中成藥DNA提取方法的研究進(jìn)展

景曉彤 黃 勇 黃玉婷 蔡 毅

廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西南寧530200

中成藥常見(jiàn)的傳統(tǒng)劑型主要有散劑、膏劑、丸劑、酒劑、茶劑、丹劑和錠劑等[1]。隨著現(xiàn)代科技不斷發(fā)展和突破，在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下，中成藥劑型取得了很大的改良和提升?，F(xiàn)代新劑型取代傳統(tǒng)劑型成為臨床常用劑型，包括注射劑、顆粒劑、片劑、膠囊劑、口服液、濃縮丸和微丸等。中成藥的品種數(shù)目很多，提取工藝復(fù)雜，鑒定難度不斷加大，因此需要更為科學(xué)、嚴(yán)謹(jǐn)、客觀的中成藥鑒定技術(shù)，才能滿足現(xiàn)代劑型中成藥鑒定的需要?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》（2020年版）[2]收載用于中成藥鑒別的方法主要有薄層色譜法、顯微鑒別法、熒光法、沉淀法、顯色法、升華法、燃燒法、結(jié)晶法等。近年來(lái)，由于DNA分子標(biāo)記技術(shù)具有靈敏度高和特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，成為國(guó)內(nèi)外中藥材鑒定方面的研究熱點(diǎn)[3-10]，但是分子鑒定技術(shù)應(yīng)用于中成藥鑒定方面的研究較少。

中成藥DNA提取質(zhì)量是開(kāi)展中成藥分子鑒定等研究的前提，同時(shí)也關(guān)系到中成藥基因文庫(kù)的建立以及分子克隆、高通量測(cè)序等技術(shù)的研究。在中成藥DNA提取過(guò)程中，提取方法、純化技術(shù)等對(duì)中成藥DNA質(zhì)量有較大的影響。因此，本文對(duì)近些年來(lái)中成藥的DNA提取方法（CTAB法、SDS 法、試劑盒法、磁珠法、乙醇沉淀法）進(jìn)行系統(tǒng)整理，為中成藥分子鑒定深入研究提供理論參考。

1 DNA提取及純化原理

1.1 破碎細(xì)胞

將植物或動(dòng)物的組織在液氮中研磨。液氮的溫度低至-196℃，既能使各組織成分不易被破壞或者降解，又能使組織變硬，質(zhì)脆，易于研磨。經(jīng)液氮速凍后，破胞效果更好，能有效釋放細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)，同時(shí)又可終止細(xì)胞內(nèi)外的一切生物反應(yīng)，避免DNA酶發(fā)生降解，維持基因組DNA的穩(wěn)定。

1.2 DNA的獲取

在細(xì)胞核中，DNA存在的形式是和組蛋白結(jié)合形成染色質(zhì)，而離子型表面活性劑如溴化十六烷三甲基胺（sodium dodecyl sulfate，SDS）、十二烷基硫酸鈉（cetyltrimethyl ammonium bromide，CTAB）等能有效破壞細(xì)胞膜，與核酸形成復(fù)合物，通過(guò)離心的方法，即可使DNA與大分子物質(zhì)分開(kāi)，釋放出來(lái)。

1.3 抽提法去除雜質(zhì)蛋白質(zhì)

為去除雜質(zhì)蛋白質(zhì)獲取DNA，通常采用酚氯仿法單獨(dú)抽提或反復(fù)抽提[11-13]。其原理是細(xì)胞核中的DNA通常與蛋白質(zhì)結(jié)合以復(fù)合物的形式存在，而利用苯酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1，v/v）或氯仿∶異戊醇（24∶1，v/v）等有機(jī)混合液，可使蛋白變性留在有機(jī)相或者中間相中，DNA則留在水相中，可以有效去除雜質(zhì)蛋白質(zhì)。

