十字花科植物黃化突變特性及其分子機(jī)制研究進(jìn)展

吳硯農(nóng)，鄭偉尉，陸偉杰，臧運(yùn)祥

（浙江農(nóng)林大學(xué) 農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院 浙江省農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)改良技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 311300）

十字花科Brassicaceae植物多為1年生或多年生的草本植物，包含小白菜Brassica rapassp.chinensis、甘藍(lán)Brassica oleraceavar.capitata、油菜Brassica napus、蘿卜Raphanus sativus等蔬菜作物，還有二月蘭Orychophragmus violaceus等觀賞植物，以及板藍(lán)根Isatis tinctoria等藥用植物等。十字花科植物中富含葉綠素，且葉與莖中的葉綠素遠(yuǎn)高于其他色素，因此外觀上呈現(xiàn)綠色，但在彩葉植物或者葉綠素缺失植物中，由于其他色素大幅增加或葉綠素大幅減少而呈現(xiàn)彩色或黃色等。植物中存在著數(shù)量巨大的各類突變體，常作為研究植物生理生化機(jī)制與基因組功能的重要材料[1-3]。其中一類葉綠素缺失，植株表型黃化的突變體，稱為黃化突變體[4-5]。由于黃化性狀易觀察，可以直觀呈現(xiàn)植物體內(nèi)葉綠素的多寡，且影響植物光合作用及生長(zhǎng)發(fā)育，因此黃化突變體是研究葉綠素合成代謝的優(yōu)良材料。本研究對(duì)十字花科植物中發(fā)現(xiàn)的黃化突變進(jìn)行分類，總結(jié)黃化突變體形態(tài)結(jié)構(gòu)及光合色素含量的變化規(guī)律，探求黃化形成原因與分子機(jī)制，歸納黃化性狀遺傳模式，為十字花科植物的葉綠素代謝及葉綠體發(fā)育等研究提供參考。

1 黃化突變類型及其外觀特征

1.1 黃化突變類型

1.1.1 葉綠素缺失黃化突變 十字花科植物中已發(fā)現(xiàn)多個(gè)葉綠素缺失導(dǎo)致的黃化突變體。小白菜自交系‘564’和品種‘寒青’‘Hanqing’、‘華冠’‘Huaguan’中均發(fā)現(xiàn)黃化突變體[6-8]。楊沖等[9]從意大利引進(jìn)的甘藍(lán)雜交種Hosom自交分離后代中發(fā)現(xiàn)葉色黃化、植株矮小的突變體YL-1。杜江濤[10]和侯愛琳[11]對(duì)大白菜Brassica rapassp.pekinensisDH系‘FT’進(jìn)行甲基磺酸乙酯(EMS)誘變，分別獲得了穩(wěn)定的黃化突變體lcm2、lcm3。通過(guò)自發(fā)突變、EMS誘變、氮離子束處理等方式，甘藍(lán)型油菜中也獲得了多個(gè)黃化突變體，如ny、bnaC.ygl等[12-15]。楊勝洪等[16]發(fā)現(xiàn)：抽薹期的油菜黃化突變體葉片的葉綠素含量和葉綠素與蛋白質(zhì)比值只有野生型的一半。此外，F(xiàn)RICK等[17]發(fā)現(xiàn)：擬南芥Arabidopsis thaliana的porB-1porC-1雙突變體在子葉期只含有少量的葉綠素a，形成了一個(gè)幼苗致死的黃色表型。

通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)也可獲得黃化突變體。BANG等[18]研究發(fā)現(xiàn)：擬南芥CHL27-T敲除突變體生長(zhǎng)遲緩，并且伴隨著由葉綠體光系統(tǒng)Ⅱ的反應(yīng)中心損壞引起的發(fā)育缺陷。PRIVAT等[19]發(fā)現(xiàn)：反義表達(dá)質(zhì)體SIG2轉(zhuǎn)錄因子的擬南芥植物表現(xiàn)出葉綠素缺失的表征，并且只表現(xiàn)在子葉中。KUMAR等[20]通過(guò)反義表達(dá)HEMA基因，獲得了表現(xiàn)出不同程度葉綠素缺失性狀的擬南芥轉(zhuǎn)基因植株，如葉片斑塊狀黃化和全株黃化。以上研究表明：黃化突變表現(xiàn)為植株全株黃化或部分黃化，且黃化性狀可穩(wěn)定遺傳。

