活化蛋白C通過靶向VLA-3-中性粒細胞亞群來減輕結(jié)核桿菌誘導的人氣道上皮細胞炎癥反應線粒體能量代謝障礙

陳焰 王崗玲 吳海明

1武警福建省總隊醫(yī)院感染科（福州350003）；2廈門市兒童醫(yī)院檢驗科（福建廈門361000）

小鼠患上內(nèi)毒素血癥和嚴重的多菌性腹膜炎后，炎癥性中性粒細胞中整聯(lián)蛋白VLA-3（CD49c/CD29）水平上升，而以VLA-3高中性粒細胞亞群為目標進行治療可提高小鼠的存活率［1-2］。中性粒細胞通過吞噬作用在宿主防御系統(tǒng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用［3］。感染引起嚴重炎癥反應后，中性粒細胞由于促炎性細胞因子和微生物成分的激活導致凋亡減少、趨化性改變以及內(nèi)臟器官過度浸潤，從而導致附帶組織損傷［4］。整聯(lián)蛋白是異二聚體跨膜蛋白，可介導嗜中性粒細胞和細胞外基質(zhì)蛋白間的粘附和信號傳導，并促進其在血管內(nèi)和間質(zhì)的遷移［5］?；罨鞍證是一種維生素K依賴的絲氨酸蛋白酶，有很強的抗凝功能，源自凝血酶介導的循環(huán)蛋白C裂解［6］。除了其天然的抗凝功能外，活化蛋白C還有細胞保護和抗炎活性，包括保護內(nèi)皮屏障、抑制細胞凋亡、減少促炎性介質(zhì)的分泌和抑制白細胞遷移［7］。本研究使用人支氣管上皮BEAS-2B細胞探究活化蛋白C與VLA-3的靶向關(guān)系及其對細胞炎癥反應的抑制和對線粒體功能保護作用。

1 材料和方法

1.1 細胞培養(yǎng)將人支氣管上皮細胞BEAS-2B（Sigma）在補充10%熱滅活胎牛血清（FBS）、2 mmol/L L-谷氨酰胺、青霉素（100 U/mL）的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基（DMEM）中培養(yǎng)，5%CO2和潮濕空氣中恒溫37 ℃加熱。

1.2 BEAS-2B 細胞結(jié)核桿菌感染及細胞轉(zhuǎn)染將BEAS-2B細胞以5×104個/cm2的密度接種在培養(yǎng)板上。用50個細菌/細胞的結(jié)合桿菌感染培養(yǎng)物。將感染的培養(yǎng)物孵育各種時間，直至72 h。與BCG孵育后，將BAEpC用PBS洗滌3次。通過Lipofectamine 2000試劑將重組慢病毒載體質(zhì)粒pLP與BEAS-2B細胞共轉(zhuǎn)染，并在37 ℃下孵育48 h。收集細胞培養(yǎng)基的上清液以獲得攜帶活化蛋白C基因或空載體慢病毒溶液的慢病毒。將BEAS-2B細胞（5 ×103）接種到96孔板中并在37 ℃下培養(yǎng)過夜直至細胞融合率為50% ～60%。加入攜帶活化蛋白C基因的慢病毒pLP［感染復數(shù)（MOI）=4］并在37 ℃下孵育24 h。第2天，棄去含有病毒的培養(yǎng)基并用DMEM+10%小牛血清培養(yǎng)基代替，連續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.3 實驗分組BEAS-2B細胞分為3組：BEAS-2B組（正常培養(yǎng)的細胞系作為實驗對照），結(jié)核桿菌誘導組（將BEAS-2B以5×104細胞/cm2的密度接種在培養(yǎng)板上，用50個細菌/細胞的結(jié)合桿菌感染培養(yǎng)物），BEAS-2B轉(zhuǎn)染組（攜帶活化蛋白C的慢病毒載體與BEAS-2B進行細胞轉(zhuǎn)染，讓其超表達）。

