神經(jīng)絲輕鏈在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的研究進(jìn)展

楊清燕，陳涓涓，吳 軍

神經(jīng)絲蛋白(neurofilaments，NF)是神經(jīng)元細(xì)胞骨架的重要成分，作用為維持神經(jīng)元正常形態(tài)及保持神經(jīng)纖維的彈性，防止斷裂，而神經(jīng)絲輕鏈(neurofilament light，NFL)被認(rèn)為是神經(jīng)絲蛋白中最重要的一部分；實(shí)驗(yàn)研究表明，NFL作為軸突損傷的標(biāo)志物對于不同神經(jīng)系統(tǒng)疾病，包括肌萎縮側(cè)索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)、多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)、創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury，TBI)、亨廷頓舞蹈病(Huntington′s disease，HD)、急性缺血性卒中(acute ischemic stroke，AIS)等的診斷及用藥療效、預(yù)后評估等方面發(fā)揮著重要指導(dǎo)意義。本研究旨在對NFL的結(jié)構(gòu)、功能、檢測及其在不同神經(jīng)系統(tǒng)疾病的相關(guān)研究進(jìn)展做一綜述。

1 神經(jīng)絲蛋白和NFL的基本結(jié)構(gòu)、功能概述

神經(jīng)絲屬于中間絲蛋白家族的第Ⅳ類型[1]，是一種介于肌動(dòng)蛋白(6 nm)和肌球蛋白(15 nm)之間的圓柱形細(xì)絲，其直徑約為10 nm[2]，是構(gòu)成神經(jīng)元軸突的特異性分子蛋白及神經(jīng)元細(xì)胞骨架的重要成分。神經(jīng)絲具有增加軸突結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，促進(jìn)軸突徑向生長，增加軸突的直徑，提高軸突的脈沖傳導(dǎo)速度等作用[3]；另外，神經(jīng)絲主要定位在成熟神經(jīng)元的胞體和突起中，負(fù)責(zé)軸漿運(yùn)輸，維持神經(jīng)元正常形態(tài)及保持神經(jīng)纖維的彈性，防止其斷裂[3]。

典型的神經(jīng)絲位于軸突中心，呈平行排列，由NFL、神經(jīng)絲中鏈(neurofilament middle，NFM)、神經(jīng)絲重鏈( neurofilament heavy，NFH)和α-內(nèi)切蛋白(α-internexin，α-INT)組成[2]。所有亞基都具有保守的α-螺旋棒狀結(jié)構(gòu)域、可變的氨基末端和羧基末端區(qū)域，后者的長度賦予不同的分子量。通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳的方法，將神經(jīng)絲分為NFH(112.5 kDa)、NFM(102.5 kDa和145-160 kDa)、NFL(61.5kDa和70-86 kDa)與α-INT(55.4 kDa和58～66 kDa)[2]。神經(jīng)絲的數(shù)量決定軸突直徑，神經(jīng)絲蛋白在表達(dá)前軸突直徑較小，直到神經(jīng)絲三組分(neurofilaments triplet proteins，NFTPs)大量表達(dá)后，軸突直徑才增大；有研究顯示，神經(jīng)損傷后神經(jīng)絲蛋白表達(dá)水平明顯下降，軸突直徑縮小，隨著軸突的再生，神經(jīng)絲蛋白表達(dá)逐漸恢復(fù) ，軸突直徑亦恢復(fù)正常[1]。由此可見，神經(jīng)絲是軸突直徑大小的主要決定因素。神經(jīng)絲在神經(jīng)元胞體合成后被運(yùn)輸至神經(jīng)突起中，與微絲和微管共同組成神經(jīng)細(xì)胞的骨架網(wǎng)絡(luò)。在軸突的運(yùn)輸過程中神經(jīng)絲發(fā)生磷酸化與去磷酸化，磷酸化的蛋白組裝到軸突神經(jīng)絲網(wǎng)絡(luò)中，而原網(wǎng)絡(luò)中的蛋白則去磷酸化后成為游離狀態(tài)，新合成的神經(jīng)絲蛋白不斷與原神經(jīng)絲網(wǎng)絡(luò)中的蛋白發(fā)生新舊交換，以此進(jìn)行自我更新[1，4-5]；NFL 是唯一可以自我組裝的亞單位，其在體外可自我組裝成70 nm 的纖維，而當(dāng) NFL缺如時(shí)，神經(jīng)絲中鏈和神經(jīng)絲重鏈都不能組裝成功能性神經(jīng)絲，因而 NFL被認(rèn)為是最重要的神經(jīng)纖維絲成分[3，6]。