1.1.2 葉綠素缺失白化突變 葉綠素是植物生長(zhǎng)必不可少的光合色素，如果葉綠素缺失突變導(dǎo)致葉綠素完全不可合成，或葉綠素含量無(wú)法保證植株最低程度的光合作用，植株表現(xiàn)出白化，則易發(fā)生致死性突變。KOBAYASHI等[21]報(bào)道了1種類囊體膜脂質(zhì)單氨基半乳糖二酰甘油(MGDG)合成酶1完全缺陷的擬南芥突變體，只在蔗糖存在的情況下才能萌發(fā)為細(xì)小的白化植株，且幼苗缺乏半乳糖，光合膜被破壞，光合能力受損嚴(yán)重。擬南芥白化突變體cfl1的真葉有白色壞死斑點(diǎn)，葉片發(fā)育畸形且不對(duì)稱，葉邊緣缺刻嚴(yán)重，生長(zhǎng)緩慢，植株矮小，結(jié)實(shí)率低[22]。白化突變植株與黃化突變植株相比，葉綠素缺失更為嚴(yán)重，植株生長(zhǎng)受到的影響也更大，甚至導(dǎo)致植株無(wú)法存活。

1.1.3 黃化復(fù)綠突變 在目前發(fā)現(xiàn)的黃化突變體中，部分黃化突變體在生長(zhǎng)過(guò)程中黃化性狀減弱，植株隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸復(fù)綠。郭士偉等[7]發(fā)現(xiàn)小白菜黃化突變體在6葉齡前子葉和真葉均呈淡黃色，在6葉齡后又逐漸復(fù)綠，且不受環(huán)境影響。甘藍(lán)型油菜黃化突變體ny在苗期前期葉片黃化明顯，其后葉色緩慢轉(zhuǎn)變，中后期及衰老期葉片復(fù)綠[23]。黃化突變體復(fù)綠原因現(xiàn)在還未完全探明，需要進(jìn)一步深入研究。

1.2 黃化突變體表型

多數(shù)黃化突變體表現(xiàn)出營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)緩慢，生殖發(fā)育遲緩等現(xiàn)象。擬南芥CHL27敲除后的黃化突變體植株矮小，葉片均勻呈淺綠色，蓮座葉彎曲，開花較晚，角果彎曲[18]；lzf1突變體幼苗葉綠體發(fā)育延遲[24]。青梗菜是小白菜中一類束腰亮綠的優(yōu)質(zhì)品種，其564y突變體播種后5 d出現(xiàn)葉色差異，葉片黃化，下胚軸伸長(zhǎng)，伴隨植株細(xì)弱易倒，大部分生長(zhǎng)指標(biāo)明顯低于野生型[6]。在甘藍(lán)型油菜和芥菜Brassica juncea型油菜中發(fā)現(xiàn)的黃化突變體性狀表現(xiàn)相似，均出現(xiàn)初花期推遲，花期較短等特點(diǎn)[8,25]。甘藍(lán)黃化突變體yl-1，雖然仍能結(jié)球，但單球質(zhì)量只有對(duì)照的39.0%[9]。甘藍(lán)型油菜黃化突變體Bnchd1，苗期葉脈間黃化，抽薹期薹葉呈淡綠色，整個(gè)生命周期內(nèi)植株矮化，葉綠體形態(tài)異常并伴隨著葉綠素提早降解現(xiàn)象，種子產(chǎn)量極低[12]。這些研究表明：黃化突變后植株的生長(zhǎng)及發(fā)育階段轉(zhuǎn)變都受到不同程度的影響。

