SLC7A11與Ki-67在喉鱗狀細胞癌中的表達及臨床意義

李清華， 馬志紅 ， 李 立， 唐艷麗， 陳寶剛， 唐桂華

(河北省承德市中心醫(yī)院耳鼻喉科， 河北 承德 067000)

喉癌是常見的頭頸部惡性腫瘤，其中以鱗狀細胞癌最為常見，約占96%～98%。近年來喉癌發(fā)病率呈明顯上升趨勢[1]。與其他頭頸部鱗狀細胞癌一樣，喉部黏膜癌變的無限增殖也是以單克隆的方式進行[2]。目前喉癌的治療主要有手術切除、放射治療、化學治療、生物治療等，喉癌早期患者手術治療效果好，但發(fā)展到中晚期，則需要行部分喉、3/4喉或全喉切除術，患者還要短期或終身佩戴氣管套管，嚴重影響生活質(zhì)量，且預后較差、死亡率較高。因此，我們需要根據(jù)喉鱗狀細胞癌發(fā)病的分子機制發(fā)現(xiàn)、探索與其發(fā)生、發(fā)展及預后有重要意義的生物學標志物，以更全面的預測患者的預后。SLC7A11既是哺乳動物重要的抗氧化蛋白，也是N-和C-末端均位于細胞質(zhì)內(nèi)的12通道跨膜蛋白，并且不依賴鈉的胱氨酸和谷氨酸的電中性轉運體系統(tǒng)Xc由其與單跨膜蛋白SLC3A2共同組成的[3,4]。在維持細胞內(nèi)外的谷胱甘肽氧化還原平衡中，SLC7A11一方面編碼胱氨酸/谷氨酸xCT的轉運載體，另一方面又特異性轉運胱氨酸和谷氨酸，因此，起到了重要作用[5]。在腫瘤中已發(fā)現(xiàn)影響谷胱甘肽氧化還原循環(huán)平衡的轉運體，而細胞毒性抗腫瘤治療的主要靶向即為這些轉運體，其中重要的轉運蛋白即為SLC7A11。多篇國內(nèi)外報道中SLC7A11已經(jīng)證明參與多種腫瘤的發(fā)生,包括神經(jīng)膠質(zhì)瘤、乳腺癌、卵巢癌、結腸癌、胃癌及食道癌等。雖然這些研究表明SLC7A11在腫瘤的診斷、預后和治療中有著重要的意義，但是SLC7A11在人類喉鱗狀細胞癌中的作用及機制尚不明確。Ki-67是增殖性細胞核的標記物，代表細胞增殖水平，是惡性腫瘤增殖效率的反應指標，Ki-67的高表達又是細胞增殖活躍的重要標志。多數(shù)學者認為它與多種惡性腫瘤發(fā)展、轉移、預后均具有相關性。國內(nèi)有關于SLC7A11、Ki-67在喉癌組織的表達，但兩者共同的報道鮮有。本研究主要是采用免疫組化SP法檢測喉癌組織中SLC7A11、Ki-67的表達，探討兩者與喉癌患者預后、復發(fā)的關系。

1 資料與方法

1.1臨床資料:收集首都醫(yī)科大學附屬北京同仁醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科2008年8月至2014年11月期間收治的喉癌患者117例(喉癌組)，均經(jīng)纖維電子喉鏡、CT、增強CT及術前活檢、術后病理結果明確為原發(fā)性喉鱗狀細胞癌，并且入院前未行放化療及生物治療，其中聲門上型59例，聲門型55例，聲門下型3例。排除標準：合并其他惡性腫瘤，合并全身感染及嚴重肝腎功能不全。其中，男110例，女7例，年齡在35～76歲(≤65歲63例，>65歲54例，平均年齡57.8±9.4歲)；TNM分期(UICC2002)：其中T1、T2期86例，T3、T4期31例；有淋巴結轉移13例，無淋巴結轉移104例；有遠處轉移4例，無遠處轉移113例；組織分化程度：高分化58例，中分化49例，低分化10例。同期選擇同院收治的聲帶息肉患者65例(對照組)，男56例，女9例，年齡在37～68歲(≤65歲45例，>65歲20例，平均年齡53.5±8.9歲)。喉癌組與對照組中性別構成χ2=3.222，P>0.05無統(tǒng)計學意義。年齡、病史經(jīng)過χ2兩組相差不顯著，P>0.05，差異無統(tǒng)計學意義。兩組性別、年齡具有可比性。本研究符合《赫爾辛宣言》，并經(jīng)首都醫(yī)科大學附屬北京同仁醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，所有研究對象均告知及簽署知情同意書后納入本次研究。

