源于解淀粉芽孢桿菌酸性木聚糖酶酶學性質的研究

鄭亞倫，夏瑛，李良，董孝元，方尚玲，陳茂彬，李琴*

1(湖北工業(yè)大學 生物工程與食品學院，湖北 武漢，430070)2(黃鶴樓酒業(yè)有限公司，湖北 武漢，430050) 3(武漢雅仕博科技有限公司，湖北 武漢，430061)4(湖北省釀造工藝與裝備工程技術中心，湖北 武漢，430070)

半纖維素是自然界第二大豐富的多糖，在農業(yè)生產的廢棄物中含有大量的半纖維素，合理高效的利用半纖維素除了能夠解決農業(yè)生產廢棄物的問題，還能在一定程度上緩解能源危機問題。木聚糖是植物半纖維素的主要組成成分，快速高效的降解木聚糖是利用植物半纖維素的一個關鍵點。近年來多采用生物轉換法來降解木聚糖，如利用木聚糖酶。木聚糖酶是一類能降解植物半纖維素中的木聚糖的糖苷鍵骨架的水解酶，并通過其中各種組分的協(xié)同作用降解木聚糖[1]。50多年前，從曲霉當中部分純化了木聚糖酶之后，陸續(xù)分離純化了許多其他屬的木聚糖酶[2-3]。木聚糖酶不僅僅用在植物能源方面，在食品和飲料、動物飼料、提取植物油和提高動物的營養(yǎng)價值等方面都有廣泛的應用[4-5]。相關研究表明,在pH<4或5的酸性條件下，有較高酶活力的木聚糖酶都可以被稱為酸性木聚糖酶[6-7]。大多數(shù)的木聚糖酶為堿性木聚糖酶，國外以及國內對于堿性木聚糖酶早有研究，并已經應用于造紙工業(yè)以及生物工程領域[8-9]。酸性木聚糖酶能夠在酸性條件下保持相對較高的酶活性，這類木聚糖酶在較低的pH值下能夠穩(wěn)定的發(fā)揮作用，在飼料，釀酒以及果汁澄清等需要低pH值的行業(yè)具有很好的應用前景[10]。

木聚糖酶的產生受培養(yǎng)基、pH值、接種量和溫度等因素的影響，不同的生產條件對木聚糖酶的產量和水解效率有很大的影響。降低酶的生產成本是提高工業(yè)生產經濟性和可行性的重要途徑[11]。隨著木聚糖酶在各個領域和產業(yè)中的應用日益廣泛，市場需求對木聚糖酶的生產和活性提出了更高的要求。本文旨在探索其酶學性質，獲得最佳發(fā)酵條件，以更好地滿足市場需求。

響應面分析法(response surface methodology，RSM)是一種統(tǒng)計方法，它使用合理的實驗設計來尋找最佳工藝參數(shù)并解決多變量問題[12]。本文以解淀粉芽孢桿菌的基因為研究對象，并結合響應面分析對表達條件進行了優(yōu)化，嘗試找到木聚糖酶的最佳表達條件。本實驗對其酶學性質進行了研究，為大規(guī)模生物合成生產高質量的木糖提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與試劑

實驗室從土壤樣品中篩選出1株解淀粉芽孢桿菌。Taq聚合酶、質粒pMD18-T，Takara公司；凝膠提取試劑盒、細菌DNA提取試劑盒，Omega；質粒提取試劑盒，Biomiga公司；樺木木聚糖和燕麥木聚糖，Sigma公司；山毛櫸木聚糖，Megazyme公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母浸膏5，NaCl 5。

SOC(super optimal broth with catabolic repression)培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨20，酵母提取物5，NaCl 0.5，KCl 0.186，MgCl20.952，葡萄糖3.603。

2×YT(yeast peptone broth)培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨16，酵母提取物5，NaCl 5。

M-TB(modified-terrific broth)培養(yǎng)基(g/L):甘油10，酵母提取物24，蛋白胨12，KH2PO42.314，KH2PO4·3H2O 16.432。

SB(super broth)培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨30，酵母提取物20，葡萄糖20。