1.4 抗氧化法去除次生代謝產(chǎn)物

DNA的提取過(guò)程，常夾雜細(xì)胞次生代謝產(chǎn)物，如多酚、多糖、色素等，可與DNA共沉淀，形成難溶且易褐變的膠體，使DNA不易分離提取[14]。故提取過(guò)程中，應(yīng)添加聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、β-巰基乙醇、抗壞血酸等抗氧化劑，避免次級(jí)代謝產(chǎn)物與DNA形成膠體，影響DNA的提取進(jìn)程。

1.5 核糖核酸酶（RNase）消化去除RNA

為獲取高質(zhì)量的DNA，應(yīng)盡可能地去除其中的RNA。RNase是一種核酸內(nèi)切酶，可水解RNA，而對(duì)DNA無(wú)影響，故添加RNase有效去除DNA樣品中的RNA，獲取高質(zhì)量的DNA。

2 常用中成藥DNA提取方法及特點(diǎn)

中成藥DNA提取是基于中成藥中藥材成分，即動(dòng)植物等組織的DNA提取。中成藥制劑一般分為兩大類(lèi)：一類(lèi)是原粉末入藥，如丸劑、散劑；一類(lèi)是藥材經(jīng)過(guò)深加工入藥，如液體制劑、顆粒劑。中成藥在制劑過(guò)程中，因制劑工藝的要求，需要添加相應(yīng)的輔料，如淀粉、糊精、蜂蜜、硬脂酸鎂和蔗糖等，并按藥用處方和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)等規(guī)范進(jìn)行深加工，導(dǎo)致多數(shù)DNA已降解，僅存部分片段，給中成藥的DNA提取帶來(lái)較大的難度。中成藥DNA的提取方法很多，并各具特點(diǎn)，目前固體劑型的中成藥多采用CTAB法、SDS法、磁珠法試劑盒；液體劑型的多采用乙醇沉淀法[15]。

2.1 CTAB法

CTAB法屬于陽(yáng)離子去污劑，它可以使細(xì)胞膜溶解，并與核酸形成復(fù)合物。它溶于高鹽溶液（0.7 mol/NaCl），在低鹽溶液（0.3 mol/NaCl）中，通過(guò)離心與蛋白質(zhì)、多糖類(lèi)等進(jìn)行分離。加入乙醇時(shí)，核酸形成沉淀，CTAB溶于乙醇[16-17]。CTAB法常用的操作步驟：將樣品在液氮中研磨，加入2×CTAB（預(yù)熱）和β-巰基乙醇，65℃水浴1～2h，每15分鐘震蕩1次。冷卻至室溫，12 000 r/min，離心20 min，取上清液，加入等體積的預(yù)冷氯仿-異戊醇（24 ∶ 1），抽提 10 min，12 000 r/min，離心 15 min，重復(fù)3次。取上清液，按上清液和異丙醇為1∶0.7的體積比例加入異丙醇，室溫放置1 h，沉淀DNA。取沉淀物再用70%乙醇洗滌2次，風(fēng)干后溶于TE（tris-EDTA buffer solution）緩沖液中-20℃保存。

中成藥制劑時(shí)通常會(huì)添加大量的糖，多糖類(lèi)輔料的添加以及深加工是影響DNA提取質(zhì)量的重要因素，CATB法提取中成藥DNA的優(yōu)勢(shì)在于能夠很好地去除多糖，并且操作步驟簡(jiǎn)單。因此CTAB法為首選方案[18]。程春松等[19]使用中成藥和保健品中常用的輔料（如淀粉、蔗糖、葡萄糖等）模擬CTAB法提取DNA過(guò)程，發(fā)現(xiàn)使用甲醇作為沉淀試劑優(yōu)化傳統(tǒng)的CTAB法，可以較好地克服中藥制劑中淀粉對(duì)DNA提取的不利影響，可以有效地實(shí)現(xiàn)基于DNA的中藥制劑分子鑒定。茍惠等[20]采用傳統(tǒng)CTAB法、SDS法、磁珠法以及改良CTAB法對(duì)10種含當(dāng)歸的中成藥進(jìn)行DNA提取，發(fā)現(xiàn)利用改良CTAB法可獲得純度較高，質(zhì)量較好的DNA。

