類泛素化修飾Neddylation在心血管疾病中的研究進(jìn)展

崔 靜，許佳佳，魏 博

鄭州大學(xué)藥物研究院；教育部藥物關(guān)鍵制備技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 鄭州 450001

迄今為止，心血管疾病被認(rèn)為是威脅全世界人類健康的最常見疾病之一，不僅病死率高，而且對患者的生活質(zhì)量和生存有很大影響。心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展涉及許多環(huán)境和行為因素，而且有研究[1-2]證實(shí)許多表觀遺傳變異參與心血管疾病的病理生理過程。翻譯后修飾是細(xì)胞內(nèi)蛋白活性及表達(dá)的重要調(diào)控機(jī)制之一，是一種普遍存在于特定氨基酸殘基上的化學(xué)修飾?？赡娴姆g后蛋白修飾是真核細(xì)胞功能的主要調(diào)節(jié)因子，其最普遍的形式包括磷酸化、甲基化、泛素化、類泛素化和乙?；?，已被確定為涉及各種信號通路、代謝和其他生物過程的主要調(diào)控機(jī)制[3]。Neddylation是一類新型蛋白翻譯后修飾，可將泛素樣蛋白NEDD8(neural precursor cell-expressed developmentally downregulated 8)與靶蛋白結(jié)合。Neddylation通過改變底物的構(gòu)象、穩(wěn)定性、亞細(xì)胞定位或與DNA、蛋白質(zhì)結(jié)合的親和力來調(diào)節(jié)多種細(xì)胞過程，包括泛素蛋白-蛋白酶體系統(tǒng)介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞信號傳導(dǎo)等[4]，與細(xì)胞損傷、細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的異常以及某些心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。因此，Neddylation可作為預(yù)防或治療心血管疾病的潛在靶標(biāo)。

1 Neddylation概述

1.1 NEDD8NEDD8是一種由81個氨基酸編碼的高度保守的蛋白，在序列和二級結(jié)構(gòu)水平上是與泛素關(guān)系最密切的蛋白[5](與泛素具有60%的同一性和80%的同源性)。有研究[6]顯示NEDD8可能以類似于泛素化的方式與其他蛋白質(zhì)結(jié)合。但是，NEDD8的結(jié)合模式與泛素完全不同。由于泛素和NEDD8在介導(dǎo)蛋白相互作用的結(jié)構(gòu)上存在微小差異，因此它們在細(xì)胞中不可互換。與泛素化相似的是，成熟的NEDD8與靶蛋白的結(jié)合是通過E1-E2-E3多酶級聯(lián)反應(yīng)完成的。NEDD8的成熟需要切割其C末端的氨基酸以暴露Gly76，使其與底物上的賴氨酸殘基形成異肽鍵。首先以E1 NEDD8激活酶(NAE)激活的NEDD8，以ATP依賴性方式形成NAE-S-NEDD8硫酯鍵。NAE是一種異源二聚體，包含β淀粉樣蛋白前體蛋白結(jié)合蛋白1和類泛素修飾活化酶3(UBA3)。然后活化的NEDD8被轉(zhuǎn)移至E2 NEDD8結(jié)合酶UBC12，形成另一個硫酯鍵，E3 NEDD8連接酶與帶有NEDD8的E2瞬時相互作用，隨后通過在NEDD8的C端甘氨酸與底物上的賴氨酸殘基之間形成異肽鍵，將NEDD8轉(zhuǎn)移至底物，完成整個類泛素化修飾過程[7]。

1.2 Neddylation的底物以及相關(guān)的酶Cullin家族蛋白是目前表征最充分且經(jīng)過充分驗(yàn)證的Neddylation底物，在涉及蛋白的類泛素化中具有關(guān)鍵作用。哺乳動物Cullin蛋白家族包含8個成員(CUL1～7和PARC)，其特征在于Cullin同源結(jié)構(gòu)域[8]，該家族可以使最大類的RING泛素E3連接酶(Cullin-RING連接酶)入核。除此之外，NEDD8的許多非Cullin底物包括P53、P73、PVHL、BCA3、EGFR、AICD、核糖體蛋白L11和組蛋白H4[9]。

