家兔輸尿管機械損傷后狹窄模型的建立與分析

王子國 張洪明 薛少軍 陸克義 劉院剛 劉祥辰 隋婧婧 劉煥茹 李險峰△

（1 山西醫(yī)科大學，第一臨床醫(yī)學院，2 第一醫(yī)院放療科，3 第一醫(yī)院核醫(yī)學科，太原 030001； 4 邯鄲市第一醫(yī)院普外科，邯鄲 056002）

醫(yī)源性輸尿管損傷后狹窄是泌尿外科常見疾病之一。隨著微創(chuàng)外科學的蓬勃發(fā)展，伴隨而來的醫(yī)源性輸尿管損傷發(fā)病率明顯增加[1]。國內(nèi)外報道醫(yī)源性輸尿管損傷概率達60%～94%[2-3]，輸尿管損傷后約30%可發(fā)展成為輸尿管狹窄[4]，輸尿管狹窄一旦出現(xiàn)多需手術(shù)干預，重復的器械操作加重輸尿管損傷[5]。近年來輸尿管狹窄的治療取得較大的進展，而構(gòu)建理想的動物模型是臨床前研究的基礎，因此，模擬醫(yī)源性輸尿管損傷后狹窄的動物模型的成功構(gòu)建顯得尤為重要。常用造模方法有單側(cè)輸尿管完全梗阻法、電凝損傷輸尿管法等[6-12]，這些造模方法無法觀察輸尿管損傷后的病理改變及輸尿管逐漸狹窄引起腎盂積水、腎衰的全過程。另外，對操作的精準性要求高且輸尿管管徑小的動物不適用。因此，建立一種操作簡單、成功率高且能模擬輸尿管狹窄發(fā)生發(fā)展的造模方法是目前研究迫切所需的。本實驗對家兔左側(cè)輸尿管機械性損傷，研究輸尿管損傷后病理學改變、細胞因子表達，證明機械性損傷輸尿管后狹窄模型能夠為臨床前研究提供實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及模型制作

所有實驗均按照山西醫(yī)科大學動物研究委員會的指導原則和實驗動物保護原則進行。所有動物均為成年雄性家兔20只，月齡6月，體質(zhì)量2.5 ～ 3 kg（由山西醫(yī)科大學動物實驗中心提供）。術(shù)前靜養(yǎng)15 d 讓動物充分適應環(huán)境。實驗前動物禁食12 h，禁水4 h，術(shù)前半小時肌肉注射頭孢西丁 13.3 mg/kg預防感染，1%戊巴比妥鈉 30 mg/kg 肌注麻醉，備皮、消毒、鋪洞巾，從恥骨聯(lián)合沿腹中線做3 ～4 cm長切口，打開腹腔，辨認輸尿管，并在髂血管分叉處找到輸尿管，用玻璃分針分離輸尿管，游離出一段長約1.5 cm 輸尿管，用1 mL注射器針頭插入輸尿管管腔，鋼尺測量1 cm后將 1 mL注射器針頭穿出管腔，沿針頭挑起輸尿管長軸，縱行切開1 cm，見尿液流出，用6-0 Prolene線橋接縫合，待輸尿管切口下方無菌紗布干燥無尿液漏出后回納輸尿管，并在輸尿管損傷處對應腰大肌包埋鉛點，關(guān)閉腹腔。所有手術(shù)均由同一位外科醫(yī)生實施，目的是保證所有動物輸尿管損傷的長度和深度一致。

1.2 主要試劑和設備

復方泛影葡胺注射液購自湖南漢森制藥股份有限公司，核素顯像劑DTPA 藥盒購自中國原子能科學研究院，Masson 染色試劑盒購自Phygene 公司，Smooth Muscle Actin-Specific Antibody（α-SMA）、抗兔/鼠HRP 標記聚合物試劑、兔抗人Ⅰ型膠原（COL1A2）、Ⅲ型膠原（COL3A1）、轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）抗體均購于武漢三鷹生物有限公 司（Proteintech Group， Inc）。Trizol 試 劑、TB Green? Premix Ex Taq? （Tli RNase H Plus）試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TaKaRa。BCA 蛋白質(zhì)購自碧云天生物有限公司。免疫印跡成像應用奧德賽（Odyssey）紅外激光成像系統(tǒng)，PCR 儀使用美國Applied Biosystem。靜脈腎盂造影采用日本島津株式會社的Sonialvision Safire 7 進行拍攝。核素腎動態(tài)顯像選用可變角雙探頭單光子發(fā)射計算機斷層成像設備（型號：NET632，北京永新醫(yī)療設備有限公司）。

