SPOT檢測的敏感性只有73.33%(143/195),低于之前文獻(xiàn)中的相關(guān)報(bào)道[15]。因此通過繪制受試者工作特征(ROC)曲線,得出T-SPOT.TB在檢測ROC曲線下面積是0.879,當(dāng)T-SPOT.TB取5為界值時(shí),診斷結(jié)核病的敏感性為83.1%,特異性為84.5%。

    3.2 T-SPOT.TB與分子生物學(xué)檢測方法在HIV合并肺結(jié)核人群檢出性能分析

    既往研究表明,與單純肺結(jié)核相比,HIV合并肺結(jié)核患者痰抗酸桿菌陽性率更低,癥狀及影像學(xué)特征不顯著,臨床診斷更為困難[16-17]。近年來,結(jié)核分子生物學(xué)檢測技術(shù)得到了快速發(fā)展,在涂陰培陽的人群里有很高的檢出率,特別是以美國賽沛公司的Gene-Xpert以及日本榮巖的LAMP為代表,發(fā)表過國內(nèi)外多篇相關(guān)文獻(xiàn)。本文研究結(jié)果顯示:T-SPOT.TB檢測HIV合并肺結(jié)核的敏感性77.27%(34/44) 高于分子生物學(xué)檢測敏感性47.73%(21/44),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.194,P<0.05),如果將兩者聯(lián)合檢測,可將HIV合并肺結(jié)核患者的臨床檢出率提高到90.9%(40/44)。

    3.3 T-SPOT.TB在HIV陽性合并NTM感染人群診斷性能分析

    NTM是艾滋病人中最常見的機(jī)會(huì)性感染病原體[18]。有研究表明,在痰培養(yǎng)分枝桿菌陽性人群中,艾滋病組NTM陽性率明顯高于非 HIV感染組[19]。NTM抗酸染色結(jié)果、臨床癥狀、X線表現(xiàn)與結(jié)核相似,難以鑒別,而且多數(shù)NTM對抗結(jié)核藥物有天然耐藥性,因此正確鑒定結(jié)核分枝桿菌和NTM對于疾病診斷和治療至關(guān)重要。結(jié)核感染 T 細(xì)胞檢測試劑盒(免疫斑點(diǎn)法)從結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(人型、牛型、非洲型)中選擇有用的抗原 ESAT-6 和CFP 10,兩種抗原在卡介苗(BCG)和大多數(shù)NTM中都缺失,降低與 BCG和NTM的交叉反應(yīng),提高了特異性[20]。本研究在肺部疾病對照組中包含5例臨床診斷為NTM的患者,T-SPOT.TB檢測結(jié)果都是陰性,特異性100%(5/5),提示在HIV陽性人群利用T-SPOT.TB進(jìn)行結(jié)核病與NTM鑒別診斷可能存在一定的價(jià)值。

    本研究仍存在一定不足。首先,大多數(shù)HIV陽性結(jié)核病患者難以獲得MTB病原學(xué)陽性結(jié)果,診斷多依據(jù)臨床表現(xiàn)、影像學(xué)表現(xiàn)及常規(guī)生化指標(biāo),盡管符合臨床實(shí)際,但可能對T-SPOT.TB診斷性能的評估出現(xiàn)偏差;其次,本次入組的HIV合并NTM患者只有5例,因此利用T-SPOT.TB區(qū)分結(jié)核分枝桿菌感染與NTM感染的價(jià)值還需要進(jìn)一步驗(yàn)證;再次,本研究取5為界值能否作為HIV合并結(jié)核人群臨床診斷的參考依據(jù),還需要大樣本多中心的研究。

    綜上所述,結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)(T-SPOT.TB)在HIV人群診斷結(jié)核病有較高的敏感性和特異性,可作為HIV合并肺結(jié)核人群輔助診斷結(jié)核病的依據(jù)。

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