1.2 基因克隆與表達

利用細菌DNA提取試劑盒，從解淀粉芽孢桿菌中提取總基因序列，根據(jù)NCBI(登錄碼：KY849859.1)上記錄的木聚糖酶基因序列設計特異性引物，獲得目的基因。將聚合酶鏈式反應(polymerase chain reation，PCR)得到的目的片段與克隆載體pMD18-T連接，轉染到大腸桿菌DH5α?；谳d體上攜帶的抗性基因，每100 mL培養(yǎng)基中添加100 μL的100 mg/mL氨芐抗生素，在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)并測序驗證，測序正確的基因在NheI和XhoI酶切位點與pET28a(+)連接，然后轉移到大腸桿菌BL21(DE3)中，重組菌株編號為BA-TB-1。

1.3 木聚糖酶的純化與分析

將含有重組質粒的細胞BA-TB-1轉移到LB培養(yǎng)基中，在200 r/min、37 ℃條件下培養(yǎng)，然后用500 mmol/L異丙基β-D-1-硫代半乳吡喃糖苷(ispropyl-β-D-thinogalactoside，IPTG)溶液誘導表達。將誘導表達后的細胞溶液在4 ℃，5 000 r/min狀態(tài)下離心5 min，去掉上清液后加入10 mL 50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.0)。粗酶液超聲處理15 min，離心獲得上清液，上清液在10 000 r/min下離心10 min，粗酶液經Ni-Sepharose-HP柱純化[13]。采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)測定蛋白質的分子質量，用聚氧基丙烯酸正丁酯(butyleyanoacrylate，BCA)蛋白質濃度試劑盒測定蛋白質濃度。

1.4 木聚糖酶活性測定

根據(jù)標準方法，木聚糖酶的1個單位被定義為1 min 釋放1 μmol木聚糖酶的量。通過將0.9 mL的1 mg/mL 山毛櫸木聚糖與0.1 mL適當稀釋的木聚糖酶(50 mmol/L乙酸緩沖液，pH 5.5)在55 ℃、反應5 min 來測定[14]，并用3,5-二硝基水楊酸法(3,5-dinitrosalicylic acid，DNS)計算釋放的還原糖量[15]。

1.5 最佳pH和pH穩(wěn)定性

將純化后的酶放置在不同pH的緩沖溶液(甘氨酸-HCl緩沖液pH 2.0～3.5；檸檬酸緩沖液pH 3.0～6.5；NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液pH 6.0～8.0；Tris-HCl緩沖液pH 7.5～8.5)中進行處理，得到最佳的pH(以最佳pH條件下的酶活力為100%)。純化后的酶在37 ℃條件下，置于不同的pH(4.0～10.0)溶液中處理60 min，研究酶的pH穩(wěn)定性(以未處理的酶活力為100%)。

1.6 最佳溫度和熱穩(wěn)定性

將純化后的酶在不同溫度(10～90 ℃)下反應，確定最佳反應溫度(以最佳溫度條件下的酶活力為100%)。在適宜的pH和溫度(20～90 ℃)下反應30 min后測定酶活性，研究酶的熱穩(wěn)定性(以未處理的酶活力為100%)。

1.7 酶的誘導表達優(yōu)化

1.7.1 單因素設計

通過控制培養(yǎng)基、誘導溫度、接種量、500 mmol/L IPTG用量、誘導時間和誘導點(加入IPTG前預培養(yǎng)時間)等變量，對木聚糖酶的表達條件進行了優(yōu)化。將低溫保存的菌株接種到LB培養(yǎng)基，在37 ℃恒溫下培養(yǎng)14 h成為母液。

誘導溫度對木聚糖酶誘導表達的影響：在LB培養(yǎng)基中，接種量1.0%，500 mmol/L IPTG 200 μL，誘導時間18 h，誘導時機3.5 h的條件下，研究誘導溫度為15、18、21、24、27、30 ℃對木聚糖酶誘導表達的影響。

培養(yǎng)基對木聚糖酶誘導表達的影響：實驗選擇5種培養(yǎng)基進行優(yōu)化。在誘導溫度27 ℃，接種量1.0%，500 mmol/L IPTG 200 μL，誘導時間18 h的條件下，研究LB、2 × YT、SB、SOC、MTB培養(yǎng)基對木聚糖酶誘導表達的影響。

誘導點對木聚糖酶誘導表達的影響：在LB培養(yǎng)基中，誘導溫度27 ℃，接種量1.0%，500 mmol/L IPTG 200 μL，誘導時間18 h的條件下，研究誘導點2.5、3、 3.5、 4、 4.5 h對木聚糖酶誘導表達的影響。