2.2 SDS法

SDS屬于陰離子去污劑，可使細(xì)胞膜和核膜破裂，并與核酸形成復(fù)合物。再加入酚和氯仿等表面活性劑，使蛋白質(zhì)變性，通過(guò)離心可與蛋白質(zhì)、多糖類(lèi)等物質(zhì)分開(kāi)，最后加入乙醇，沉淀DNA[21-22]。SDS法常用的操作步驟，在樣品中加入液氮研磨至粉末狀，加入20% SDS裂解液，65 ℃保溫，小幅度搖晃以充分混勻（不可強(qiáng)烈震蕩以防DNA斷裂），加入等體積的預(yù)冷氯仿-異戊醇（24∶1）抽提10 min，12 000 r/min，離心15 min，重復(fù)3次。取上清液，加入醋酸鉀溶液（KAc，5 mol/L），充分混勻，冰上放置20～30 min，12 000 r/min，離心 20 min，取上清液，按上清液和異丙醇為1∶0.7的體積比例加入異丙醇，充分混勻，置于冰箱冷凍層沉淀30 min，12 000 r/min，離心10 min，即得DNA沉淀，風(fēng)干，溶解于ddH2O或TE溶解中-20 ℃保存。

Coghlan等[23]采用SDS法對(duì)牙痛一粒丸等15種中成藥中的原料藥材進(jìn)行了DNA提取，發(fā)現(xiàn)葉綠體片段trn L適用于這15種中成藥中原料藥材的基原鑒別。Cheng等[24]采用SDS法對(duì)不同廠家的六味地黃丸做了DNA分子提取，成功地鑒定出處方物種，并在部分樣品中檢測(cè)到處方外物質(zhì)，如番瀉葉、南瓜、芍藥等。Coghlan等[25]采用SDS法對(duì)26種中藥制劑進(jìn)行DNA提取，均可獲得相應(yīng)的動(dòng)植物特征DNA。

2.3 DNA試劑盒法

試劑盒是將組織分散成單個(gè)細(xì)胞，并使細(xì)胞膜與核膜破碎，釋放出染色體，然后除去與DNA結(jié)合的蛋白質(zhì)。DNA試劑盒法由試劑盒廠家提供，具體步驟按試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。王麗麗[26]利用DNA提取試劑盒對(duì)啟脾丸、人參健脾丸、人參歸脾丸、蛇膽川貝膠囊4種含有名貴中藥材的中成藥進(jìn)行DNA提取，在利用CA3吸附柱吸附DNA時(shí)，將3個(gè)重復(fù)富集到一個(gè)吸附柱上，提取DNA。Jia等[27]利用試劑盒法提取中藥益母丸的DNA并對(duì)提取步驟進(jìn)行了改良，獲得了質(zhì)量較高的DNA。Xin等[28]把《中華人民共和國(guó)藥典》的DNA提取方法和試劑盒法結(jié)合起來(lái)進(jìn)行了改良，成功提取中國(guó)傳統(tǒng)中成藥九味羌活丸的基因組DNA。石林春等[29]采用自動(dòng)核酸提取儀和MagCore ?Genomic DNA Plant Kit提取方法對(duì)3份不同批次的如意金黃散提取基因組DNA，成功檢測(cè)出除厚樸外的全部處方成分。