1.2SLC7A11、Ki-67表達及檢測:均采用免疫組化SP法。取喉癌組和對照組手術病理標本，常規(guī)石蠟包埋，利用石蠟切片機予4μm厚連續(xù)切片。經(jīng)恒溫烤箱烤片干燥處理后，二甲苯及梯度濃度(100%、95%、75%)乙醇脫蠟脫水;3% H2O2溶液滅活內(nèi)源性過氧化物酶;后在枸櫞酸緩沖液高溫下通過壓力鍋進行抗原修復5 min，直至室溫冷卻。10%山羊血清封閉非特異性抗原，分別滴加多克隆抗體SLC7A11(1∶500)、滴加單克隆抗體Ki-67(1∶100)，用 PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照，4℃孵育過夜。第二日，滴加二抗，DAB顯色，蘇木精復染，常規(guī)脫水、透明、干燥、封片。光學顯微鏡下觀察并讀取切片結果。其判定標準為：SLC7A11與Ki-67的陽性染色分別定位于細胞膜和細胞核，都呈現(xiàn)棕褐色、棕黃色(圖1)。在光學顯微鏡400倍視野下隨機選取至少5個不同的代表性區(qū)域，計算陽性細胞所占比例。陽性細胞所占比例：<10%為0分，10%～25%為1分，>25%～75%為2分，>75%為3分。細胞染色強度:未見染色、弱(淺黃色)、中(棕黃色)、強(棕褐色)分別計0、1、2、3、4分，即顏色越深，計分越多。陽性表達=陽性細胞比例評分×染色強度得分乘積≥1。

圖1 SLC7A11、Ki-67在喉癌組織中的表達(SP褐色×400)

1.3觀察隨訪:117例患者均建立隨訪記錄檔案，每3個月至半年通過門診或電話隨訪，追蹤隨訪3～5年，了解并記錄復發(fā)、預后及死亡情況，并統(tǒng)計3年復發(fā)率和5年死亡率。

1.4統(tǒng)計學方法:采用SPSS23.0統(tǒng)計軟件對實驗結果進行統(tǒng)計學分析。主要采用四格表χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1喉癌組合對照組SLC7A11、Ki-67陽性表達比較:喉癌組SLC7A11陽性表達64例(54.7%)，Ki-67陽性表達41例(35.0%)，對照組SLC7A11陽性表達20例(30.9%)，Ki-67陽性表達10例(15.34%)，兩組SLC7A11、Ki-67陽性表達率比較有統(tǒng)計學意義(χ2分別為9.630、8.006，P<0.05)。

2.2喉癌組織中SLC7A11、Ki-67的陽性表達與臨床病理特征關系:喉癌組中SLC7A11陽性表達與臨床分期有關(P<0.05)，與淋巴結轉移、遠處轉移、組織分化程度無關(P均>0.05)。喉癌組織中Ki-67陽性表達在不同的臨床分期中有明顯差異，臨床分期愈晚，Ki-67陽性表達愈高(P<0.05)。而喉癌組織中Ki-67陽性表達與年齡、性別、遠處轉移、組織分化程度、淋巴結轉移無關(P均>0.05)，見表1。

表1 喉癌組織SLC7A11 Ki-67陽性表達與患者臨床病理特征的關系

表2 3年復發(fā)者SLC7A11和Ki-67表達情況

2.3SLC7A11、Ki-67在喉鱗狀細胞癌中的表達與預后:本次研究117例喉癌患者中，術后3年復發(fā)42例，復發(fā)率是35.8% (42/117)。而復發(fā)者中SLC7A11的陽性表達和Ki-67陽性表達見表2。在117例喉癌患者中，術后5年內(nèi)患者死亡為12例，生存為105例，其生存率為89.8%(105/117)，其中死亡者和生存者的SLC7A11和Ki-67陽性表達見表3，說明生存者與死亡者者的表達陽性率差別無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表3 5年死亡者及生存者SLC7A11和Ki-67表達情況

