環(huán)磷酸腺苷生產酵母菌株不同階段RNA的提取改進

李佳蔓，章小毛，郭敬涵，孫思凡，賈玉蝶，鄒少蘭*

1(天津大學 化工學院，天津，300072)2(系統(tǒng)生物工程教育部重點實驗室，天津，300072) 3(發(fā)酵技術國家工程研究中心(天津)，天津，300072)

總RNA提取和制備是各種以RNA為基礎的技術前提。這些技術包括實時熒光定量反轉錄聚合酶鏈式反應(quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR)、RNA測序(RNA-seq)、cDNA文庫構建、Northern雜交分析等。不同技術應用對RNA提取物的質量要求側重點稍有區(qū)別，但毫無疑問，得率越高、純度越高、完整性越好，后續(xù)的各種RNA工作越方便進行。相比細菌，酵母的細胞壁比較厚，難于破碎，如何有效地破碎細胞壁并保證RNA的完整性，是獲得高質量酵母菌總RNA的關鍵問題[1-4]。到目前為止，釀酒酵母RNA提取已經有很多文獻報道，主要方法有(酸)熱酚法[5-6]、水浴法[7]、RNAsnapTM法[8]、一步甲酰胺法[9]等，國內外也開發(fā)了商品化試劑盒[4, 10]。但整體上這些方法首先針對對數期酵母細胞的RNA提取而研發(fā)；非對數生長期細胞[11]，非常規(guī)生長或發(fā)酵條件[2]，各種原因導致的酵母細胞狀態(tài)變化，都會影響RNA提取方法的效率和效果；在RNA得率和質量不能滿足使用基本要求的情況下，提取方法必需先行調整、摸索和優(yōu)化。

釀酒酵母是分子生物學和遺傳學研究的最重要模式生物之一。釀酒酵母在葡萄糖為碳源的豐富培養(yǎng)基中的典型生長曲線，對數生長期(exponential phase, EP)之后有二次生長期(post-diauxic phase, DP)和穩(wěn)定期(stationary phase, SP)[12-13]；3個階段的維持和中間轉換調節(jié)機制有多種，其一是cAMP-PKA信號轉導途徑[13]。cAMP是環(huán)式3′,5′-單磷酸腺嘌呤核苷(3′,5′-cyclic adenosine monophosphate)，簡稱環(huán)磷酸腺苷，是普遍存在于生物機體內并在生物機體的功能調節(jié)中起著十分重要作用的生理活性物質，被稱為第二信使[14]；PKA是酵母蛋白質激酶(protein kinase A)；cAMP-PKA信號轉導途徑涉及細胞生長和發(fā)育調節(jié)，有著極為廣泛的功能[12-14]。

本課題組在多年cAMP-PKA信號轉導途徑研究基礎上獲得了高分泌cAMP的酵母菌株，對影響胞外cAMP產量高低的各種因素進行了初步評價和優(yōu)化[15-17]。在前期釀酒酵母研究過程中，RNA提取與應用是經常性的工作；無論qRT-PCR、Northern雜交分析和cDNA文庫構建等，基本都選擇使用對數生長期細胞，利用商品化RNA提取試劑盒進行提取，所得RNA提取物都能滿足下游使用要求。而在胞外cAMP高產菌株的發(fā)酵機制與代謝調控研究工作中我們發(fā)現：cAMP生產菌株發(fā)酵時間長，cAMP的胞外分泌和積累貫穿生長曲線的上述3個階段[15-17]，僅僅進行對數生長期的分析是遠遠不夠的。為此，我們在前期建立的對數生長期細胞RNA提取與利用基礎上，對比考察了不同生長階段細胞的RNA提取效果，并進行了初步優(yōu)化；本文報告了不同生長階段細胞RNA提取效果的對比及初步優(yōu)化的結果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與引物

釀酒酵母G2為本實驗室前期工作中構建的具有一定胞外cAMP 生產能力的工程菌[17]。本實驗用到的引物對如下：(1)檢測ACT1基因：ACT1-UP：5′-TTATTGATAACGGTTCTGGTATG-3′，ACT1-DW：5′-CC TTGGTGTCTTGGTCTAC-3′，PCR產物預期長度100 bp；(2)檢測CYR1基因：CYR1-UP：5′-GTCTTCCACTTCCTCATCTT-3′，CYR1-DW：5′-TATTATCCTGCTCTC GGTTG-3′，PCR產物預期長度119 bp。引物對使用Primer Premier軟件設計，蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.1.2 培養(yǎng)基與活化培養(yǎng)