神經(jīng)軸索損傷是各種神經(jīng)疾病中導(dǎo)致永久性殘疾的病理基礎(chǔ)，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病管理中，軸突損傷的識(shí)別和量化可以提高診斷的準(zhǔn)確性，同時(shí)可作為預(yù)后評估標(biāo)準(zhǔn)[2，7]。神經(jīng)絲蛋白是一種在大直徑有髓軸突中高表達(dá)的神經(jīng)元骨架蛋白，因此，炎癥、神經(jīng)退行性變、創(chuàng)傷性或腦血管病等疾病引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)軸突損傷時(shí)，神經(jīng)絲蛋白將釋放到細(xì)胞外液、腦脊液，并以較低濃度釋放到外周血液中[8]，釋放量的多少取決于軸突損傷的嚴(yán)重程度[7]。由于NFL是神經(jīng)絲蛋白最豐富的亞基，也是可溶性的亞基，這使得NFL成為生物體液中最可靠的可測量的神經(jīng)絲亞基[7]。近年來，NFL被作為神經(jīng)軸索損傷的候選生物標(biāo)志物，正受到越來越多的關(guān)注[2]。隨著科技日新月異的發(fā)展，檢測NFL的技術(shù)更加精準(zhǔn)。臨床研究發(fā)現(xiàn)NFL與各類疾病有密切的關(guān)聯(lián)性，不管在疾病診斷、指導(dǎo)疾病預(yù)后、生物標(biāo)記、疾病嚴(yán)重程度的預(yù)估、檢測藥物的有效性、預(yù)測預(yù)后等方面都有重要的指導(dǎo)意義。

2 NFL的檢測方法

NFL作為軸索損傷的生物標(biāo)記物，準(zhǔn)確測量其濃度可協(xié)助了解多種疾病的發(fā)展過程，由于各種疾病狀態(tài)導(dǎo)致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)軸突損傷，將NFL釋放到細(xì)胞外液、腦脊液(cerebrospinal fluid，CSF)和外周血液中，外周血液中的NFL均較細(xì)胞外液、腦脊液低[2]；在臨床上腦脊液采樣為創(chuàng)傷性檢查，較外周血采樣不容易獲得；臨床上更加希望能夠用一種準(zhǔn)確的測定方法來檢測外周血的NFL以指導(dǎo)臨床工作；既往的檢測方法主要用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)技術(shù)測定腦脊液中的NFL濃度，由于血液中的NFL濃度僅為腦脊液含量的1/40[7]，ELISA測定血液NFL濃度的靈敏度不夠[7]，難以達(dá)到要求。經(jīng)過一系列的研究與驗(yàn)證，從第一代的半定量免疫測定法，再到第二代夾心ELISA法，再到第三代電化學(xué)發(fā)光(electrochemi luminescence，ECL)技術(shù)，已經(jīng)大大提高了分析靈敏度。近年來，隨著技術(shù)的發(fā)展，第四代單分子陣列(single molecular array，SiMoA)檢測技術(shù)在定量NFL方面的靈敏度分別比ELISA和ECL分析法高126倍和25倍[2，9-10]，使得在疾病狀態(tài)或生理?xiàng)l件下可以檢測到NFL濃度范圍，對血液中NFL水平進(jìn)行可靠的定量測定，為科研和臨床提供便利。SiMoA技術(shù)是采用經(jīng)典的雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附測定法實(shí)現(xiàn)極低含量的蛋白定量檢測，可實(shí)現(xiàn)單個(gè)分子的檢測，檢測靈敏度極高，通常在飛克(fg/mL)級(jí)別，比傳統(tǒng)的ELISA方法靈敏度高1 000倍。

3 NFL與神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)

3.1 NFL與運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病(MND) MND是常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其特征性病理改變?yōu)樯舷逻\(yùn)動(dòng)神經(jīng)元均存在變性及退化，其中ALS是最常見的亞型。Weydt等[11]研究顯示，ALS病人的腦脊液及血液中神經(jīng)絲水平較正常人明顯增高；尤其是 ALS的早期NFL水平升高更為明顯，可能與病程早期神經(jīng)元及軸突變性及退化速度更快相關(guān)。此外，NFL也可用于鑒別ALS與其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病及類MND疾病，其敏感性分別是88%和100%，特異性分別是92%和90%[12]。進(jìn)展為ALS的下運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病病人早期即存在血液及CSF中NFL水平增高，而Kennedy病及脊肌萎縮癥病人該指標(biāo)正常，提示NFL有望作為臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)之一，有利于縮短ALS確診時(shí)間。治療ALS的藥物有限，療效盡管不盡如人意，但仍有研究顯示，NFL具有評估ALS治療療效的潛力，基線高水平的血清NFL病人死亡危險(xiǎn)比為3.91[95%CI(1.98，7.94)，P<0.001][13]，提示NFL水平對于評估ALS預(yù)后具有提示作用。NFL水平越高，疾病進(jìn)展越快，總體存活時(shí)間越短[14-16]；