2 黃化突變體中葉綠體特性及光合性能

2.1 黃化突變?nèi)~綠體超微結(jié)構(gòu)變化

葉綠體由被膜、類囊體和基質(zhì)3部分構(gòu)成，若葉綠體的類囊體受到破壞，植物的光合作用及其他生理過(guò)程都會(huì)受到不同程度的影響。多數(shù)黃化突變體具有類囊體結(jié)構(gòu)變異和基粒片層數(shù)減少等特征[26]。擬南芥FZL基因敲除突變體中類囊體形態(tài)異常，基粒堆疊雜亂，基粒和基質(zhì)類囊體的相對(duì)比例發(fā)生改變[27]。煙草Nicotiana tabacum黃化突變體中葉綠體體積變小，數(shù)目減少并缺乏大部分類囊體膜，部分葉綠體表現(xiàn)出雙重形態(tài)[28]。甘藍(lán)型油菜的bnaC.ygl突變體與正常植株T6的葉綠體形狀都呈正常紡錘狀，但突變體葉綠體的基粒垛疊較少，類囊體膜也明顯減少[14]。部分黃化突變體葉綠體中的嗜鋨顆粒及淀粉粒含量也會(huì)發(fā)生變化。青梗菜564y突變體中葉綠體垛疊數(shù)明顯變少，基粒片層結(jié)構(gòu)難以觀測(cè)，葉綠體淀粉粒數(shù)目較多[6]。甘藍(lán)型油菜黃化突變體中，葉綠體的數(shù)量、形狀、膜結(jié)構(gòu)均受影響，且類囊體缺失，葉綠體內(nèi)無(wú)淀粉粒，嗜鋨顆粒較多，而復(fù)綠的葉片細(xì)胞內(nèi)則與正常葉片表現(xiàn)相近[13]，甘藍(lán)型油菜突變體cr3529中也有類似特征[26]。吳硯農(nóng)[29]對(duì)小白菜黃化突變體BcL14y-1和BcL14y-2研究發(fā)現(xiàn)：BcL14y-1黃化程度較輕，其葉綠體內(nèi)類囊體垛疊數(shù)量有所減少，BcL14y-2黃化程度較重，葉綠體形狀不規(guī)則，除類囊體垛疊數(shù)大量減少外，基粒片層排列混亂，嗜鋨顆粒聚集，有過(guò)量淀粉粒囤積。擬南芥arc突變體的每個(gè)葉肉細(xì)胞只有2～15個(gè)較大的葉綠體，雖然葉綠體個(gè)數(shù)減少，但作為補(bǔ)償，單個(gè)質(zhì)體體積增大，從而保持葉肉細(xì)胞體積恒定[30]。OKAZAKI等[31]研究發(fā)現(xiàn)：擬南芥過(guò)表達(dá)質(zhì)體分裂蛋白(plastid division proteins，PDV)后，葉綠體數(shù)量增加但體積減小，而PDV表達(dá)水平降低則出現(xiàn)相反結(jié)果。正常綠色植物的葉綠體成紡錘狀緊貼細(xì)胞壁，基粒垛疊數(shù)較多且片層結(jié)構(gòu)規(guī)整，有少量淀粉粒和嗜鋨顆粒分布，而黃化突變植株的葉綠體則會(huì)出現(xiàn)不同程度的變異，導(dǎo)致這些變異的原因及分子機(jī)制需要進(jìn)一步深入研究。

2.2 黃化突變體內(nèi)光合色素

多數(shù)表現(xiàn)出黃化性狀的突變體中，葉綠素含量顯著低于野生型，而類胡蘿卜素發(fā)揮了主導(dǎo)作用，因此葉片呈現(xiàn)出黃色表型。葉綠素包括葉綠素a和葉綠素b，在不同的黃化突變體中，兩者質(zhì)量下降幅度有所不同。陳艷麗[14]發(fā)現(xiàn)甘藍(lán)型油菜黃化突變體bnaC.ygl中，葉綠素a和葉綠素b的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別下降了40.3%和57.7%，葉綠素a/b相較非突變品系T6顯著提高，在其他不同的芥菜型油菜黃化突變體和甘藍(lán)型油菜黃化突變體中也有類似表現(xiàn)[9,18,22-23]。在青梗菜黃化突變體pylm中，葉綠素a、葉綠素b質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別下降了62.0%和75.0%，類胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)也下降了58.0%[8]，葉片中的血紅素顯著上升[32]。大白菜黃化突變體lcm2的葉綠素a、葉綠素b質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別下降了60.25%和70.91%[10]，而lcm3的葉綠素a、葉綠素b質(zhì)量分?jǐn)?shù)則分別降低了33.0%和53.0%[11]。從前人研究結(jié)果可以看出：在各類黃化突變體中，葉綠素a和葉綠素b顯著下降，尤其是葉綠素b，因此，葉綠素a和葉綠素b在光系統(tǒng)反應(yīng)中的功能差異及其機(jī)制值得進(jìn)一步研究。

