上皮-間充質轉化在口腔鱗狀細胞癌發(fā)生、發(fā)展中作用的研究進展

周錦翰 劉傳霞 葛巍立 何虹

口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是頜面部最常見的惡性腫瘤之一。OSCC有較強的侵襲性，易發(fā)生頸部淋巴結轉移，原發(fā)病灶擴大切除、同期頸淋巴結清掃是常用的手術方式。由于術區(qū)集中在頜面部，此類手術通常會對患者的面部容貌產生較大影響，嚴重者需切除部分甚至全部的上、下頜骨，嚴重影響口頜功能與面部美觀[1-2]。由于OSCC浸潤性強、易轉移的特點，該類患者的預后較差，5年生存率約為50%[3-4]。因此，深入研究OSCC侵襲、轉移的分子生物學機制對降低腫瘤復發(fā)率、提高患者生存率具有重要的臨床意義。OSCC侵襲、轉移是多基因參與、多步驟完成的復雜過程，細胞相互之間松解、運動能力增強是侵襲與轉移的基礎[5]。其中，上皮-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是這一過程的主要因素。本文就EMT在OSCC發(fā)生、發(fā)展中作用的研究進展作一綜述。

1 EMT概述

EMT是指上皮細胞向間充質細胞轉化的過程，這一過程通常是可逆的，常見于胚胎發(fā)育和瘢痕組織的形成過程中[6]。在經歷了EMT的上皮細胞中，細胞骨架發(fā)生了重組，細胞外基質溶解，失去了與鄰近細胞的連接并且向周圍的組織運動。從蛋白質表達上來看，發(fā)生EMT的細胞下調了上皮標志物，包括E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、橋粒蛋白（desmoplakin）、細胞角蛋白、緊密連接蛋白（Claudins）、β-連環(huán)蛋白（β-catenin），與此同時，間充質標志物的表達上調，如N-鈣黏蛋白（N-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、纖連蛋白（Fibronectin）、鋅指轉錄因子（Snail1/2）[7-8]。從形態(tài)學上來講，細胞從典型的鋪路石樣不規(guī)則立方樣轉變?yōu)殚L梭形的間充質樣表現(xiàn)[9]。鈣黏附蛋白轉化對這一過程有極大的影響，即從E-cadherin轉變成為N-cadherin，E-cadherin是上皮細胞間主要的黏附分子，對維持上皮細胞形態(tài)有重要的作用[10]。調節(jié)這一過程的轉錄因子非常復雜，主要有鋅指轉錄因子家族（Snail、Slug、ZEB1、ZEB2、Twist等）。有學者發(fā)現(xiàn)，在OSCC細胞的體外實驗中，轉染了Snail的上皮完整表現(xiàn)了EMT的過程，最終呈現(xiàn)為E-cadherin減少、N-cadherin和Vimentin增加、半橋粒缺失的成纖維細胞樣形態(tài)，同時ZEB1、ZEB2的表達同樣上調[11]。

2 EMT在OSCC發(fā)生、發(fā)展中的作用

研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤組織中，EMT非常活躍，表現(xiàn)為腫瘤上皮細胞連接松解，上皮特異性標志物E-cadherin表達下降，細胞外基質降解，細胞逐漸開始游離并可進入臨近組織，運動能力增加，上皮細胞的極性消失，同時表達間充質細胞的分子標志物，如Vimentin、N-cadherin、Fibronectin等[12]。除此以外，在發(fā)生上皮異常增生的口腔黏膜中也可以觀察到此類現(xiàn)象的發(fā)生，且上皮異常增生越嚴重，E-cadherin的表達越低；同樣的，隨著病變的進展，在正常口腔黏膜、輕度上皮異常增生、中度上皮異常增生、重度上皮異常增生、OSCC組織中，Vimentin的表達整體呈上升趨勢，說明在OSCC的發(fā)生過程中就已經出現(xiàn)了EMT[13]。

有研究表明，EMT促進了腫瘤的侵襲和轉移，增加了腫瘤復發(fā)的風險，降低了患者的預后和生存率[14]。Nguyen等[15]發(fā)現(xiàn)在頭頸部鱗狀細胞癌（head and neck squamous carcinoma，HNSCC）的體外實驗中，N-cadherin的表達明顯上升，并且高表達N-cadherin的HNSCC在生物學行為上表現(xiàn)出更強的侵襲性。在OSCC組織和正常癌旁組織的交界處，表現(xiàn)出細胞分裂、分化從有序到無序的轉變，因此有學者將這一區(qū)域稱為腫瘤侵襲前緣（tumor invasive front，TIF）。在 TIF中，部分細胞處于半-間充質的狀態(tài)，間充質細胞標志物Vimentin出現(xiàn)了異常的高表達，同時細胞的運動能力增加[16]。Miyazawa等[17]發(fā)現(xiàn)在OSCC的TIF中，上皮細胞異位表達了間充質細胞特異性轉錄因子（mesenchymal specific transcription factor，HMGA2），并且HMGA2的表達量與OSCC患者的復發(fā)率和生存情況顯著相關，HMGA2不僅說明了OSCC上皮細胞經歷了EMT，同時腫瘤的侵襲性也得到了增強，其表達情況可以用于判斷腫瘤患者的預后。