1.4 整聯(lián)蛋白配體結(jié)合測定使用純化的可溶性人α3β1、α5β1和αVβ3進行可溶性整聯(lián)蛋白結(jié)合測定。將1 μg/mL的可溶性整聯(lián)蛋白與針對β1或β3亞基的單克隆抗體（針對β1整聯(lián)蛋白的mAb TS2/6和針對β3整聯(lián)蛋白的mAb D3）加上rhAPC混合在室溫下在L15培養(yǎng)基中將1 mmol/L Mn2+在室溫下放置1 h，用A/G蛋白沉淀蛋白質(zhì)復合物，進行SDS-PAGE和大鼠抗人活化蛋白C抗體的蛋白質(zhì)印跡分析。對于活化蛋白C結(jié)合抑制測定，從健康供體中分離中性粒細胞，與0、0.1、1和10 μg活化蛋白C以及針對整聯(lián)蛋白α3、α5、αv或αM的封閉抗體一起孵育在1 mL L15培養(yǎng)基中于4 ℃放置30 min。洗滌后，將細胞在室溫下用3.7%甲醛固定10 min。固定后，將細胞用大鼠抗活化蛋白C一抗和PE標記的山羊抗大鼠二抗在黑暗中于4 ℃染色30 min，洗滌并重懸于磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）用于流式細胞儀分析。樣品均在FACS Calliber流式細胞儀上收集，使用Flow Jo軟件分析數(shù)據(jù)。

1.5 逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈反應（RT-qPCR）使用試劑從培養(yǎng)的細胞中提取總RNA。使用反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。反應在42 ℃下進行60 min，通過加熱至70 ℃5 min而終止。使用SYBR? Green PCR Master mix和ABI Prism 7500序列檢測系統(tǒng)進行qPCR。PCR熱循環(huán)條件為：在94 ℃下預變性3 min；進行35個94 ℃持續(xù)50 s，37 ℃1 min，72 ℃1.5 min的循環(huán)；在72 ℃延伸7 min。使用2-ΔΔCq方法對mRNA水平進行定量，并標準化為對照。RTqPCR用于確定IL-6、IL-8、MCP-1在細胞中的表達。見表1。

表1 RT-PCR 引物序列Tab.1 RT-PCR primer sequences

1.6 線粒體復合物活性檢測使用熒光探針JC-1評估線粒體功能，該探針在細胞質(zhì)中產(chǎn)生綠色熒光，并在呼吸性線粒體中聚集時產(chǎn)生紅色/橙色熒光。在培養(yǎng)基中將細胞與2 μg/mL JC-1孵育30 min，用培養(yǎng)基洗滌一次。使用熒光平板讀數(shù)器進行熒光測量，對J聚集體使用530 nm激發(fā)/590 nm發(fā)射設置（紅色/橙色熒光）和485 nm激發(fā)/530-胞質(zhì)熒光的nm發(fā)射設置（綠色）。使用配備了雙羅丹明/熒光素濾光片組，×40水浸物鏡和數(shù)碼相機成像系統(tǒng)（診斷儀器）的Zeiss Axiophot 2熒光顯微鏡進行熒光顯微鏡檢查。

1.7 線粒體膜電位測量在5 μmol/L Pim1抑制劑K00135（22）或DMSO存在下，將融合了血清的枯竭BEAS-2B細胞層與0、10%、15%、20%、30%或40%CSE孵育4 h。將細胞用RPMI 1640洗滌兩次，用500 nmol/L TMRE染色，在37 ℃下染色30 min。染色后，將細胞用RPMI 1640洗滌一次，用胰蛋白酶消化，收集在FACS管中。將細胞重懸于300 μL補充鈣、鎂、葡萄糖和丙酮酸的無色DPBS中測量線粒體膜電位（Ψm）。使用Winlist軟件分析數(shù)據(jù)。