2.3 黃化突變體光合性能

光合作用的能力強(qiáng)弱與植物的生長(zhǎng)發(fā)育及生殖階段轉(zhuǎn)變有關(guān)。在逆境條件下，葉綠素?zé)晒鈪?shù)也是衡量光合能力的重要指標(biāo)[33]，黃化突變通常缺失葉綠素，意味著光合能力降低。與野生型相比，青梗菜564y黃化突變體凈光合速率顯著降低，氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率稍低，胞間二氧化碳摩爾分?jǐn)?shù)稍高，同時(shí)各項(xiàng)熒光動(dòng)力學(xué)參數(shù)均降低[6]。油菜黃化突變體ny五葉期的凈光合速率，心葉僅為野生型的57.96%，平展葉也只有69.62%，同時(shí)各項(xiàng)熒光參數(shù)顯著低于野生型[23]。甘藍(lán)黃化突變體yl-1在苗期時(shí)，凈光合速率顯著低于野生型，而隨著植株生長(zhǎng)，突變體逐漸恢復(fù)部分光合能力，但仍差異顯著[9]。由于葉綠體結(jié)構(gòu)改變及葉綠素含量降低，黃化植株的光合能力總體低于野生型植株。

3 黃化突變遺傳特性及其分子機(jī)制

3.1 黃化突變遺傳特性

黃化突變體的葉綠素合成或葉綠體組成受到影響，多由核基因突變?cè)斐傻?。黃化突變中顯性突變較少。TSANG等[34]構(gòu)建的谷氨酸1-半醛氨基轉(zhuǎn)移酶(GSA-AT)甘藍(lán)型油菜反義構(gòu)建體(GSA)，T1代轉(zhuǎn)基因株系中葉綠素含量減少，T2代轉(zhuǎn)基因株系的幼苗分離為深綠色、淺綠色和黃色3種不同的表型，這表明GSA反義基因?yàn)轱@性遺傳。

多數(shù)黃化突變?yōu)殡[性突變，包括單核隱性突變和多核隱性突變2種類型。甘藍(lán)型油菜黃化突變體bnaC.ygl的黃化性狀由1對(duì)隱性核基因控制，為單核隱性突變[14-15]。芥菜型油菜突變體l638-y的黃化性狀由2對(duì)隱性核基因GR1與GR2控制[25,35]；甘藍(lán)型油菜葉綠素缺失突變體Bnchd1的黃化性狀由2個(gè)隱性基因BnChd1-1和BnChd1-2控制[12]；青梗菜黃化突變體pylm由2對(duì)隱性重疊基因(PY1和PY2)互作控制[8]。

3.2 黃化突變分子機(jī)制

3.2.1 葉綠素合成受阻 黃化突變直接原因?yàn)槿~綠素缺失，因葉綠素合成途徑受阻所致。參考吳自明等[36]對(duì)被子植物葉綠素合成途徑及反應(yīng)所需酶的總結(jié)，整理出以谷氨酸和α-酮戊二酸為原料，依次合成L-谷氨酰-tRNA、谷氨酸酯-1-半醛、δ-氨基酮戊酸、膽色素原、羥甲基膽后色素原、尿卟琳Ⅲ、糞卟啉原Ⅲ、原卟啉原Ⅸ、原卟啉Ⅸ、鎂原卟啉Ⅸ、鎂原卟啉Ⅸ單甲酯、二乙烯原葉綠素酸酯、原葉綠素酸酯、葉綠素酸酯，最終合成葉綠素a和葉綠素b的途徑。

這些中間產(chǎn)物由20多個(gè)基因編碼的15種酶參與合成[37]。甘藍(lán)型油菜葉綠素b缺失突變體cr3529的葉綠素合成受阻于膽色素原合成尿卟啉Ⅲ的反應(yīng)步驟[38]。芥菜型油菜黃化突變體l638-y的黃化性狀主要由葉綠素合成途徑中糞卟啉原Ⅲ-原卟啉Ⅸ位點(diǎn)受阻引起[39]。擬南芥鎂原卟啉Ⅸ甲基轉(zhuǎn)移酶(CHLM)敲除突變體，由于鎂原卟啉Ⅸ下游的阻斷，導(dǎo)致葉綠素生物合成中間物質(zhì)的積累[40]。LARKIN[41]使用除草劑Norflurazon阻止葉綠體發(fā)育，利用LHCB報(bào)告基因在葉綠體沒(méi)有正常發(fā)育的情況下，鑒定了5個(gè)LHCB受抑制的突變體(gun1～gun5)，其中g(shù)un2、gun3、gun4、gun5影響質(zhì)體酶合成所需的4種物質(zhì)以及葉綠素前體物質(zhì)鎂原卟啉Ⅸ的水平。KOBAYASHI等[42]通過(guò)擬南芥葉綠素缺失突變體研究了類囊體脂基質(zhì)主要物質(zhì)MgdG、GgdG合成的關(guān)鍵酶MGD1和DGD1在擬南芥中的表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)MGD1和DGD1的表達(dá)受光誘導(dǎo)，其中細(xì)胞分裂素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和長(zhǎng)下胚軸5介導(dǎo)的光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)都起著關(guān)鍵作用。HUANG等[43]發(fā)現(xiàn)鎂螯合酶(CHLI)的I亞基由擬南芥中的2個(gè)基因CHLI1和CHLI2編碼，CHLI1和CHLI2的雙敲除突變體為白化性狀，而CHLI1單敲除突變體為淡綠色，這表明CHLI2在一定程度上可以替代CHLI1。鎂原卟啉Ⅸ是血紅素和葉綠素的生物合成途徑中的最后1個(gè)共同中間體，因此血紅素合成途徑出現(xiàn)突變，也會(huì)影響葉綠素的合成。青梗菜pylm黃化突變體的葉片血紅素含量顯著高于對(duì)照，說(shuō)明血紅素具有反饋調(diào)節(jié)作用，血紅素過(guò)量積累反饋抑制谷氨酰-tRNA還原酶的活性，抑制δ-氨基酮戊酸的合成[32]。