3 EMT與TIF相關的信號通路

3.1 轉化生長因子 β（transforming growth factor-β，TGF-β）超家族與EMT TGF-β超家族是調節(jié)細胞EMT活動的經典途徑之一，包括TGF-β配體（TGF-β1/2/3）以及骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein,BMP）。TGF-β本身功能多樣，即使在同一細胞系中也能引起不同的細胞反應，在正常的上皮細胞和腫瘤早期細胞中，TGF-β表現(xiàn)為腫瘤抑制，然而隨著病程的進展，TGF-β又可以作為腫瘤發(fā)展的促進因子。該信號通路在上皮細胞中通過絲/蘇氨酸激酶跨膜受體（TGFβRⅠ、TGFβRⅡ）傳遞分子信號，在受體與配體結合后，TGFβRⅡ磷酸化TGFβRⅠ，后者繼續(xù)磷酸化細胞質內的受體調節(jié)性 Smads（R-Smads），在經典 TGF-β 通路中，R-Smads通常為 Smad2/3，在 BMP通路中則為Smad1/5/8，隨后磷酸化的R-Smads與Smad4結合，轉運至細胞核內，調節(jié)相關基因的表達[18－20]。Saika等[21]首先在晶狀體上皮的體外實驗中發(fā)現(xiàn)了EMT的過程，隨后通過構建Smad3沉默的小鼠模型，發(fā)現(xiàn)缺少Smad3的小鼠的晶狀體上皮在受到外界刺激時不能轉變成間充質形態(tài)，同時EMT標志物Snail、α平滑肌肌動蛋白的表達下降。Smad7可以通過抑制Smad2/3的磷酸化而阻斷TGF-β通路，將Smad7的cDNA轉染到細胞內，受外界刺激的晶狀體上皮細胞本該進行的EMT活動減弱甚至消失。在OSCC的相關研究中，有學者發(fā)現(xiàn)腫瘤出芽與TGF-β信號分子之間有密切聯(lián)系，腫瘤出芽是指在TIF區(qū)域中散在分布于間充質中的單個或少于5個小簇狀腫瘤細胞。Xie等[22]在2015年回訪了195例處于病變早期（T1/2N0）的舌鱗狀細胞癌患者，在組織病理切片上統(tǒng)計了TIF區(qū)域中腫瘤出芽的情況，結果顯示腫瘤出芽的數(shù)量和密度與頸部淋巴結轉移、復發(fā)率、侵襲深度密切相關。Jensen等[23]則對該現(xiàn)象的分子生物學機制進行了進一步研究，免疫組織化學和PCR檢測結果顯示在腫瘤出芽區(qū)域中EMT的引導物ZEB1和配對相關同源基因的表達均增加，上皮標志物E-cadherin則減少，而間充質-上皮轉化（mesenchymal-epithelial transition，MET）標識物OVO樣蛋白1的表達則顯著減少。大規(guī)模平行RNA測序顯示TGF-β是上游最活躍的信號分子，在加入了TGF-β刺激后，超過32%的基因表達情況與TGF-β 信號相一致[24]。

TGF-β超家族中的另一轉錄因子BMP同樣在OSCC組織的TIF區(qū)域中發(fā)揮了重要作用。Chiba等[25]在4 種 OSCC 細胞系（HSC2、HSC3、HSC4、SAS）中檢測了TGF-β1和BMP2的表達情況，發(fā)現(xiàn)HSC4細胞對BMP2的刺激反應較明顯，主要表現(xiàn)為Smad1/5/9目標基因的上調，如MET引導物分化抑制因子1和細胞角蛋白9；因此選擇HSC4細胞系來進一步研究BMP2對EMT的影響，發(fā)現(xiàn)在BMP2處理后1 h，Smad6和ID1的表達開始升高，3 h后到達最高點，且在此過程中磷酸化的Smad1/5/9含量顯著增加。RT-qPCR檢測結果顯示在經過BMP2處理后，上皮標志物CK9的表達顯著升高，而N-cadherin則受到明顯抑制，與此相反的是，在加入TGF-β1之后,上皮標志物CK18受到抑制，N-cadherin和Vimentin則表現(xiàn)為高表達。截止目前，該研究證明了TGF-β1能夠促進上皮向間充質的轉化，而BMP2則是逆向推進了該過程。與此相反的是，Qiao等[26]發(fā)現(xiàn)在BMP4的作用下，Tca8113細胞系（人類舌鱗狀細胞癌）從鋪路石樣逐漸轉變?yōu)樗笮?，EMT標志物Snail、Slug、Vimentin表達上調，E-cadherin下調，并且有部分細胞轉變成為腫瘤干細胞樣形態(tài)（cancer stem cell，CSC），CSC的標志物表達明顯上調，如乳腺癌抵抗蛋白、人端粒酶逆轉錄酶、CD44、B細胞特異的莫洛尼白血病毒插入位點1等。在其他種類的鱗狀細胞癌中，CSC已經被證明可以直接導致腫瘤的發(fā)生，同時在腫瘤的生長和治療后的復發(fā)過程中也起到了重要作用，因此BMP4可能是通過EMT來促進CSC的形成來增強OSCC的侵襲和轉移。