Cullin-RING E3泛素連接蛋白(CRL)是最主要的泛素連接酶[10]。CRL包含3個主要組成部分：Cullin支架、RING指蛋白(RBX1或RBX2)和底物識別蛋白(該蛋白將底物置于泛素E2酶附近，以促進(jìn)泛素轉(zhuǎn)移)[5]。CRL是一種模塊化復(fù)合物，結(jié)構(gòu)是一個細(xì)長的馬蹄形，在人類中，6種Cullin蛋白——CUL1、CUL2、CUL3、CUL4A/B、CUL5和CUL7中的一種構(gòu)成了CRL復(fù)合體的中心支架，其羧基末端的Cullin同源結(jié)構(gòu)域是結(jié)合E3所必需的，其氨基末端可與底物銜接子蛋白相互作用：在催化核心，Cullin羧基末端與RING指蛋白RBX1或RBX2的氨基末端結(jié)合(RBX2只與CUL5結(jié)合，而RBX1與其他Cullin蛋白結(jié)合)。RBX1/2的C端環(huán)狀結(jié)構(gòu)域與E2結(jié)合酶介導(dǎo)泛素轉(zhuǎn)移[11]。因此，Cullin在保守的羧基末端賴氨酸上的類泛素化修飾可以誘導(dǎo)構(gòu)象的改變，從而促進(jìn)CRL底物的類泛素化。此外，Cdc34是唯一已知的與酵母中CRL相關(guān)的E2，同時，Cdc34a/b(UBE2R1和UBE2R2)和UBCH5(也稱為UBE2D1)已被描述為人類CRL的泛素E2[5]。蛋白質(zhì)組學(xué)研究顯示出CRL網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜性[12]和CRL底物的多樣性[13]，目前存在的200多種獨(dú)特的CRL復(fù)合物在細(xì)胞周期調(diào)控、胚胎發(fā)生、DNA復(fù)制和修復(fù)等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用[8]。

1.3 類泛素化修飾抑制劑

1.3.1MLN4924 MLN4924是一種氨基磺酸腺苷類似物，通過與NEDD8形成不可逆的共價(jià)化合物來特異性抑制E1，進(jìn)而阻止NAE的UBA3和NEDD8之間形成硫酯鍵，從而抑制Neddylation和CRL活性[14]。因此，用MLN4924處理細(xì)胞會迅速導(dǎo)致CRL底物的積累，包括Cdt1、P27和Nrf2等[15]。用MLN4924處理會抑制CRL4Cdt2的活性，進(jìn)而降低Cdt1和SETD8的穩(wěn)定性，最終導(dǎo)致細(xì)胞阻滯于S期和DNA再復(fù)制[16]。Cdt1在細(xì)胞周期G1期將DNA復(fù)制解旋酶復(fù)合物裝載到染色質(zhì)上起了關(guān)鍵作用，而CRL4Cdt2/SCFSKP2介導(dǎo)的Cdt1在S期的降解阻止了DNA的再復(fù)制[17]。組蛋白H4的賴氨酸20上的組蛋白單體甲基化可被SETD8催化，并且CRL4Cdt2在S期對SETD8的降解也會抑制DNA的再復(fù)制[18]?？傊琈LN4924通過積累DNA的損傷促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[19]。

1.3.2DI-591 DCN1在Neddylation途徑中起E3連接酶的作用。首先從天然12-mer UBC12肽開始并基于結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)和優(yōu)化發(fā)現(xiàn)了DI-591，它是一種有效且可滲透細(xì)胞的小分子抑制劑，它與DCN1高親和力結(jié)合并阻斷細(xì)胞中DCN1-UBC12蛋白與蛋白的相互作用。