1.3 靜脈腎盂造影方法

分別在造模前和造模完成后7、21、49 d 行靜脈腎盂造影檢查，1%戊巴比妥鈉 30 mg/kg，肌注麻醉，采用76%泛影普胺注射液1 mL/kg，靜脈推注，推注時間不超過2 min，于2 min、15 min、30 min 拍攝雙腎、輸尿管及膀胱影像。將腎盂積水程度分級，即輕度、中度及重度。由中級職稱影像醫(yī)師閱片和比較。

1.4 核素腎動態(tài)顯像檢查

在造模前和造模完成后7、21、49 d 行核素腎動態(tài)顯像檢查，動物麻醉后，動物取俯臥位，拍照視野包括雙腎、輸尿管和膀胱，耳緣靜脈“彈丸”注射99mTc-DTPA 74×107Bq（3mCi）后即啟動計算機采集，矩陣64×64，每2 s 1 幀，采集30 幀為血流灌注相，隨后每60 s 1 幀，采集20 幀，為腎功能相，利用計算機軟件，通過勾畫感興趣區(qū)技術(shù)處理圖像。

1.5 病理組織染色

取左腎石蠟包塊，行2 μm 切片，行H-E 染色。取正常輸尿管及損傷愈合區(qū)輸尿管行2 μm 切片進行Masson 染色：常規(guī)脫蠟后蒸餾水清洗，核染液渲染2 min，1%鹽酸乙醇分化1 s，漿染液染色 6 min，分色液分色1 ～3 min，復染液染色5 min脫水透明封片。

1.6 免疫組織化學顯色

將石蠟切片脫蠟至水，抗原修復結(jié)束后在修復液中自然冷卻。然后用TBS 沖洗滴一抗稀釋液稀釋一抗，室溫孵育1 h。。滴加二抗，37℃孵育30 min。DAB 顯色后蒸餾水洗終止。蘇木精復染 3 min。1%鹽酸酒精分化1 s，氨水分化1 s。各級乙醇脫水，每級5 min。取出后置于二甲苯10 min，2 次，用封片。

1.7 RT-PCR

液氮研磨法將組織研磨成粉狀后，用TRIzol試劑提取總RNA，接著應用反轉(zhuǎn)錄試劑盒，將2 μg RNA反轉(zhuǎn)成cDNA。實時定量PCR 使用TB Green Premix Ex Taq 試劑盒，所用引物如表1 所示，反應體系為25.5 μL（上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，cDNA 1.0 μL，Rox 參比染料0.5 μL，雙鏈嵌合熒光染色試劑TB Green 12.5 μL，去離子水10.5 μL）。條件：95℃預變性10 min；95℃，15 s，60℃，1 min，40 個循環(huán)。以對照組中的GAPDH為內(nèi)參照，采用2-△△Ct法計算各組相對表達量。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

圖1 模型兔在術(shù)前（A）、術(shù)后7 d（B）、21 d（C）、49 d（D）靜脈腎盂造影圖片。虛線箭頭為損傷側(cè)腎盂位置，實線箭頭為未損傷側(cè)腎盂位置，黑點（鉛點）為手術(shù)損傷輸尿管狹窄位置。B、C 分別為術(shù)后7、21 d，中度腎盂積水（腎小盞扁平成球狀或囊狀）。D 為術(shù)后49 d，重度腎盂積水（腎盂腎盞連成一體）.Fig 1 Intravenous pyelograms of rabbit model during the 7th day， 21st day， and 49th day after surgery and before surgery（A）. The dotted arrow indicated the location of the renal pelvis on the injured side， the solid arrow indicated the location of the renal pelvis on the non-injured side， and the black dot （lead point） indicated the location of the surgically injured ureteral stricture. B and C were pictures on the 7th day and 21st day after surgery， respectively， with moderate hydronephrosis （renal calyx flattened into a ball or sac）. D was a picture on the 49th day after surgery， with severe hydronephrosis （the renal pelvis and calyces are integrated into one）.