YPD培養(yǎng)基(g/L)：酵母抽提物10、蛋白胨A 20、D-葡萄糖20，固體培養(yǎng)基則還需添加瓊脂粉15；均購于上海生工技術有限公司。從甘油管中劃線接種YPD平板活化，30 ℃倒置培養(yǎng)2～3 d至長出單菌落；然后挑取單菌落接種液體YPD培養(yǎng)基，30 ℃、220 r/min培養(yǎng)約16 h；需要時再轉接二次液體培養(yǎng)活化。

1.1.3 試劑與儀器

直徑500 μm玻璃珠(CAT#:11079105，Biospec)；柱式真菌RNAout試劑盒(CAT#:80804-50)、UV型核酸染料綠如藍(CAT#;70303-1.5)、DNase(CAT#:90903-1000)，北京天恩澤；瓊脂糖H(CAT#:9 012-36-6),上海生工；反轉錄試劑盒(CAT#:04897030001)，Roche；熒光定量PCR試劑盒SYBR Green I(CAT#:FP205-02)，TIANGEN。

TU-1810紫外分光光度計，普析通用；S-10酶膜儀，西爾曼科技；BD115恒溫培養(yǎng)箱，Binder；SM-30水平軌道式搖床，Edmund Bühler；FP120細胞破碎儀，Thermo Savant；IID超聲波細胞粉碎機，SCIENTZ；Pico 17高速離心機、88880018渦旋振蕩器，Thermo SCIENTIFIC；Q5000超微量紫外分光光度計，Quawell；P25標準型凝膠電泳儀，Biometra；M030723紫外線透射儀，UVitec；LightCycler 480 II實時熒光定量PCR儀，Roche；2100 Bioanalyzer生化分析儀，Agilent。

1.2 生長曲線測定及分析

使用250 mL搖瓶，裝液量為60 mL YPD培養(yǎng)基；接種新鮮活化種子液，控制起始A600=0.2，30 ℃、220 r/min培養(yǎng)7 d。定時取樣進行如下分析：(1)A600測定；(2)酶膜儀葡萄糖濃度測定，按照說明書操作；(3)鏡檢觀察和計數；(4)以單管分裝菌液，立即凍存于-80 ℃，供總RNA提取用。設置3個重復。結果使用典型的、有代表性的數據。

1.3 酵母細胞壁破碎

1.3.1 珠打法破碎酵母細胞

按設備說明書并參考文獻[4]進行操作。取適量菌液到2 mL細胞破碎儀專用離心管中，10 000×g、1 min、4 ℃離心，棄上清液，細胞沉淀用無菌超純水洗滌3次；500 μL無菌超純水重懸；加入300 μL玻璃珠，振蕩30 s、靜息120 s(期間樣品置于冰上)，1～20個循環(huán)。取適量體積破碎液直接或適當稀釋后鏡檢觀察和計數，計算細胞破碎率；下同。

1.3.2 液氮研磨

同1.3.1收集菌體；參照文獻[1]中的方法，將菌體轉移至研缽中，立即加入適量液氮，迅速研磨至液氮全部揮發(fā)，重復3次研磨操作。用適量無菌超純水重懸研磨后的菌粉，計數。

1.3.3 反復凍融

同1.3.1收集菌體和重懸；參照文獻[1]中的方法，將離心管迅速置于液氮中冷凍3 s，取出后立即于37 ℃水浴解凍，直至菌液徹底融化；重復以上操作3次。

1.3.4 超聲波破碎

同1.3.1收集菌體，1 mL無菌超純水重懸；參照廠家推薦的釀酒酵母破壁參數操作，即超聲波細胞粉碎機功率380 W，工作2 s，間歇3 s，超聲破碎5 min，視鏡檢情況增加處理次數。