DCN1通過與UBC12和CUL3結(jié)合，從而促進(jìn)了由RBX1-UBC12-NEDD8-CUL3-DCN1組成的功能復(fù)合物的形成，有效地將NEDD8從UBC12轉(zhuǎn)移至CUL3的K712殘基，導(dǎo)致CUL3 CRL泛素連接酶功能激活并隨后降解底物蛋白。通過DI-591阻止DCN1-UBC12相互作用會導(dǎo)致該功能復(fù)合物失活，從而使CUL3的Neddylation失調(diào)，并導(dǎo)致底物蛋白(例如Nrf2)的積累。DI-591有效地誘導(dǎo)了Nrf2蛋白積累和Nrf2轉(zhuǎn)錄激活，從而導(dǎo)致HO1和NQO1在mRNA和蛋白水平上調(diào)。

由于DI-591誘導(dǎo)Nrf2顯著上調(diào)以及其缺乏細(xì)胞毒性，因此DI-591及其類似物應(yīng)被評估為治療多發(fā)性硬化癥和其他人類疾病的潛在治療劑[20]。

1.4 Neddylations功能Neddylation通過改變底物的構(gòu)象、穩(wěn)定性、亞細(xì)胞定位或與DNA或蛋白質(zhì)的結(jié)合親和力，調(diào)控多種細(xì)胞過程，包括泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(ubiquitin-proteasome system，UPS)介導(dǎo)的蛋白降解、蛋白轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、線粒體更新、自噬、細(xì)胞死亡等[7]。

1.4.1Neddylation調(diào)控蛋白轉(zhuǎn)錄活性 轉(zhuǎn)錄因子是類泛素化Neddylation修飾靶點(diǎn)之一。Neddylation通常會通過改變蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性、蛋白質(zhì)之間和蛋白質(zhì)與DNA之間的相互作用以及亞細(xì)胞定位等不同途徑來抑制轉(zhuǎn)錄因子的活性。

TP53通過抑制細(xì)胞周期進(jìn)展或觸發(fā)衰老或凋亡等方式，幫助細(xì)胞應(yīng)對各種應(yīng)激信號(如營養(yǎng)剝奪、DNA損傷、缺氧和核糖體應(yīng)激)[21]，而MDM2促進(jìn)TP53蛋白酶體降解從而抑制TP53活性，Neddylation也會導(dǎo)致MDM2 TP53家族成員TP73的胞質(zhì)定位和轉(zhuǎn)錄活性下調(diào)[22]。E2Fs是既可激活又可抑制細(xì)胞周期進(jìn)展的轉(zhuǎn)錄因子。Neddylation會降低其穩(wěn)定性，抑制其與轉(zhuǎn)錄輔助因子MCPH1的相互作用，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄活性降低[23]。NF-κB家族包含異二聚體轉(zhuǎn)錄因子，主要負(fù)責(zé)炎癥反應(yīng)和細(xì)胞存活[24]。促炎性刺激,例如脂多糖(LPS)促進(jìn)IκB磷酸化，導(dǎo)致CUL1-NEDD8-βTrCP復(fù)合物識別p-IκB，最終導(dǎo)致其多泛素化和蛋白酶體降解。HIF-1α是具有調(diào)節(jié)體內(nèi)氧穩(wěn)態(tài)功能的轉(zhuǎn)錄因子。Neddylation會在缺氧時激活HIF-1α，而NAE1的沉默會減弱HIF-1α的活性[25]。

1.4.2Neddylation調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導(dǎo) EGFR是一種酪氨酸激酶受體，通過與細(xì)胞外生長激素結(jié)合而激活，進(jìn)而激活細(xì)胞內(nèi)的許多信號級聯(lián)反應(yīng)。被激活的EGFR通過內(nèi)吞作用在溶酶體中降解，c-CBL可導(dǎo)致EGFR的泛素化和內(nèi)吞化增加[26]。在DNA損傷后，RING E3連接酶RNF111與UBC12在組蛋白H4上組裝NEDD8鏈，然后被RNF168的UIM域識別，后者通過募集同源重組修復(fù)因子BRCA1和53BP1來放大DNA損傷反應(yīng)級聯(lián)[9]。腫瘤抑制因子P53在心肌細(xì)胞的凋亡、自噬和血管生成中起著重要作用，并與心臟肥大、擴(kuò)張型心肌病和心肌缺血再灌注損傷等有關(guān)[27]。FBXO11和MDM2促進(jìn)P53的Neddylation，從而阻止P53的核易位并抑制其轉(zhuǎn)錄活性[28]。Neddylation調(diào)控核糖體蛋白L11和S14的穩(wěn)定性和亞細(xì)胞定位，導(dǎo)致P53活化[29]。