3.2 胞內磷脂酰肌醇激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號通路與EMT PI3K/Akt信號通路同樣能調節(jié)OSCC細胞的EMT[27]。Grille等[28]在SCC13和SCC15中通過轉染腺病毒使其能持續(xù)表達Akt，成功轉染后細胞形態(tài)發(fā)生了改變，E-cadherin、橋粒蛋白、β-catenin等細胞間黏附分子表達減少，Vimentin表達上調，細胞運動能力增強，同時轉錄抑制劑Snail的表達增加，提示Akt可能是通過Snail來抑制E-cadherin的表達。

3.3 Wnt/β-catenin信號通路與EMT 研究發(fā)現(xiàn)，βcatenin在OSCC細胞質中的異常聚集可以上調基質金屬蛋白酶7的表達及EMT，這一結果證明了Wnt信號分子與腫瘤的侵襲和轉移也有密切關系[29]。有研究者收集了57例OSCC組織標本，與57例正常口腔黏膜組織進行了對比，免疫組織化學和RT-qPCR檢測結果顯示OSCC組織中同源盒基因（homebox C10，HOXC10）過表達，且高表達HOXC10的患者5年生存率顯著降低，體外實驗顯示將HOXC10的shRNA轉染到SCC4細胞系中，使該細胞不表達HOXC10，SCC4細胞增殖和遷移能力與對照組相比顯著下降；進一步研究發(fā)現(xiàn)，在HOXC10沉默的細胞中，Wnt通路下游的Wnt10b、蓬亂蛋白Dsh同源物2、脂蛋白受體相關蛋白-6、脂蛋白受體相關蛋白-5的表達減少，其中Wnt10b的下降尤其顯著，與此同時，E-cadherin表達上升，N-cadherin和Vimentin表達下降，說明HOXC10可能通過Wnt信號通路來反向調節(jié)OSCC中的EMT[30]。

4 EMT在OSCC化療耐藥中的作用

OSCC的一線化療方案是順鉑，初始治療后大部分腫瘤得以清除，但是超過30%的患者會在5年之內復發(fā)[4，31]。研究表明，腫瘤細胞可以通過獲得間充質表型而產生對順鉑的耐藥，說明EMT可能是誘發(fā)化療耐藥的重要原因之一[32]。多重耐藥基因能夠通過表達特定的蛋白從而使長時間暴露在化療藥物中的腫瘤細胞向細胞外轉運藥物分子，細胞內藥物濃度下降，從而形成化療耐藥[33-34]。有研究顯示，順鉑耐藥的OSCC細胞系中多重耐藥基因長時間處于過表達的狀態(tài)，與此同時也發(fā)現(xiàn)了EMT轉化的現(xiàn)象，細胞形態(tài)從圓形向梭形轉變，N-cadherin表達上升，細胞活動性增加等[31]。EMT相關的轉錄因子可以與藥物排出泵結合，如Twist直接結合于E盒位點表面，人巢蛋白1通過刺激細胞外調節(jié)蛋白激酶/絲裂原活化蛋白激酶（ERK/MAPK）通路，誘導細胞發(fā)生EMT，上調藥物排出泵MDR1和ABCG2，產生順鉑耐藥[35-36]。長鏈非編碼RNA可以在表觀遺傳調控、轉錄調控、轉錄后調控等多層面上調控基因的表達[37]。MALAT1作為經典的致癌基因，在腫瘤的生長、侵襲、轉移中都發(fā)揮了重要作用，近年來有學者發(fā)現(xiàn)，與正常的OSCC細胞相比，高表達MALAT1的OSCC細胞出現(xiàn)了順鉑耐藥，后續(xù)研究表明，MALAT1可能是通過PI3K/Akt/m-TOR通路誘導產生EMT及耐藥現(xiàn)象[38-43]。

5 小結

近10年，大量的研究者在EMT的生物學機制、功能、應用能方面都進行了深入的研究，EMT已經被視為腫瘤侵襲、轉移的標志性事件。然而由于EMT這一過程高度異質，大量的轉錄因子和miRNA都被證明參與其中，因此其影響腫瘤侵襲、轉移的確切過程和作用仍有待闡明。隨著腫瘤分子生物學的發(fā)展，EMT可調控的生物學機制越來越多樣化、越來越復雜，在提高了研究難度的同時，也為干預這一行為提供了更多的選擇。深入研究OSCC中EMT與腫瘤侵襲、轉移的相關調控機制，有助于未來在臨床上更有效的開展靶向治療。