3.2.2 葉綠體蛋白合成突變 葉綠體的合成是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，多數(shù)葉綠體蛋白由核基因編碼，再通過(guò)細(xì)胞質(zhì)的加工處理，最終在葉綠體內(nèi)發(fā)揮功能[44]。光調(diào)節(jié)鋅指蛋白1(LZF1)在擬南芥脫黃化過(guò)程中起正調(diào)節(jié)作用[45]。擬南芥Dynamin超家族新成員FZL，為類似FZO的1種膜重塑蛋白，其過(guò)表達(dá)后導(dǎo)致類囊體組織缺陷，但其表達(dá)水平不影響葉綠體的形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)[27]。沉默氨酰還原酶(ARSs)后，GluRS和SerRS無(wú)法正常表達(dá)，導(dǎo)致葉綠體異常，類囊體發(fā)育不全，表現(xiàn)出嚴(yán)重的黃化性狀，但許多編碼葉綠體或線粒體靶向蛋白的核基因表達(dá)以及葉綠素的生物合成沒(méi)有改變[28]。

甘藍(lán)型油菜cr3529突變體中，類囊體膜蛋白LHCⅡ的組成未發(fā)生改變，但捕光色素蛋白復(fù)合物含量明顯減少[46]。MIURA等[47]對(duì)擬南芥葉斑突變體var2進(jìn)行了研究，認(rèn)為蛋白質(zhì)合成和降解之間的平衡是導(dǎo)致擬南芥葉色表型的決定因素之一。GUN2和GUN3是已知光致變種hy1和hy2的等位基因，是從血紅素合成植物嗜鉻蛋白所必需的，而GUN5與另一個(gè)鎂螯合酶亞基(ChlI)突變體表型的比較表明：ChlH蛋白在質(zhì)體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中具有特定的功能[48]。擬南芥VAR3基因突變后，體細(xì)胞區(qū)域的葉綠體缺失或發(fā)育遲緩，柵欄細(xì)胞數(shù)量大量減少[49]，在SAKAMOTO[50]的研究中也有類似報(bào)道。SJOGREN等[51]研究證明了擬南芥CLP蛋白酶對(duì)葉綠體發(fā)育和功能起到至關(guān)重要的作用。ZALTSMAN等[52]研究發(fā)現(xiàn)：FTSH蛋白酶在葉綠體生物合成和類囊體的維持中起重要作用，且其中部分FTSH基因可能存在冗余，不同的FTSH基因突變體之間的雜交會(huì)出現(xiàn)白化、不育等多種新的表型。

4 展望

葉綠素是植物進(jìn)行光合作用的主要色素，在光合作用的光吸收中起核心作用。目前模式植物擬南芥中葉綠素合成代謝、葉綠體結(jié)構(gòu)功能已經(jīng)了解得比較清楚。在此基礎(chǔ)上，利用其他十字花科植物黃化突變體，研究十字花科植物黃化形成的分子機(jī)制，將為十字花科植物的相關(guān)研究奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。首先增加葉綠素含量，提高光合效率從而達(dá)到增產(chǎn)目的；其次將葉色變異應(yīng)用于高光能育種研究，避免強(qiáng)光下光系統(tǒng)受到傷害，提高植物對(duì)強(qiáng)光的耐受性；再次利用葉色突變體植物具有的特殊利用價(jià)值，為創(chuàng)造葉色豐富的觀賞品種提供寶貴資源。十字花科植物黃化突變不論在理論研究還是實(shí)踐應(yīng)用方面都將是重要的研究方向。