1.4.3Neddylation調(diào)節(jié)線粒體更新 線粒體是細(xì)胞燃料工廠，為了防止細(xì)胞損傷，必須精確控制線粒體的質(zhì)量。線粒體的更新障礙與多種形式的心臟病理狀況有關(guān)。線粒體去極化后，線粒體定位蛋白激酶PINK1使Parkin磷酸化，導(dǎo)致其從胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到去極化的線粒體，使Parkin作為泛素連接酶，促進(jìn)線粒體蛋白泛素化，從而促進(jìn)受損線粒體的自噬降解[30]。Neddyation增強(qiáng)了Parkin泛素連接酶活性。此外，NAE1的表達(dá)減弱了果蠅中PINK1敲低引起的異常，而神經(jīng)毒素抑制了HEK293細(xì)胞中Parkin和PINK1的Neddylation[31]，這表明Parkin的Neddylation具有抗應(yīng)激作用。

據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道，Neddylation的失調(diào)已被證實(shí)參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程，如腫瘤[32]、神經(jīng)退行性疾病[33]、炎癥[34-35]、免疫缺陷、心力衰竭[36]和心血管疾病[37-39]。

2 Neddylation與心血管疾病

NEDD8在細(xì)胞增殖和發(fā)育中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，在裂變酵母中，NEDD8對細(xì)胞活力至關(guān)重要；在動物中，NEDD8是發(fā)育所必需的。為此，探索Neddylation與心血管疾病之間的聯(lián)系具有重要意義。

2.1 Neddylation與心室發(fā)育在發(fā)育過程中，心室發(fā)育不良導(dǎo)致先天性心臟疾病，包括左室心肌致密化不全心肌病(LVNC)，LVNC特點(diǎn)是深隱窩和過多突起的肌小梁，這會導(dǎo)致擴(kuò)張性心肌病、心力衰竭、血栓栓塞、心律失常和心臟性猝死[40]。

在發(fā)育的心臟中Neddylation作用非常活潑，而在胚胎期心臟中其作用被下調(diào)。心肌細(xì)胞的NAE1或UBC12的缺失會導(dǎo)致胚胎的死亡[41]。NAE1基因的敲除會導(dǎo)致Neddylation化的總蛋白、CUL2、CUL4減少，這表明NAE1對于心肌細(xì)胞的Neddylation過程是必不可少的。NAE1基因敲除小鼠心臟功能明顯受損，例如左心室壁變薄、左右心室擴(kuò)張以及射血分?jǐn)?shù)明顯降低，同時，NAE1基因敲除小鼠的心臟功能障礙也會使它們易患心力衰竭；除此之外，NAE1基因敲除還會導(dǎo)致心臟擴(kuò)大并伴隨心肌細(xì)胞橫截面積增加以及與肥大性重構(gòu)相關(guān)基因的表達(dá)失調(diào)，因此可知NAE1基因的缺失會導(dǎo)致心臟肥大[38]。

心肌細(xì)胞增殖對胚胎心臟發(fā)育至關(guān)重要[42]。干擾心肌細(xì)胞增殖會影響心室發(fā)育并導(dǎo)致LVNC[43]。因此，需要探討在發(fā)育過程中Neddylation是否對心肌細(xì)胞的增殖起調(diào)節(jié)作用。對Neddylation是如何調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞增殖的研究[38]結(jié)果表明，NAE1基因敲除后心臟表現(xiàn)出細(xì)胞周期激活劑Cnnd1和Cnnd3的表達(dá)下調(diào)，以及細(xì)胞周期抑制劑BRCA1、CDKN1A、CDKN2B、RB1、SFN、Trp63和CDK5RAP1的表達(dá)明顯上調(diào)，除此之外，使用特異性的NAE1抑制劑MLN4924會抑制新生大鼠心室心肌細(xì)胞的Neddylation。綜上可知，Neddylation會以細(xì)胞自主方式調(diào)節(jié)多種細(xì)胞周期調(diào)節(jié)劑的表達(dá)。