1.3.5 渦旋振蕩

同1.3.1收集菌體和重懸；參照本實驗室釀酒酵母DNA提取破壁條件，加入300 μL玻璃珠，渦旋振蕩5 min，視鏡檢情況增加振蕩次數。

1.4 釀酒酵母細胞總RNA提取

取-80 ℃凍存菌液，冰上自然緩慢解凍，按照RNA提取試劑盒說明書進行操作。具體操作步驟如表1所示。

表1 天恩澤柱式真菌RNAout試劑盒RNA提取步驟Table 1 TIANDZ Column Fungal RNAout operating steps

當插入珠打法細胞破碎步驟時，表1步驟1改在同1.3.1里的專用管里進行，然后按步驟2加入試劑，同1.3.1加入玻璃珠后用細胞破碎儀振蕩破碎，繼續(xù)步驟3及后續(xù)提取操作。

1.5 RNA提取物分析

1.5.1 分光光度計測定

按說明書操作，分別測定RNA提取物在230、260、280 nm處的吸光度，并自動計算總RNA的質量濃度(ng/μL)及A260/280、A260/230比值。需要時對樣品進行稀釋。重復3次測定，計算平均值。

1.5.2 瓊脂糖凝膠電泳分析

取800 ng RNA提取物，混合上樣緩沖液后加入到10 g/L瓊脂糖凝膠加樣孔中，在0.5×TAE緩沖液中電泳。核酸染料體積分數0.005%，電泳電壓5 V/cm，電泳時長30 min。電泳結束后利用紫外線透射儀進行分析。

1.5.3 RNA完整值(RNA integrity number，RIN)分析

取1～5 ng RNA提取物，使用生化分析儀，按說明書操作，由蘇州金唯智生物科技有限公司完成。

1.6 qRT-PCR分析

1.6.1 反轉錄

按反轉錄試劑盒說明書進行操作，體系及反應條件如下：(1) 2 μg RNA，1 μL Oligo dT，補RNase free H2O至13 μL，65 ℃保溫10 min；(2) 冷卻后加入如下組分：4 μL 5×Transcriptor Reverse Transcriptase Reaction Buffer，0.5 μL Protector RNase Inhibitor，2 μL Deoxynucleotide Mix，0.5 μL Transcriptor Reverse Transcriptase，輕輕吹打混勻，先50 ℃保溫60 min，然后85 ℃保溫5 min。

1.6.2 qRT-PCR分析

按qPCR試劑盒說明書進行操作，體系及反應條件如下：(1) 25 ng核酸模板(RNA提取物或cDNA)，0.3 μmol/L上游引物，0.3 μmol/L下游引物，10 μL SYBR Green I，補水至20 μL；(2) 95 ℃ 5 min；95 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，40個循環(huán)。

2 結果與分析

2.1 釀酒酵母G2在YPD培養(yǎng)基中的生長和糖耗曲線

菌株G2在20 g/L葡萄糖培養(yǎng)基YPD中的生長和糖耗曲線如圖1所示。葡萄糖在20 h左右耗盡；綜合糖耗和生長情況，生長3階段對應時段分別為：對數生長期(EP)9～20 h，二次生長期(DP)20～48 h，48～60 h間進入穩(wěn)定期(SP)。

圖1 酵母菌株G2在YPD中的生長和糖耗曲線Fig.1 The growth curve and glucose curve of strain G2 in YPD medium

2.2 三階段菌液試劑盒方法提取總RNA效果對比

為了簡化情況，不同階段總RNA提取效果的分析選擇3個時間點菌液進行(16、36、60 h)；分別對應和代表圖1所示生長3階段。RNA提取效果通過如下3個方面的分析和相應指標進行對比判斷。

2.2.1 分光光度計測定和得率計算

RNA提取物的分光光度計測定和相應得率計算結果如表2所示。一般認為若A260/280值在1.9～2.1、A260/230值在2.0附近，表明樣品純度較好，沒有明顯的碳水化合物(糖類)、鹽類、有機溶劑污染或蛋白殘留。由表2可知，3個時間點RNA提取物樣品都沒有明顯的核酸以外前述物質的污染，純度較好；3個時間點的得率差異極為顯著。

表2 不同時間RNA提取物吸光度測定值和得率Table 2 RNA absorbance and yield at different growth times

2.2.2 RNA提取物電泳

RNA提取物樣品的瓊脂糖凝膠電泳結果如圖2所示。16 h RNA提取物樣品28S、18S、5S條帶清晰，而36 h則出現了顯著的變化，條帶相對彌散、模糊。需要說明的是60 h RNA提取物樣品濃度太低，給電泳、反轉錄和qPCR各環(huán)節(jié)與16、36 h RNA提取物樣品完全平行的操作設計帶來很大不便，同時也影響它自身效果判斷；尤其電泳上樣量大，因此這里放棄了60 h RNA提取物樣品的電泳分析。