1.8 免疫印跡檢測

將組織從液氮中取出，研缽充分研磨后，加入適量含蛋白酶抑制劑Cocktail 的RIPA 裂解液，使用超聲波破碎儀進一步充分裂解。離心機14 000 r/min 離心15 min，取上清液。BCA 蛋白質(zhì)測定法測定蛋白質(zhì)濃度。計算上樣體積加入上樣緩沖液后，100℃水浴鍋中煮5 min。10% SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白后，轉(zhuǎn)膜，接著5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，孵育一抗4℃過夜。次日TBST 洗膜后，熒光二抗避光孵育2 h。按成像要求步驟曝光。使用Image J軟件，分析目的條帶和內(nèi)參GAPDH 條帶的灰度值，計算蛋白的相對表達量。

1.9 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0 統(tǒng)計分析軟件處理，所有數(shù)值均表示為±s。通過單因素方差分析或獨立樣本t檢驗比較各組間差異。應用非參數(shù)檢驗對非正態(tài)分布數(shù)據(jù)進行分析。P＜0.05 被認為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

手術(shù)后2 只模型兔在術(shù)后8 d 因腹瀉死亡。剩余模型兔在術(shù)后49 d 沒有明顯的異常反應。

2.1 家兔腎輸尿管形態(tài)學

模型兔在術(shù)前行靜脈腎盂造影顯示雙側(cè)輸尿管通暢，腎盂正常，在術(shù)后7 d 首次行靜脈腎盂造影時除1 個動物模型輸尿管不顯影以外，其余動物模型輸尿管顯影均可。術(shù)后7、21、49 d 損傷側(cè)腎盂積水隨著時間的延長逐漸加重，輸尿管損傷處以下不顯影，損傷處以上輸尿管迂曲、擴張，直至實驗49 d 結(jié)束時腎盂出現(xiàn)重度積水（圖2）。損傷側(cè)腎盂積水在術(shù)后7、21、49 d 不斷加重，中位數(shù)分級評分分別為1、2 和3（P＜0.01）（圖2）。

圖2 術(shù)前和術(shù)后7、21、49 d 腎盂積水程度比較Fig 2 Degree of hydronephrosis， pre-operation vs post-operation on the 7th， 21st and 49th day of hydronephrosis

2.2 家兔腎功能學

模型兔隨著時間延長，左側(cè)腎僅見皮質(zhì)顯影，腎小球濾過率（GFR）、腎攝取率（Ut）逐漸降低，達峰時間（Tp）、半排時間（T1/2）逐漸延長。損傷側(cè)腎GFR、Ut 術(shù)后7、21、49 d 逐步降低（P＜0.01）（圖3 A，表2）；損傷側(cè)腎Tp、T1/2 時間術(shù)后7、21、49 d 逐漸延長（P＜0.01）（圖3B，表2）。

2.3 H-E 染色

腎積水是輸尿管狹窄后的典型表現(xiàn)，會使腎功能惡化。在輸尿管機械性損傷后49 d，將模型兔處死并收集左側(cè)腎。標本形態(tài)顯示重度腎積水（圖4 A1-A2，見封二）。H-E 染色顯示：大量膠原沉積，腎小球萎縮和腎小管擴張，并且發(fā)現(xiàn)腎小球血管和腎間質(zhì)纖維化（圖4 B1-B2，見封二），而未損傷腎則無改變。

2.4 Masson 染色與α-SMA 免疫組織化學顯色

模型兔輸尿管愈合重塑區(qū)α-SAM 呈高表達；Masson 染色示該區(qū)域為藍色，存在膠原纖維沉積，重塑區(qū)有黏膜上皮再生（圖4 C1-C8，見封二）。

2.5 RT-PCR、免疫印跡測定

通過實時PCR 測定纖維化標記基因Ⅰ型膠原、Ⅲ膠原、轉(zhuǎn)化生長因子-β1 的表達水平，并用Western-bloting 進行驗證。結(jié)果顯示：動物模型左側(cè)輸尿管重塑區(qū)域Ⅰ型、Ⅲ膠原、TGF-β1 表達量較右側(cè)正常輸尿管表達明顯升高（P＜0.01，圖5）。

圖3 家兔核素腎動態(tài)顯像數(shù)據(jù)分析Fig 3 Data analysis of radionuclide imaging in rabbits

表2 核素腎動態(tài)顯像在各時間段腎參數(shù) （n=18， ±s）Tab 2 Renal parameters of radionuclide renal dynamic imaging at various time periods（n=18， ±s）