Hippo-YAP信號已被證實(shí)參與了Neddylation對心肌細(xì)胞增殖的調(diào)控。Neddylation的抑制會激活Hippo激酶并抑制YAP信號傳導(dǎo)。而YAP信號的再激活減弱了MLN4924對心肌細(xì)胞增殖的抑制作用。進(jìn)一步的機(jī)制研究[38]發(fā)現(xiàn)NEDD8底物CUL7介導(dǎo)了MST1的類泛素化和降解，從而抑制Neddylation，減弱了CUL7與MST1的相互作用，導(dǎo)致MST1的積累，從而抑制YAP信號傳導(dǎo)和心肌細(xì)胞增殖。綜上所述，Neddylation通過Hippo-YAP信號在心室發(fā)育過程中發(fā)揮作用，這可能為左心室非致密性心肌病的病因?qū)W提供新的見解[38]。

2.2 Neddylation與動脈粥樣硬化動脈粥樣硬化是動脈壁的炎癥狀態(tài)，是引起心肌梗死和腦卒中的主要原因。引起動脈粥樣硬化病變的炎癥過程涉及依賴NF-κB的內(nèi)皮細(xì)胞活化和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞募集，因此轉(zhuǎn)錄因子NF-κB在血管炎癥和動脈粥樣硬化中起著至關(guān)重要的作用。NF-κB的活化取決于許多調(diào)控機(jī)制，例如CRL驅(qū)動的κB-α類泛素化就是由COP9信號體復(fù)合物(COP9 signalosome，CSN)控制。

CSN是一個高度保守的多功能蛋白質(zhì)復(fù)合物，包含8個亞基(CSN1～8)。CSN能夠調(diào)節(jié)CRL的活性，其缺失會導(dǎo)致底物識別銜接子和CRL復(fù)合物的不穩(wěn)定。CSN參與了各種細(xì)胞過程，例如細(xì)胞周期控制、DNA修復(fù)和基因表達(dá)[44]。CSN5是唯一具有催化活性的CSN亞基，可以獨(dú)立于CSN穩(wěn)定存在，并且被證明與炎癥調(diào)節(jié)有關(guān)[45]。有研究[46]觀察到，CSN5在人動脈粥樣硬化病變中，特別是在內(nèi)皮細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞中過表達(dá)。

CSN5減弱了體內(nèi)動脈粥樣硬化病變的形成，已被證明具有抗動脈粥樣硬化作用。CSN5基因缺失可顯著加重主動脈根部、主動脈和主動脈弓的動脈粥樣硬化病變，尤其在雄性小鼠中[37]。

CSN5基因缺失會增強(qiáng)NF-κB信號通路的激活，并促進(jìn)巨噬細(xì)胞的促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生。趨化因子樣細(xì)胞因子MIF可引起動脈粥樣硬化，而CSN5抑制MIF在內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中的分泌。此外，CSN5的缺失導(dǎo)致LPS處理后HIF-1α的核水平顯著降低，HIF-1α靶基因EDN1和OPN1顯著減少，而c-Met和Ets1沒有受到明顯影響?？傊?，CSN5抑制炎性巨噬細(xì)胞中NF-κB活化和促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，同時也影響HIF-1α途徑[37]。MLN4924對Neddylation的抑制作用可抑制巨噬細(xì)胞中的促炎性細(xì)胞因子，并干擾這些細(xì)胞中的NF-κB、HIF-1α和MAPK信號傳導(dǎo)[37]。