誘導時間對木聚糖酶誘導表達的影響：在LB培養(yǎng)基中，接種量1.0%，500 mmol/L IPTG 200 μL，誘導溫度27 ℃，誘導時機3.5 h的條件下，研究誘導時間為12、15、18、21、24、27 h對木聚糖酶誘導表達的影響。

IPTG濃度對木聚糖酶誘導表達的影響：在LB培養(yǎng)基中，誘導時機3.5 h，誘導溫度27 ℃，接種量1.0%，誘導時間18 h的條件下，研究500 mmol/L IPTG用量為100、150、200、250、300 μL對木聚糖酶誘導表達的影響。

接種量對木聚糖酶表達的影響：在500 mmol/L IPTG量200 μL，誘導點3.5 h，誘導時間18 h，誘導溫度27 ℃，LB培養(yǎng)基的條件下，研究接種量為0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%對木聚糖酶誘導表達的影響。

1.7.2 響應面設計

根據(jù)單因素實驗結果，選擇單因素中對木聚糖酶活力最大的3個因素，采用中心組合的設計原理，以誘導點，500 mmol/L IPTG用量，接種量為自變量，木聚糖酶的酶活力為響應值進行響應面設計。實驗設計如表1所示。

表1 Central Composit試驗因素與水平Table 1 Central Composit test factors and levels

2 結果與分析

2.1 木聚糖酶的克隆與分析

以解淀粉芽孢桿菌總基因組為模板，NCBI上記錄的木聚糖酶基因序列設計引物，進行PCR實驗。將PCR 的擴增產物用1%(質量分數(shù))瓊脂糖凝膠電泳法進行檢測。檢測結果如圖1所示，通過PCR擴增獲得642 bp的條帶，與木聚糖酶目的基因相吻合，說明具有很高的產物特異性。

M-2 000 bp DNA Maker；條帶1-目標DNA圖1 DNA瓊脂糖凝膠電泳結果Fig.1 Agarose gel electrophoresis of DNA

2.2 木聚糖酶的純化

細胞置于超聲波中進行破壁處理，將收集到的酶進行粉碎、離心和透析處理，粗酶經Ni-Sepharose-HP柱純化。圖2是酶的純化結果,前2個條帶分別是標記條帶和空白對照。第3條帶是破壞后的上清液。由圖2可知，目標蛋白的表達量較高。第4條是純化的酶，在23.28 kDa處有1條清晰的蛋白帶。這與木聚糖酶的理論分子質量一致，表明得到了純化的木聚糖酶。

M-蛋白質Maker；1-空白對照；2-粗酶；3-純化酶圖2 木聚糖酶的SDS-PAGE分析Fig.2 Analysis of xylanase by SDS-PAGE

2.3 最佳pH和pH穩(wěn)定性

以山毛櫸木聚糖為底物，在緩沖溶液中測定木聚糖酶的最佳pH值。酶活性在4種不同的緩沖液中變化趨勢相同，如圖3-A所示。酶活性隨著酸度的降低而增加，在pH值為5.0～6.0時有較高的酶活性。37 ℃條件下，將木聚糖酶在不同pH緩沖液中培養(yǎng)1 h，測定酶活力。在pH 5.0和pH 5.0～7.0條件下，殘余酶活性分別保持在68%和50%以上(圖3-B)，表明木聚糖酶具有良好的耐酸性[16]。研究表明，來自于包括丙酮丁酸梭桿菌在內的不同生物體的木聚糖酶的最適pH值均在6.0[17]。

A-最佳pH;B-pH穩(wěn)定性圖3 pH對木聚糖酶的影響Fig.3 Effect of pH on xylanase注：以未處理的木聚糖酶活性為100%

2.4 最佳溫度和熱穩(wěn)定性

以山毛櫸木聚糖為底物，純化的木聚糖酶在不同溫度下與底物進行反應。酶活性在30 ℃時較低，并且隨著溫度的升高而升高(圖4-A)。該酶在60 ℃下表現(xiàn)出最大活性，高于其他菌株[18]。據(jù)相關研究報道，來源于AspergillussulphureusCGMCC0608菌株的木聚糖酶的最適溫度僅為50 ℃[19]，相比而言，菌株BA-TB-1的產生的木聚糖酶具有較好的熱穩(wěn)定性。在酶的生物催化過程中，溫度對其催化效率有顯著的影響，在較高溫度下進行生物催化，酶可能失活[20-21]。如圖4-A所示，實驗中的木聚糖酶在溫度超過90 ℃時，酶活性基本喪失。將酶置于不同溫度下反應30 min，測定其熱穩(wěn)定性，圖4-B顯示殘余酶活性隨溫度的升高而顯著降低。60 ℃是食品工業(yè)應用木聚糖酶的理想溫度，在此溫度下，木聚糖酶可以增加面團的比體積和流變特性[18]，在此溫度下，酶的殘余活性在30%左右。