2.4 磁珠法試劑盒

磁珠法的原理是在特定的條件下，使用不同的細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，讓DNA分子游離出來(lái)。而磁珠表面有特定的官能團(tuán)吸附核酸，帶負(fù)電的DNA可以被吸附到磁珠表面，然后在外磁場(chǎng)的作用下，磁珠與裂解液分開(kāi)。進(jìn)而對(duì)磁珠進(jìn)行目的物質(zhì)的分離純化，獲得純化核酸[30-31]。磁珠法中大多數(shù)都包括了細(xì)胞裂解、酶處理、核酸與其他生物大分子物質(zhì)分離、核酸純化等幾個(gè)主要步驟，每個(gè)步驟可由多種不同方法單獨(dú)或者聯(lián)合實(shí)現(xiàn)。田曉軒等[32]利用磁珠法動(dòng)物基因組試劑盒抽提出中成藥大黃蟄蟲(chóng)丸的DNA，并以16S rRNA、trn L、Mini-barcode為靶標(biāo)進(jìn)行熒光定量PCR，從23條克隆測(cè)序結(jié)果中解析到蠐螬、虻蟲(chóng)、甘草及桃仁或苦杏仁等中藥成分。

2.5 乙醇沉淀法

乙醇能夠消除核酸的水化層，使帶負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)暴露出來(lái)。Na+之類(lèi)的平衡離子能夠與這些帶電基團(tuán)結(jié)合，在沉淀形成部位降低多核苷酸鏈之間的排斥作用。因此只有在陽(yáng)離子的量足以中和暴露的磷酸殘基的電荷時(shí)才會(huì)發(fā)生乙醇沉淀。乙醇沉淀法的常用操作步驟：加入1/10體積的乙酸鈉（3 mol/L，pH=5.2）于DNA溶液中充分混勻，使其最終濃度為0.3 mol/L；加入2倍體積預(yù)冷的乙醇再次充分混勻置于-20℃中15～30 min；12 000 r/min，離心10 min，移除上清液，吸除管壁上所有的液滴；加入1/2離心管容量的70%乙醇，12 000 r/min，離心2 min，移除上清液，吸除管壁上所有的液滴；待室溫下將開(kāi)蓋的EP管中殘留的液體揮發(fā)；加適量的ddH2O溶解DNA沉淀。Chen等[15]用經(jīng)典CTAB法從固體樣品（根粉、片劑和藥丸）中提取基因組DNA，對(duì)液體樣品（口服液和注射劑）進(jìn)行乙醇沉淀。在口服液中未經(jīng)純化直接通過(guò)乙醇沉淀法提取的DNA是深棕色和黏稠的，大多數(shù)不能PCR擴(kuò)增。純化后的DNA顯示正常的顏色和黏度，可以通過(guò)PCR有效的擴(kuò)增。

3 展望

中成藥DNA的提取是中成藥分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)，只有獲取高質(zhì)量的DNA才能更好地開(kāi)展后續(xù)的研究[33]。近年來(lái)，雖然中藥分子鑒定取得了快速發(fā)展，特別是2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》增訂了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）法通則，進(jìn)一步促進(jìn)了中藥分子鑒定技術(shù)的深入和普及[34-35]，然而對(duì)于中成藥的分子鑒定研究報(bào)道相對(duì)較少，獲取高質(zhì)足量的DNA較為困難是其難以采用分子鑒定技術(shù)的重要原因。總之，中成藥DNA的提取，需要根據(jù)中成藥中不同的藥材以及不同的制劑類(lèi)型設(shè)計(jì)且優(yōu)化相關(guān)的DNA提取方法。此外，經(jīng)加工的肉類(lèi)食品，血清和組織的DNA雖然降解都較為嚴(yán)重，但依然可以提取高質(zhì)量的DNA。因此，除了上述提到的固體劑型的中成藥多采用CTAB法、SDS法、磁珠法試劑盒，而液體劑型的多采用乙醇沉淀法外，將來(lái)中成藥DNA的提取方法研究可以借鑒食品科學(xué)、法醫(yī)及考古等學(xué)科，如硅柱離心法[36]、酚-氯仿法[37]、直接擴(kuò)增法[30]。這些方法也將為中成藥DNA提取提供參考。