人和小鼠的動脈粥樣硬化斑塊含有M1和M2巨噬細(xì)胞，M1巨噬細(xì)胞由于其炎癥特性而促進(jìn)斑塊形成，而M2巨噬細(xì)胞可將斑塊消退[47]。MLN4924可使巨噬細(xì)胞偏向M2表型。除此之外，MLN4924可干擾內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥和動脈粥樣硬化過程，主要表現(xiàn)為動脈粥樣硬化基因表達(dá)降低、降主動脈和主動脈根中早期動脈粥樣硬化病變減輕、NF-κB活化和單核細(xì)胞停滯。

綜上所述，CSN5和MLN4924都通過減弱NEDD8與Cullin的結(jié)合來阻止早期的動脈粥樣硬化病變的形成，而且還可以阻止體內(nèi)的各種炎癥介質(zhì)進(jìn)而控制炎癥過程[37]。

2.3 deNeddylation與心力衰竭UPS是介導(dǎo)細(xì)胞中靶向蛋白質(zhì)降解的主要蛋白水解途徑，UPS功能障礙已涉及心臟發(fā)病機(jī)制，包括缺血性心臟病、壓力超負(fù)荷的心臟肥大和心臟衰竭、充血性心力衰竭、糖尿病性心肌病、家族性肥厚性和擴(kuò)張型心肌病[48]、與結(jié)節(jié)有關(guān)的心肌病和阿霉素心臟毒性。因此了解心臟UPS功能的調(diào)控方式將有助于描述UPS功能障礙的病理生理意義并開發(fā)新的治療策略。CSN可以調(diào)節(jié)UPS，因此CSN介導(dǎo)的deNeddylation可能在UPS功能以及心肌細(xì)胞存活中起到關(guān)鍵性作用。

CSN對CRL的調(diào)節(jié)依賴于CSN5的異肽酶活性，從Cullin家族蛋白中去除了NEDD8。為了維持CRL的活性，需要循環(huán)進(jìn)行Neddylation和deNeddylation，因?yàn)镃SN功能的喪失會導(dǎo)致CRL中許多可識別底物的銜接子不穩(wěn)定，從而積聚其底物。CSN8是CSN的8個亞基(CSN1～8)中最小的一個，其調(diào)節(jié)的deNeddylation是維持心臟結(jié)構(gòu)和功能完整性的關(guān)鍵。

小鼠心肌細(xì)胞限制性CSN8基因敲除(CR-CSN8KO)損害CSN完整復(fù)合物的形成和Cullin的deNeddylation，并導(dǎo)致F-box蛋白減少；從出生后2周開始，CR-CSN8KO心臟明顯增大，體重/脛骨長比增加，α-肌動蛋白和ANF水平上調(diào)；在第3周，CR-CSN8KO小鼠收縮末期和舒張末期左心室直徑增加，表明左心室功能受損，并且大多數(shù)在4～5周內(nèi)死亡[36]?？梢姡珻SN8缺乏會導(dǎo)致心臟肥大，其持續(xù)發(fā)展會導(dǎo)致心力衰竭并最終導(dǎo)致死亡。

由于CSN能夠調(diào)節(jié)CRL活性以及與去泛素化酶和19S蛋白酶體結(jié)合，因此已被建議作為UPS調(diào)節(jié)劑。研究[36]表明CSN8缺乏嚴(yán)重?fù)p害了UPS介導(dǎo)的蛋白水解功能，并導(dǎo)致大量心肌細(xì)胞壞死。此外，CSN8缺失不會引起細(xì)胞凋亡，但會增強(qiáng)心肌細(xì)胞對凋亡因子的敏感性。綜上可知，CSN8/CSN在Cullin的deNeddylation、UPS介導(dǎo)的蛋白質(zhì)亞群降解以及心肌細(xì)胞存活中起著至關(guān)重要的作用。由CSN8缺乏癥/心肌細(xì)胞CSN功能異常引起的UPS功能損害可能導(dǎo)致心力衰竭[36]。

2.4 Neddylation與心肌細(xì)胞壞死研究[49]發(fā)現(xiàn)，CSN不僅調(diào)節(jié)蛋白酶體介導(dǎo)的蛋白水解作用，而且還調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞自噬。自噬是一個介導(dǎo)大量蛋白質(zhì)降解的代謝過程。過度激活或抑制自噬會導(dǎo)致心臟病，Ras相關(guān)蛋白7(Rab7)是調(diào)節(jié)自噬體成熟的關(guān)鍵蛋白，Rab7的下調(diào)可破壞自噬體的成熟并導(dǎo)致心肌細(xì)胞壞死。