A-最佳溫度；B-熱穩(wěn)定性圖4 溫度對木聚糖酶的影響Fig.4 Effect of temperature on xylanase注：以未處理的酶活性為100%

2.5 木聚糖酶底物特異性和動力學參數(shù)

以山毛櫸木聚糖為底物時的酶活力為100%。木聚糖酶對山毛櫸木聚糖、樺木木聚糖、燕麥木聚糖的比活力分別為100%、65.53%、172.55%。山毛櫸木聚糖的動力學常數(shù)Km和Vmax分別為(4.195±0.68) mg/mL和(1 757±6.31) mg/(min·μmol)，低于大多數(shù)重組木聚糖酶的Km[22-23]。木聚糖酶對樺木木聚糖的比活力(65.53%)最低，對燕麥木聚糖的比活力(172.55%)最高，這與相關研究中的青霉菌木聚糖酶的結果相反[22]。當木聚糖酶和燕麥中的木聚糖相互作用時，活性位點的特征可能會改變[24]。Trichoderma inhamatum木聚糖酶對可溶性樺木木聚糖的催化專一性較高，這與本實驗所研究的木聚糖酶相反[24]。

2.6 表達條件的優(yōu)化

2.6.1 單因素實驗

2.6.1.1 培養(yǎng)基優(yōu)化

不同組成成分的培養(yǎng)基對促進細胞的生長，提升細胞生長數(shù)量有不同的效果，從而影響細胞的生長和調節(jié)[25]。添加不同碳源和氮源的培養(yǎng)基可促進重組纖維素酶的產量[26]。當選擇2×YT培養(yǎng)基(含5 g/L酵母抽提物和16 g/L蛋白胨)時，其表達水平達到501.34 U/mL，略高于MTB培養(yǎng)基(含2.4 g/L酵母抽提物和12 g/L蛋白胨)(圖5-A)。SUBRAMANIYAN等[27]用2.5 g/L蛋白胨和2.5 g/L酵母抽提物從芽孢桿菌SSP34中獲得了最高的木聚糖酶產量。同時，一些報告表明，酵母提取物對芽孢桿菌產酶的影響最為重要[28]。這可能是因為以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基(SOC和SB)產生的細胞密度較低，而富集培養(yǎng)基(LB和MTB)提供的細胞密度較高，但不支持最佳的表達[25]。

2.6.1.2 誘導溫度優(yōu)化

誘導后培養(yǎng)溫度的優(yōu)化對于提高可溶性重組蛋白的產量具有重要意義[24]。當誘導溫度過低時，酶活性沒有實質性變化(圖5-B)。當溫度為24 ℃時，酶活性最高達到488.215 U/mL，與本實驗的最佳誘導表達溫度相同[25]。溫度不僅對宿主細胞的生長有重要的影響，同時也影響異源性蛋白的合成。當誘導溫度較高時，宿主生長加快，蛋白質合成速率過快，可能產生包涵體，導致細菌死亡[29]。

2.6.1.3 誘導時機優(yōu)化

如圖5-C所示，當誘導點為4 h時，木聚糖酶的酶活性達到最大值450.022 U/mL。重組酶在培養(yǎng)過程中主要依賴于細胞比生產力和細胞密度[30]。當培養(yǎng)時間過短時，細菌的代謝能力不強，細胞密度低，細菌的表達量低。然而，細菌相對較老時，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質用于細胞的生長和繁殖，誘導點太晚時會導致酶的表達減少[31]。在低細胞密度的早期進行誘導會導致細胞代謝負擔和生理負擔，進而影響誘導后的蛋白質表達和細胞生長[32]。因此，有必要選擇在適當?shù)臅r間加入IPTG。