3.2 NFL與多發(fā)性硬化(MS) 磁共振(MRI)是目前唯一可識(shí)別MS新病灶的技術(shù)手段，其對于白質(zhì)病變成像效果較好，但對于灰質(zhì)病變顯示則欠佳，導(dǎo)致對MS灰質(zhì)病變的低估，影響預(yù)后判斷。神經(jīng)軸索損傷是決定MS病人長期功能殘疾最重要的決定性因素[17-20]，MRI不能準(zhǔn)確檢測出神經(jīng)軸索損傷程度，而NFL是近年來用于評估神經(jīng)軸索損傷的敏感標(biāo)志物。目前認(rèn)為可通過測量NFL濃度來間接反映軸索損傷程度，從而評估功能預(yù)后。Barro等[20]還提出NFL是一種實(shí)時(shí)、易于測量的神經(jīng)軸突損傷標(biāo)志物，比顱腦MRI更全面。有研究證實(shí)，腦脊液中NFL和血清NFL具有密切的相關(guān)性[21]；一項(xiàng)納入259例MS病人的研究指出：MS病人NFL水平明顯高于健康對照組[20-21]。Huss等[22]在近期一項(xiàng)為期24個(gè)月納入34例復(fù)發(fā)緩解型MS(relapsing remitting MS，RRMS)病人的探索性隨訪觀察研究中，分別使用醋酸格雷替拉默和β-干擾素治療，通過觀察復(fù)發(fā)事件(expanded disability status scale，EDSS)評分和MRI相關(guān)參數(shù)，發(fā)現(xiàn)病人急性期血清NFL水平高于緩解期 ，無復(fù)發(fā)病人的血清NFL水平從第9個(gè)月開始降低，提示除MAR外，血清NFL的縱向測量可用于監(jiān)測MS活動(dòng)性和治療療效。早在1998年，Rosengren等首次使用第二代免疫分析法測量腦脊液中的NFL水平，指出腦脊液中的NFL與MS病人的殘疾程度(EDSS評分)、疾病活動(dòng)程度及RRMS病人最后一次復(fù)發(fā)的時(shí)間具有相關(guān)性[23]，此后的數(shù)個(gè)大型臨床試驗(yàn)中也將該結(jié)論不斷得到重復(fù)和驗(yàn)證[20-21，24-28 ]。NFL還對疾病修飾治療(disease modifying therapy，DMT)效果有指導(dǎo)意義，持續(xù)DMT病人的血清NFL濃度低于未經(jīng)治療病人，血清NFL水平高的病人未來復(fù)發(fā)和殘疾惡化的風(fēng)險(xiǎn)比血清NFL水平低的病人高[29]。

3.3 NFL與創(chuàng)傷性腦損傷(TBI) TBI具有較高的致死率及致殘率，早期確定損傷嚴(yán)重程度是調(diào)整治療措施的關(guān)鍵。Smith 等[30]認(rèn)為，神經(jīng)軸索損傷是TBI預(yù)后的主要決定性因素。NFL被認(rèn)為是可以量化神經(jīng)軸索損傷的一種敏感標(biāo)志物。多項(xiàng)研究表明，腦外傷后腦脊液和血液中NFL濃度明顯升高；Shahim 等[31]研究證實(shí)，重型顱腦損傷后的前2周，腦脊液和血液中的NFL濃度與其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病或健康對照組相比急劇升高。研究顯示，血液NFL水平與腦脊液中NFL水平呈線性相關(guān)，利用Simona技術(shù)可以檢測血液內(nèi)微量NFL水平升高，成為診斷輕微創(chuàng)傷性腦損傷(mild TBI，mTBI)的敏感指標(biāo)[32]。另一項(xiàng)納入182例TBI 病人的研究指出，血清NFL水平與預(yù)后有相關(guān)性[33]。血液NFL可以準(zhǔn)確地識(shí)別顱腦外傷后頭顱CT表現(xiàn)異常病人，有助于臨床醫(yī)生決定腦外傷病人是否需要接受頭部CT或MRI檢查[34]。目前的研究結(jié)果需要進(jìn)一步研究來確定頭部創(chuàng)傷后血液NFL的動(dòng)態(tài)變化，從而確定其測量的最佳時(shí)機(jī)。