表2 核素腎動態(tài)顯像在各時間段腎參數(shù) （n=18， ±s）Tab 2 Renal parameters of radionuclide renal dynamic imaging at various time periods（n=18， ±s）

**P＜0.0001；△P＞0.05. GFR：glomerular filtration rate；Ut：divided renal uptake rate；Tp：Peak time；T1/2：half-time

Item Pre-operation 7 d 21 d 49 d GFR（ml/min/1.73m2 ） 40.77±6.89 25.62±9.65**△ 20.34±7.28** 12.72±3.24**Ut（%） 4.48±0.75 2.89±1.00**△ 2.46±1.09** 1.45±0.37**Tp（min） 3.94±1.55 15.99±4.38**△ 16.88±2.68** 20.33±2.11**T1/2（min） 0.88±0.41 8.56±4.13**△ 12.56±4.99** 17.19±4.09**

3 討論

3.1 輸尿管機械性損傷后狹窄模型建立的必要性及其優(yōu)勢

輸尿管狹窄多為醫(yī)源性所致[13]，隨著微創(chuàng)外科的發(fā)展，造成輸尿管損傷后狹窄發(fā)病率逐年升高，且治療效果差。因此，對輸尿管損傷后狹窄機制的研究具有重要的臨床意義，而建立成功的輸尿管狹窄模型是其研究的基礎。

圖 5 家兔輸尿管損傷愈合處與正常輸尿管TGF-β1， Ⅰ、Ⅲ膠原的mRNA、蛋白表達Fig 5 Expression of TGF-β1， Ⅰ and Ⅲ collagen of mRNA and protein in rabbit ureteral injury healing site and normal ureteral

輸尿管狹窄動物模型的建立有多種方法[6-12]，如單側(cè)輸尿管完全梗阻法、腰大肌掩埋法、套管法、不全結(jié)扎法、電凝損傷法等。這些方法雖然造模過程簡單，但模型建立后輸尿管再通具有不可逆性，且在臨床中，無法再開展擴張術(shù)、內(nèi)切開術(shù)、支架置入術(shù)等治療進行再通。同時，這些模型不能觀察到輸尿管損傷后病理及分子生物學改變及輸尿管逐漸狹窄致腎盂積水、腎衰的全過程，與臨床中輸尿管狹窄的發(fā)生發(fā)展過程差異較大。而電凝損傷輸尿管模型，雖能模擬輸尿管損傷后的病理改變，但對操作的精準性要求高，且造模難達到一致性，容易引起輸尿管漏，對輸尿管管徑小的動物不適用，且操作設備昂貴，本實驗根據(jù)Bartone[14]和Lepp?niemi[15]前期研究的造模方法加以改進，尚能彌補以上造模的不足，且成本低。并在損傷輸尿管處所對應腰大肌上縫置包埋鉛點，標記損傷區(qū)域，為后期影像學檢查提供參考，還可為體外照射提供定位。

3.2 家兔在輸尿管機械性損傷后狹窄疾病演變過程

輸尿管完全梗阻后腎功能進行性下降，56 d 時腎功能幾乎完全喪失[16]，本研究靜脈腎盂造影發(fā)現(xiàn)模型兔在輸尿管損傷后7 d 時顯影通暢，狹窄部位以上的輸尿管迂曲、管腔擴張，并隨著時間延長輸尿管狹窄段以下不顯影，腎盂積水逐漸加重，提示輸尿管狹窄處可能有瘢痕組織增生；核素腎動態(tài)顯像結(jié)果顯示模型兔隨著時間的延長左腎僅見皮質(zhì)顯影， 左腎GFR、Ut 逐漸減低，而Tp 時間、T1/2時間逐漸延長，提示輸尿管狹窄后繼發(fā)了腎單位濾過和排空功能的下降，證明造模是成功的；在該實驗術(shù)后49 d 取模型兔輸尿管損傷側(cè)腎行病理學研究發(fā)現(xiàn)該側(cè)腎組織萎縮、皮質(zhì)變薄、腎錐體消失，鏡下觀察腎葉間纖維化，大量膠原沉積，腎小球萎縮和腎小管擴張。