圖2 RNA提取物瓊脂糖凝膠電泳Fig.2 Agarose gel electrophoresis of RNA extractions

2.2.3 qPCR測試和RNA提取物DNA污染判斷

RNA提取物里的DNA污染情況是判斷RNA提取物質量和確定其能否被正式使用的關鍵環(huán)節(jié)。簡單的檢測方式是以RNA提取物為模板進行常規(guī)PCR反應，瓊脂糖凝膠電泳觀測不到目的條帶時，視為RNA提取物里的DNA污染可以忽略。本實驗為了便于量化比較不同階段RNA提取物的DNA污染程度，同時量化比較DNA污染對不同表達豐度基因定量PCR的背景干擾程度，選擇qPCR方式進行DNA污染檢測。在預實驗分析的基礎上，選擇ACT1基因和CYR1基因分別為高、低豐度表達的基因代表，使用引物對ACT1-UP/ACT1-DW、CYR1-UP/CYR1-DW，分別以RNA提取物和反轉錄所得cDNA樣品為模板，控制相同的核酸模板量和完全一樣的條件進行qPCR。2種模板對應CP(crossing point)值的差值簡寫為ΔCP(RNA-cDNA)。CP值和ΔCP(RNA-cDNA)結果分別如圖3和圖4所示。

圖3 不同時間CP值Fig.3 CP value change during different growth times

圖4 qPCR方法檢查RNA提取物DNA污染情況Fig.4 RNA purity test by qPCR method

由圖3和圖4可知，ACT1基因和CYR1基因的表達中，以RNA提取物為模板的CP值一般認為≈35或≥35，說明RNA提取物中無DNA污染或其中DNA污染可以忽略；圖3顯示16 h樣品DNA污染可以忽略，而36 h和60 h樣品則存在一定程度的DNA污染；如圖4所示ΔCP(RNA-cDNA)的變化，說明基因的表達水平隨時間延長而下降，同時來自DNA污染的背景干擾相對增加；而ACT1基因的ΔCP遠遠高于CYR1基因的ΔCP，說明DNA污染所致背景干擾的程度與基因表達豐度有關，豐度越高、DNA污染背景干擾程度相對越低，反之亦然。

2.3 五種酵母細胞壁破碎效果比較

上述結果初步證明3個階段的RNA提取物得率、完整性和DNA污染程度彼此差異顯著；對數期細胞能很容易地獲得較好的提取效果，工作方便，無需進一步純化就能用于下游應用。另外2個階段的菌液RNA提取首要問題是得率低，其次是存在完整性和DNA污染問題。

如前言所述，細胞壁的有效破碎和RNA完整性之間是一個矛盾；而DNA污染問題則可以通過DNase消化解決。因此，本文首先嘗試從提高細胞破壁率的角度來改進36 h和60 h細胞的RNA提取效果。參考文獻[1-4]選擇珠打法(bead beating)、液氮碾磨、反復凍融、超聲波破碎和加玻璃珠渦旋振蕩5種方法，首先檢查對60 h細胞的破壁效果，然后結合使用破壁步驟和試劑盒提取RNA。由表3和圖5可知，以破壁率來說，珠打方法破壁效果最好，玻璃珠渦旋振蕩和液氮研磨次之；反復凍融和超聲波破碎方法過低，放棄進一步考察；對所得破碎細胞液進一步進行RNA提取操作，玻璃珠渦旋振蕩方法不僅得率低，RNA完整性也較珠打和液氮研磨方法差。綜上，選擇珠打破壁法用于后續(xù)的實驗。

表3 不同破壁方法細胞破壁率和相應RNA提取效果比較Table 3 Comparison of cell wall disruption ratio and RNA extraction yield and quality by different methods

1-珠打；2-液氮研磨；3-渦旋振蕩圖5 三種破壁方法所得RNA提取物瓊脂糖凝膠電泳Fig.5 Agarose gel electrophoresis of RNA extractions by three cell wall disruption methods