3.4 NFL與亨廷頓病 亨廷頓病是一種常染色體顯性的神經(jīng)退行性遺傳病，由HTT基因上的CAG重復(fù)擴(kuò)增導(dǎo)致突變型亨廷頓蛋白(mutant Huntingtin，mHTT)的異常沉積而致病，目前尚無有效治療方法。識(shí)別及預(yù)測疾病進(jìn)展和治療效果的敏感生物標(biāo)志物，可為深入研究亨廷頓病帶來新的前景[35]。2017年一項(xiàng)納入201例攜帶HTT 突變個(gè)體的回顧性研究分析顯示：HTT突變攜帶者血漿中NFL濃度高于正常對照組[36]。另有研究證實(shí)，血漿中NFL濃度與HTT CAG重復(fù)計(jì)數(shù)之間的相關(guān)性；NfL濃度與殼核、尾狀體、灰質(zhì)和白質(zhì)在MRI測量的體積呈負(fù)相關(guān)，與認(rèn)知功能及總體功能、腦萎縮有相關(guān)性，表明NFL濃度隨著亨廷頓病病人疾病嚴(yán)重程度的進(jìn)展而增加[36-38]。另一項(xiàng)橫斷面研究指出，腦脊液和血清NFL可區(qū)分有臨床表現(xiàn)的亨廷頓病和正常人、臨床前期的亨廷頓病突變攜帶者，表明隨著對NFL的進(jìn)一步了解，早期、靈敏的檢測NFL，可能有助于亨廷頓病療法的開發(fā)和臨床管理[35]。

3.5 NFL與AIS 缺血性腦卒中因神經(jīng)元的丟失和反復(fù)發(fā)生的缺血事件導(dǎo)致嚴(yán)重殘疾。預(yù)測組織損傷或腦卒中復(fù)發(fā)的生物標(biāo)志物可能有助于指導(dǎo)個(gè)體化腦卒中治療。近年來，研究發(fā)現(xiàn)NFL是缺血性腦卒中相關(guān)的潛在生物學(xué)標(biāo)記物。一項(xiàng)大型前瞻性研究納入504例AIS和111例短暫性腦缺血發(fā)作(transient ischemic attack，TIA)病人發(fā)現(xiàn)，AIS病人血清NFL水平高于健康對照組[39]。此外，該研究還發(fā)現(xiàn)TIA病人血NFL水平低于AIS病人，表明NFL可以用來區(qū)分AIS和TIA病人[39]。2019年的一項(xiàng)研究指出，當(dāng)血NFL濃度為4.9 pg/mL時(shí)，是鑒別AIS與TIA的最佳臨界值(敏感度73%，特異度80%)。AIS病人入院時(shí)臨床表現(xiàn)越嚴(yán)重，美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表(National Institutes of Health Stroke Scale，NIHSS)評分越高，血NFL濃度越高[40-42]。不同卒中亞型血清NFL濃度也不同[43]，其中心臟栓塞或大動(dòng)脈粥樣硬化型AIS病人血清NFL濃度最高[42]。Tiedt等[44]還發(fā)現(xiàn)血清NFL在腦梗死后第7天時(shí)濃度達(dá)到高峰，也有研究提出NFL的最高濃度出現(xiàn)在缺血性腦卒中后第3周[29]，但因沒有連續(xù)大樣本量的線性研究，NFL最高濃度出現(xiàn)時(shí)間節(jié)點(diǎn)目前尚無統(tǒng)一定論。NFL還可以預(yù)測腦梗死長期神經(jīng)功能結(jié)局[43]。腦卒中后3個(gè)月內(nèi)功能轉(zhuǎn)歸不良的病人入院時(shí)血NFL濃度高于轉(zhuǎn)歸良好的病人[41]。2019年發(fā)表在Stroke上的Uphaus等[40]研究也支持這一觀點(diǎn)。

4 結(jié) 語

NFL對于上述疾病雖然沒有特異性的診斷價(jià)值，但隨著血清NFL 檢測靈敏度不斷提高，其已經(jīng)成為臨床醫(yī)師評估疾病軸索損傷嚴(yán)重程度的定量測量物質(zhì)，臨床應(yīng)用潛力逐漸被發(fā)掘，其作為神經(jīng)系統(tǒng)疾病診斷、預(yù)測疾病活動(dòng)性、預(yù)測疾病進(jìn)展、隨訪預(yù)后、指導(dǎo)用藥和疾病監(jiān)測等的生物標(biāo)志物的證據(jù)日益增多。但真正可以應(yīng)用于臨床工作之前，還需要進(jìn)行一系列大型實(shí)驗(yàn)研究來評估其有效性和實(shí)用性。NFL是未來臨床和研究中最有前途的生物標(biāo)志物之一，其潛在的應(yīng)用和未來的發(fā)展方向仍需要進(jìn)一步探討。