研究證實損傷后輸尿管愈合區(qū)被過度增殖的成纖維細胞及沉積的膠原纖維所代替[17-19]，后期肌成纖維細胞分化、膠原纖維的過度合成致細胞外基質(zhì)成分改變，引起輸尿管愈合區(qū)瘢痕攣縮，導致輸尿管狹窄[20]。此外，輸尿管完全愈合至少需要 42 d[21]。本研究在造模后49 d 行病理組織學檢查，發(fā)現(xiàn)輸尿管管腔已完全愈合，愈合區(qū)完全被輸尿管黏膜上皮覆蓋。

3.3 機械性輸尿管損傷后狹窄兔模型病理及生理過程分析

TGF-β1 可促進成纖維細胞和其他類型細胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞[22]，并具備強收縮性，此時α-SMA 表達陽性。而肌成纖維細胞可產(chǎn)生Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白和其他基質(zhì)分子[23]，是引起輸尿管愈合區(qū)瘢痕攣縮及纖維化的關(guān)鍵物質(zhì)。我們對輸尿管損傷后重塑區(qū)進行TGF-β1、α-SMA、Ⅰ型和Ⅲ型膠原分析，發(fā)現(xiàn)損傷側(cè)呈高表達，結(jié)合Masson、α-SMA 免疫組化染色，說明輸尿管損傷后狹窄是成纖維細胞后期分化成肌成纖維細胞及其表達膠原纖維造成的。

輸尿管損傷后重塑區(qū)域主要為成纖維細胞、肌成纖維細胞的增殖和膠原蛋白的產(chǎn)生形成的瘢痕組織，并導致細胞間電信號的傳導和蠕動波的形成受阻，平滑肌肌束稀疏菲薄及細胞外基質(zhì)微環(huán)境改變損害區(qū)域神經(jīng)組織[24]，從而影響蠕動波的傳遞使腎盂積水逐漸加重。后期研究可以嘗試通過減少其成纖維細胞、肌成纖維細胞生成或阻斷膠原蛋白的產(chǎn)生，從而改善輸尿管狹窄以及產(chǎn)生的腎功能損害提供理論依據(jù)。

3.4 不足之處

該實驗的不足之處是未設置假手術(shù)組，但該實驗術(shù)前已行腎功能學及形態(tài)學檢測，本實驗主要是采取自身前后對照進行數(shù)據(jù)分析?？傊覀冄芯勘砻鳈C械性損傷輸尿管后狹窄造模更好的模擬輸尿管損傷后狹窄發(fā)病的全過程，該方法操作簡單、成本低、成功率高，且能模擬輸尿管狹窄疾病發(fā)生發(fā)展的動態(tài)全過程等優(yōu)點，能為輸尿管狹窄的實驗研究提供良好的研究模型。

圖版說明（見封二）

圖4 A2 為 A1 腎剖開圖片，損傷側(cè)整個腎呈一個囊狀，而對側(cè)正常（黃色箭頭是輸尿管損傷后狹窄區(qū)域）； B1 為未損傷側(cè)腎，B2 為損傷側(cè)腎，可見腎髓質(zhì)小管及腎小囊擴張，腎小球萎縮（B1-B2：20 倍鏡.）；C1-C2 和C3-C4 為正常側(cè)輸尿管Masson、α-SMA 免疫組織化學顯色；C5-C6 為損傷側(cè)輸尿管Masson 染色， 愈合區(qū)域被膠原纖維代替染成藍色（紅色箭頭）； C7-C8 為C5-C6 相對應區(qū)域的α-SMA 免疫組織化學染色，α-SMA 在愈合區(qū)域呈陽性表達。C1、3、5、7：4 倍鏡，標尺=250 μm，C2、4、6、8：10 倍鏡，標尺=100 μm.

Explanation of figures（see inside front cover）

Fig 4 A1 was a picture of a kidney dissection， A2 was a cystic kidney on the injured side， and the contralateral side was normal （the yellow arrow was the stenotic area after ureteral injury）； B1 was the uninjured side kidney， B2 was the injured side kidney， and the renal marrow expansion of tubules and renal capsules， glomerular atrophy （B1-B2： 20 times magnification）； C1-C2 and C3-C4 were normal side ureter Masson and α-SMA immunohistochemical staining. C5-C6 was the injured side Masson staining of the ureter， the healing area was replaced by collagen fibers and stained blue （red arrow）， C7-C8 was the α-SMA immunohistochemical staining of the corresponding area of C5-C6， and α-SMA was positively expressed in the healing area. C1， 3， 5， 7： 4×，bar=250 μm； C2， 4， 6， 8： 10×，bar=100 μm.