3 討 論

喉癌是來源于喉腔黏膜上皮組織的惡性腫瘤，其惡性程度及預后主要從細胞組織學分級、臨床病理分型以及是否有淋巴轉移等病理參數(shù)幾方面評定[6]。胱氨酸/谷氨酸轉運蛋白(System Xc--)是由一條重鏈4F2hc(SLC3A2)和一條輕鏈xCT(SLC7A11)構成。重鏈SLC3A2負責幾種氨基酸運輸系統(tǒng), 而輕鏈SLC7A11是只負責胱氨酸/谷氨酸轉運，使胱氨酸轉入細胞內(nèi)并按照1∶1的比率將谷氨酸轉出。細胞內(nèi)胱氨酸(cystine)的攝取為谷胱甘肽(glutathione,GSH)的合成提供原料，GSH作為體內(nèi)主要的抗氧化劑，在對抗氧化應激對機體的毒性反應中發(fā)揮重要的作用。而SLC7A11蛋白通過促進胱氨酸汲取以及谷胱甘肽生物合成，使機體免受氧化應激和鐵細胞死亡反應[7]。如前所述，SLC7A11(xCT)是一種N-和C-末端位于細胞質(zhì)內(nèi)的12通道跨膜蛋白，其同單跨膜蛋白SLC3A2組成不依賴鈉的胱氨酸和谷氨酸的電中性轉運體系統(tǒng)Xc，據(jù)研究在多種惡性腫瘤中廣泛存在[8，9]。對腫瘤細胞微環(huán)境進行特異性調(diào)控是這些轉運蛋白的一個重要生物學特性，進而導致腫瘤及癌細胞較正常細胞的優(yōu)勢生長。有研究表明SLC7A11許多惡性腫瘤中呈過度表達，且與不良預后相關,作為診斷的生物標志物。Robert SM等[10]報道SLC7A11過度表達促進腫瘤增長,影響腫瘤患者的總體生存率。Guo等[11]證明SLC7A11在肝細胞癌(HCC)中明顯增高,與肝癌患者的不良預后直接有關。而本研究結果顯示，SLC7A11在喉癌組織中高表達，聲帶息肉中的表達水平相比，具有顯著性差異(P<0.05)，并其陽性表達與臨床分期有關，T3、T4分期組織中的高表達與在T1、T2分期的表達有顯著性的差異(P<0.05)，與淋巴結轉移、遠處轉移、組織分化程度無關。SLC7A11陽性表達在復發(fā)患者中明顯高于未復發(fā)者，而在死亡者與生存者中的表達差異無統(tǒng)計學意義，因此可表明SLC7A11能促進喉鱗狀細胞癌的發(fā)生、發(fā)展，但可能在患者生存時間上影響不大。

Ki-67是一種與細胞周期相關的增殖細胞核蛋白，是增殖性細胞核的標記物，代表著細胞增殖水平，能較好地反映惡性腫瘤的增殖狀態(tài)，能廣泛用于常規(guī)病理研究。既往研究中，Ki-67蛋白的準確表達、調(diào)控及分布，是細胞增殖、完成細胞周期生長不可缺少的，是檢測腫瘤細胞增殖強弱的標志物，與多種癌癥的發(fā)展、轉移、預后等方面均有關聯(lián)，是腫瘤預后評估的經(jīng)典指標。Wang SJ[12]建議Ki-67不但可以預測胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(PNENs)的預后,它針對該類患者還可以作為衡量患者接受手術或非手術治療的一個重要的參數(shù)。Bieging KT[13]證明在食管鱗狀細胞癌SLC7A11陽性表達與Ki-67指數(shù)呈明顯正相關。本研究表明Ki-67的陽性表達與喉癌的臨床分期和T分期有密切相關，本研究中臨床分期愈晚，Ki-67陽性表達愈高，與年齡、性別、遠處轉移、組織分化程度、淋巴結轉移無關。Ki-67陽性表達方面復發(fā)者明顯高于未復發(fā)者，并差異有統(tǒng)計學意義，但在死亡患者與生存者中的表達無統(tǒng)計學差異。因此，表明Ki-67對喉癌的復發(fā)有影響，但對患者的生存率影響不大。

綜上所述，在喉癌組織中SLC7A11高表達、Ki-67高表達，對喉癌術后復發(fā)有高危預警的作用。在喉癌組織中SLC7A11表達與Ki-67表達密切相關,且SLC7A11陽性表達結合Ki-67陽性表達預示喉癌患者術后預后不良。二者表達變化與患者術后復發(fā)有關，與術后生存時間關系不大，對評估患者預后有重要意義。