2.6.1.4 誘導時間優(yōu)化

誘導時間影響大腸桿菌中表達蛋白的折疊、積累和產量[33]。當誘導時間太短時，菌群沒有完全生長并繁殖到最佳狀態(tài)，導致酶活性降低(圖5-D)，最適誘導時間為24 h，酶活性達到488.215 U/mL，誘導時間越長，會導致細胞衰老、自溶和活力下降，木聚糖酶活性越低。周質蛋白分泌隨著誘導時間的延長而增加，這增加了其滲透性，削弱了外膜，這種延長培養(yǎng)時間的方法先前由DIZ-RINCN[34]和DONOVAN[35]報道。

2.6.1.5 IPTG用量優(yōu)化

IPTG是一種誘導分子，通常用于在lac操縱子下生產重組蛋白。目前研究表明，隨著IPTG溶液用量的增加，重組蛋白的產量增加[25]。當500 mmol/L IPTG溶液用量為200 μL時，木聚糖酶顯示出最大活性(圖5-E)。但隨著IPTG用量的增加，酶活性下降更為嚴重。選擇最佳的誘導濃度時，可以確保膜的定位和高效運輸，這也可以減少細胞的運轉負荷[36]。然而，較高濃度的IPTG導致包涵體的形成[37]，導致細菌死亡。

2.6.1.6 接種量優(yōu)化

酶的生物合成受菌株年齡和接種量的影響[38]。圖5-F表明，酶活性隨著接種量的增加而呈現(xiàn)先升高后降低的情況，當接種量為3%時，酶活性最高，達到488 U/mL。過量接種時酶產量的下降可能是由于培養(yǎng)物生長速度加快和養(yǎng)分缺乏導致[39]。因此，最大的酶產量需要在有效養(yǎng)分和高產之間平衡[40]。

2.6.2 Central Composite試驗設計與結果

依據(jù)單因素實驗結果，運用Design-expert 8.0.6中Central Composite試驗方法，采用響應面分析法對木聚糖酶的誘導表達條件中的影響因素500 mmol/L IPTG的用量、誘導時機、接種量進行優(yōu)化，確定最佳的誘導表達條件。如表5所示，根據(jù)各個因素的F值，影響結果的次序為B>A>C，即影響因素IPTG用量>誘導點>接種量。模型的P值<0.000 1，差異顯著，失擬項為0.125 8>0.05，表示結果差異不顯著，說明模型是有效的。模型決定系數(shù)R2=0.997 5，表明木聚糖酶的實際酶活與預測值擬合度，校正決定系數(shù) AdjR2=0.995 2。綜上所述，該實驗模型可進行真實值的分析，回歸方程擬合度好，可用于木聚糖酶的表達優(yōu)化。

A-培養(yǎng)基；B-誘導溫度；C-誘導點；D-誘導時間；E-500 mmol/L IPTG用量；F-接種量圖5 木聚糖酶的表達優(yōu)化條件Fig.5 Optimization of expression conditions for xylanases

表2 Central Composite試驗方案與結果Table 2 Central Composite test plan and results

2.6.3 響應面分析

根據(jù)Design-Expert 8.0.6軟件分析得到的回歸方程可知，預測的最佳表達優(yōu)化條件為誘導點3.63 h、500 mmol/L IPTG 224.76 μL、接種量3.18%，此條件下的預測值為550.139 U/mL。為了實驗的可操作性，取誘導點3.6 h、500 mmol/L IPTG 225 μL、接種量3.8%，在此實驗條件下進行3次平行實驗，平均木聚糖酶的活力為548.87 U/mL。實際值與預測值十分接近，說明響應面優(yōu)化木聚糖酶的表達是可行的。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance for regression models

3 結論

本文從解淀粉芽孢桿菌中克隆得到一個木聚糖酶基因，并在大腸桿菌DH5α中克隆保留，之后轉入到BL21(DE3)中進行了異源表達。通過研究木聚糖酶的酶學性質，發(fā)現(xiàn)該木聚糖酶具有較好的耐酸性，這能為木聚糖酶在食品和動物飼料添加劑中的應用提供一定的理論依據(jù)。同時本實驗采用響應面分析法來優(yōu)化木聚糖酶的誘導表達條件，在最佳的誘導表達條件，獲得更加穩(wěn)定、高質量的木聚糖酶。木聚糖酶在中溫條件下具有較高的耐熱性，在較寬pH范圍內的穩(wěn)定性，可用于多種生物技術應用，且具有較高的耐熱性和耐酸性，可以很好地應用于工業(yè)生產。

圖6 誘導點、500 mmol/L IPTG的用量和接種量交互作用圖Fig.6 Interaction plot of inducing point, 500 mmol/L IPTG, and inoculation amount