在CR-CSN8KO心臟中觀察到自噬體大量增加，表明CSN8缺乏癥會增加心臟的自噬。同時，CSN8缺乏會損害自噬體的消除功能，導(dǎo)致自噬體在心肌細(xì)胞中大量積累，這可能是由溶酶體的減少引起自噬流受阻所致：CSN8缺陷型心肌細(xì)胞試圖通過合成更多的組織蛋白酶D和LAMP來增加其溶酶體合成，但這些溶酶體成分無法有效地組裝更多的溶酶體，除此之外，自噬體與溶酶體融合形成自溶體后，溶酶體去除了自噬體，因此，自噬液泡的積累還有可能是由于自噬體與溶酶體融合受阻或溶酶體蛋白水解缺陷。所以，在CR-CSN8KO心臟的心肌細(xì)胞中，自噬體的大量積累預(yù)示細(xì)胞自噬體成熟過程中存在更嚴(yán)重的損害。自噬成熟的損害可能是CSN8缺失心臟中大量心肌細(xì)胞壞死的根本原因，同時研究[49]發(fā)現(xiàn)Rab7可能是CSN8/CSN調(diào)節(jié)自噬體成熟的聯(lián)系。進(jìn)一步研究[49]證明，Rab7下調(diào)會損害基礎(chǔ)自噬通量和心肌細(xì)胞選擇性/非選擇性自噬中的自噬體成熟，并使心肌細(xì)胞對蛋白酶體抑制誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡敏感性增加。

隨后有研究者[39]探討了CSN8在成年小鼠心臟中的生理作用，發(fā)現(xiàn)其具有類似的作用，在CSN8基因敲除后的心臟中觀察到自噬小體去除受損、大量壞死的心肌細(xì)胞以及擴(kuò)張型心肌病。因此，由于其在心肌細(xì)胞壞死、UPS介導(dǎo)的心肌蛋白水解和心臟自噬蛋白降解中的重要作用，deNeddylation形式的CSN對圍產(chǎn)期和成體心臟的心肌細(xì)胞存活都至關(guān)重要。

2.5 Neddylation與高血壓核激素受體過氧化物酶體增殖物激活的受體γ(peroxisome proliferator- actived receptor gamma，PPARγ)中的顯性負(fù)突變會通過未知機(jī)制導(dǎo)致高血壓。而血管壁內(nèi)的PPARγ在預(yù)防血管功能障礙或高血壓期間異常的血管生長和重塑中起關(guān)鍵作用。RhoBTB1是與CUL3協(xié)同作用的PPARγ靶基因，在血管平滑肌中其被dnPPARγ下調(diào)，而RhoBTB1的敲低會導(dǎo)致CUL3和CUL3蛋白表達(dá)顯著降低以及RhoA的升高，因此，在主動脈平滑肌細(xì)胞中敲低CUL3或抑制Cullin-RING連接酶活性會增加RhoA，從而增加血管收縮和動脈壓。為此，通過突變或抑制修飾對PPARγ信號傳導(dǎo)的干擾會導(dǎo)致CUL3活性降低，這與CUL3相互作用蛋白RhoBTB1的丟失有關(guān)。RhoA的CUL3依賴性降解受損導(dǎo)致RhoA/Rho激酶信號增強(qiáng)，并導(dǎo)致對血管擴(kuò)張劑和血管收縮劑信號的反應(yīng)性失衡，從而導(dǎo)致高血壓。因此，在正常條件下，PPARγ有助于通過CUL3介導(dǎo)的RhoA轉(zhuǎn)換來嚴(yán)格調(diào)節(jié)RhoA/Rho激酶活性[50]。