2.4 珠打法破壁改進總RNA提取效果

2.3的結果與文獻報道一致，證明珠打勻漿法是最常用也是最有效的酵母細胞破壁方法之一[1-4]。我們進一步按1.3.1里的操作，取適量上述36和60 h菌液進行更細致的破壁條件摸索；重點調整破壁處理循環(huán)數，以確保細胞破壁率在99%以上；然后根據1.4 插入優(yōu)化的珠打勻漿步驟進行RNA提取。所得提取物樣品仍然從同上的3個方面進行評價；為考察RNA提取物能否滿足轉錄組學測序要求，還進行了RIN測定。

2.4.1 分光光度計測定值和得率

RNA提取物的分光光度計測定和相應得率計算結果如表4所示，16 h樣品RNA提取物得率沒有明顯變化，但36、60 h樣品的RNA提取物得率則分別為2.2.1中得率的5.71、8.60倍，上升顯著；A260/280、A260/230比值反映出RNA提取物純度較高、沒有明顯的核酸以外物質的污染。

表4 不同時間RNA提取物吸光度測定值和得率Table 4 RNA absorbance and yield at different growth times

2.4.2 RNA提取物電泳和RIN分析

RNA提取物樣品的瓊脂糖凝膠電泳結果如圖6所示。16 h RNA提取物條帶清晰，且28S與18S RNA倍性關系明顯，RNA完整性較好；36 h RNA提取物效果較圖2有顯著改進，28S與18S RNA倍性關系略差于16 h RNA提取物；60 h RNA提取物樣品28S、18S、5S三帶依稀可見，效果與圖2中36 h RNA提取物接近。

圖6 RNA提取物瓊脂糖凝膠電泳Fig.6 Agarose gel electrophoresis of RNA extractions

為進一步確認RNA提取物完整性能否達到進行轉錄組學測序分析要求，樣品提交蘇州金唯智生物科技有限公司公司使用生化分析儀和RNA芯片進行了分析，結果顯示16、36、60 h樣品RNA提取物RIN分別為8.8、7.4和5.3，28S/18S (Area)分別為1.7、1.5和1.6；16、36 h樣品能通過該公司進行轉錄組學測序分析的質控要求；而60 h樣品則不能通過。另外，圖2所示試劑盒方法提取16 h RNA樣品也能通過質控檢查，完全達到測序分析要求。

2.4.3 qPCR測試和RNA提取物DNA污染判斷

測試CP值結果如圖7和圖8所示。需要說明的是ACT1基因和CYR1基因的表達：(1) 以RNA提取物為模板的CP值,除了16 h樣品CP值分別為37.30、ND(檢測不到)，36 h和60 h樣品CP值都在34.71～36.07，說明RNA提取物中的DNA污染干擾都可以忽略不計，無需DNase消化；(2)圖7說明2個基因在3個階段都維持表達，表達水平隨時間延長略有下降；(3)2個基因的ΔCP(RNA-cDNA) 值都隨時間延長而下降，說明表達水平隨時間延長而下降的同時，來自DNA污染的背景干擾相對增加；(4)ACT1基因的ΔCP值明顯高于CYR1基因的ΔCP值，說明基因表達豐度越高，DNA污染背景干擾程度相對越低，反之亦然。

圖7 cDNA為模板的CP值Fig.7 CP value change by cDNA as template

綜合前述結果，試劑盒提取方法能完全滿足16 h對數生長期細胞RNA提取的得率和質量要求；而添加珠打破壁步驟，則進一步解決了36 h二次生長期細胞和60 h穩(wěn)定期細胞RNA提取得率和DNA污染問題，36 h樣品還能滿足RNA測序完整性要求。然而，還存在如下一些問題需要說明和進一步研究予以明確。

圖8 qPCR方法檢查RNA提取物DNA污染情況Fig.8 RNA purity test by qPCR method

2.4.3.1 RNA提取得率和質量要求

確如吳思琪等[3]所述，總RNA的人工手動提取和試劑盒提取各有利弊。手動提取不存在試劑盒的最低菌體細胞量和最小洗脫體積限制，總RNA得率有望遠高于試劑盒提?。坏噭┖蟹椒ǚ奖銓⑿》肿与s質、大分子蛋白質以及DNA等一并去除，直接得到純度相對更高的樣品，省卻后續(xù)人工提純步驟。本團隊前期也做過一些方法的對比，最終確定在得率和純度能滿足下游應用要求的前提下，優(yōu)先使用試劑盒，其相對快速便捷、全程不到30 min(表1)；更方便控制人為操作誤差，相對穩(wěn)定。

本研究中，RNA質量是從滿足2個方面的應用——qRT-PCR和轉錄組學測序完整性要求來進行評價的。qRT-PCR上，DNA污染程度和造成的背景信號干擾程度，是相對于基因的表達豐度而言的；為了同時量化對比不同階段RNA提取物質量和DNA污染對不同表達豐度基因qPCR的背景干擾程度，我們選取了ΔCP (RNA-cDNA)指標，用于評價基因以及qPCR體系的設計，以控制CP值在合理的范圍內為原則。相比于得率，DNA污染實際是一個相對次要的問題，通過DNAase消化即能解決；但DNAase消化后的進一步提純則是一個需要慎重考慮的問題，因為提純無疑會增加操作步驟、降低得率，使試劑盒優(yōu)勢大打折扣。

一般認為，振蕩是破碎酵母細胞壁的一個有效方法，但在提高得率的同時，可能與RNA完整性矛盾，因此，必需小心控制振蕩的條件[1-4]。本研究中，參考文獻[1-4]選擇的5種方法對比考察證明了珠打法破壁的優(yōu)勢，即操作快速簡便、能同時多管操作和提高破壁率。如圖2、圖6和RIN測定結果所示，珠打法對16 h對數生長期細胞沒有明顯效果，一方面說明試劑盒就能很好解決對數生長期細胞的破壁問題，另一方面也說明珠打本身不會特別導致RNA斷裂而破壞RNA完整性；而珠打法處理的36 h細胞RNA提取物也能達到轉錄組學測序要求，更說明了本研究中的珠打步驟沒有明顯影響RNA完整性。

2.4.3.2 三個階段細胞及RNA提取差異分析

本研究選取了3個時間點對應3個階段，來說明細胞狀態(tài)變化對RNA提取得率與質量的影響。事實上這僅僅是一個初步調查；適當延長培養(yǎng)時間，縮短取樣間隔，適當增加分析取樣點和檢測指標，能更準確地劃分各個生長階段，更完整、可靠地反映整個生長曲線過程中的變化規(guī)律；而本研究菌株在生長過程中分泌的胞外cAMP，對整個階段細胞狀態(tài)進而對RNA提取的影響，還有待更深入的調查。

2.5.3.3ACT1基因表達

ACT1基因是人們常用的釀酒酵母qRT-PCR分析內參基因之一；但事實上有研究報道整個生長或發(fā)酵階段它的表達并不穩(wěn)定，尤其穩(wěn)定期甚至檢測不到，因此被認為它并不是最合適的內參基因[18-19]。本研究中，基于3階段RNA提取物及其cDNA為模板的預實驗結果，將其選作高豐度表達的基因代表，而圖3和圖6的結果則進一步證明了ACT1基因在穩(wěn)定期仍然維持較高水平的表達。本研究使用的菌株cAMP生產相關性能應該是本研究結果與文獻報道不同的主要影響因素之一。進一步的分析還在進行中。

3 結論

綜上，本研究考察了cAMP生產酵母菌株G2在YPD培養(yǎng)基中不同生長階段的總RNA提取效果，并進行了初步改進研究。選擇16 h對數生長期細胞、36 h二次生長期細胞和60 h穩(wěn)定期細胞，分別用試劑盒提取，RNA得率依次為1 010.6、171.5和91.3 ng/A600。以ACT1和CYR1為高、低豐度表達的基因代表，進行qRT-PCR的同時判斷DNA污染情況；瓊脂糖電泳和RIN測定判斷完整性；結果顯示36 h和60 h RNA提取物都存在DNA污染和完整性較差問題。添加珠打破壁步驟破碎細胞，顯示對16 h細胞的RNA提取效果沒有明顯變化，但36 h和60 h得率分別提高至979.6和785.6 ng/A600，為前述值的5.71倍和8.60倍，且樣品純度能滿足qRT-PCR要求，36 h樣品能滿足RNA測序要求。分析細胞3個階段中的狀態(tài)變化是決定RNA提取階段性特征的根本原因。本研究結果將有助于推動建立酵母生長全階段RNA分析技術和深化cAMP途徑相關調控機制的認識。