2.6 Neddylation與血管內(nèi)膜增生使用經(jīng)典的股動脈損傷小鼠模型以研究MLN4924是否可改善內(nèi)膜增生及其對血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)凋亡的影響，結(jié)果表明，MLN4924通過促進(jìn)VSMC的凋亡來抑制內(nèi)膜增生[19]。隨后通過評估MLN4924和NAE1的敲低對人類平滑肌細(xì)胞的細(xì)胞周期和凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)NAE1敲低導(dǎo)致NEDD8-Cullin(Cullin蛋白的Neddylation形式)急劇減少，表明Neddylation失活，與MLN4924的作用相似，兩者都通過誘導(dǎo)G2/M阻滯和凋亡來抑制人類平滑肌細(xì)胞的生長[19]。

MLN4924可上調(diào)人類平滑肌細(xì)胞中的P53和P62。P53敲低可減輕MLN4924對G2/M阻滯和凋亡的影響，MLN4924可能通過誘導(dǎo)DNA損傷反應(yīng)而導(dǎo)致P53的總水平和磷酸化水平以及在VSMC中的轉(zhuǎn)錄活性上調(diào)。但是，P53的mRNA水平?jīng)]有受到影響，這表明對P53的調(diào)控處于轉(zhuǎn)錄后水平[19]。研究[19]顯示，P62的缺乏會加重小鼠新生內(nèi)膜的形成，表明P62在新生內(nèi)膜增生中起重要作用。在癌細(xì)胞中，MLN4924可導(dǎo)致含有mTOR相互作用蛋白的DEP結(jié)構(gòu)域和缺氧誘導(dǎo)因子1的積累，而這些DEP結(jié)構(gòu)域和缺氧誘導(dǎo)因子1又通過抑制mTORC1而導(dǎo)致MLN4924誘導(dǎo)的自噬。相反，MLN4924可能通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控增加了P62 mRNA的水平。

3 總結(jié)和展望

近些年來，蛋白質(zhì)翻譯后修飾可以精確調(diào)節(jié)和改善多種信號通路的穩(wěn)定性和活性而受到廣泛的關(guān)注，同時我們對類泛素化修飾Neddylation的功能意義及其與疾病的關(guān)系有了更好的理解。現(xiàn)有的證據(jù)強(qiáng)有力地表明Neddylation對許多基本的細(xì)胞過程有深刻的影響，對維持心臟結(jié)構(gòu)和功能至關(guān)重要，而且與泛素化及其他泛素樣蛋白修飾同等重要。因此，本篇綜述深入地總結(jié)了類泛素化修飾Neddylation的生物學(xué)特征以及在心臟發(fā)育和病理重塑中的作用，以便于開發(fā)新的治療策略來治療心臟疾病。

值得注意的是，迄今為止，類泛素化修飾對心臟疾病發(fā)展的影響大多是基于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動物模型，臨床效果仍不明確。而且，在動物模型中，Neddylation/deNeddylation在更多不同類型的心臟病中的功能仍有待確定。其次，有待建立新的功能獲得和功能喪失小鼠模型，針對NEDD8途徑的主要成分NAE、UBC12、UBE2F、DCNL1～5、NEDP1和NUB1L進(jìn)行研究。小鼠模型的創(chuàng)建和研究表征不僅可以為我們提供更加全面詳細(xì)的心臟內(nèi)Neddylation/deNeddylation的生理功能，而且也將是剖析Neddylation對心臟生理病理影響的有力工具。第三，盡管目前已知Neddylation參與UPS、自噬和壞死，但仍需要進(jìn)一步研究Neddylation控制心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能完整性的確切分子機(jī)制，以便于未來發(fā)現(xiàn)由Neddylation調(diào)控的心臟疾病的治療新過程。最后，未來將通過系統(tǒng)全面的全蛋白質(zhì)組研究來確定心臟中的NEDD8新靶標(biāo)，這對于我們更好地了解心臟疾病中Neddylation的失調(diào)以及開發(fā)靶向Neddylation信號轉(zhuǎn)導(dǎo)構(gòu)件以治療心血管疾病的藥物而言是重要的。因此，基于類泛素化修飾Neddylation研究的治療是有前途的，也是具有挑戰(zhàn)性的。