1.8 ELISA 和TUNEL 鑒定細胞凋亡及活力通過細胞死亡ELISA和末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）介導的dUTP-生物素缺口末端標記（TUNEL）檢測BAEpC凋亡。使用細胞死亡ELISA試劑盒根據(jù)制造商的規(guī)程檢測細胞質(zhì)組蛋白相關(guān)的DNA片段。將細胞（5 × 104）接種在24孔板中，在37 ℃下孵育16 h。將細胞用200 μL裂解緩沖液在25 ℃裂解30 min，將20 μL上清液轉(zhuǎn)移至鏈霉親和素包被的多板中；將包含4 μL抗組蛋白-生物素和4 μL抗DNA-POD的80 μL免疫試劑添加到每個孔中，并將板在室溫下振搖2 h，以檢測細胞裂解物中的單核糖體和寡核糖體。洗滌后，將孔與100 μL的2，2′-疊氮基-二（3-乙基苯并噻唑啉磺酸鹽）（ABTS）溶液在室溫下孵育20 min。立即在酶標儀中于405 nm（波長540 nm）讀取吸光度。用BCG處理后，將BEAS細胞在PBS（pH 7.4）中的1%多聚甲醛中在冰上固定1 h，洗滌，在70%乙醇中于-20 °C儲存至少24 h。將樣品與含有TdT酶和Br-dUTP的反應緩沖液在37 °C孵育1 h，與FITC標記的抗BrdU在37°C孵育30 min以進行FASCan分析。

1.9 統(tǒng)計學方法本研究采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件；計量資料用均數(shù)±標準差表示，組間比較用單因素方差分析或者重復測量的方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗；計數(shù)資料用百分率（%）表示，組間比較用χ2分析；P ＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 活化蛋白C 與整聯(lián)蛋白VLA-3 結(jié)合測定VLA-3較VLA-3和αVβ3結(jié)合程度升高（P ＜0.05）。與其他兩種整聯(lián)蛋白相比，VLA-3對活化蛋白C的親和力更高。見圖1、表2。

圖1 可溶性VLA-3、VLA-5 和αVβ3與APC 的結(jié)合測定Fig.1 Determination of binding of soluble vla-3，VLA-5 and αVβ3 with APC

表2 活化蛋白C 與VLA-3 的親和度檢測Tab.2 Detection of affinity between activated protein C and vla-3 ±s

表2 活化蛋白C 與VLA-3 的親和度檢測Tab.2 Detection of affinity between activated protein C and vla-3 ±s

組別VLA-3 VLA-5 αVβ3 F 值P 值活化蛋白C 濃度5（μg/mL）12.65±2.17 2.36±0.54 3.41±1.06 15.327 0.001活化蛋白C 濃度10（μg/mL）23.84±3.16 5.37±1.22 7.39±2.04 19.157 0.001

2.2 活化蛋白C 減輕結(jié)合桿菌誘導的細胞炎癥反應結(jié)核桿菌誘導組較BEAS-2B組IL-6、IL-8、MCP-1mRNA表達升高（P ＜0.05），BEAS-2B轉(zhuǎn)染組較結(jié)核桿菌誘導組IL-6、IL-8、MCP-1mRNA表達降低（P ＜0.05），APC降低了結(jié)核桿菌誘導的細胞炎癥反應。見圖2、表3。

圖2 qRT-PCR 檢測促炎因子mRNA 表達Fig.2 The expression of proinflammatory factor mRNA was detected by QRT PCR

表3 細胞促炎因子mRNA 表達Tab.3 Expression of proinflammatory factor mRNA ±s

表3 細胞促炎因子mRNA 表達Tab.3 Expression of proinflammatory factor mRNA ±s

組別BEAS-2B 組結(jié)核桿菌誘導組BEAS-2B 轉(zhuǎn)染組F 值P 值IL-6 1.15±0.23 2.24±0.36 1.23±0.27 15.652 0.001 IL-8 0.97±0.12 1.88±0.24 1.07±0.15 12.427 0.001 MCP-1 0.75±0.05 2.04±0.38 1.35±0.26 12.524 0.001

2.3 細胞線粒體復合物活性檢測BEAS-2B組較結(jié)核桿菌誘導組線粒體復合物Ⅰ、線粒體復合物Ⅳ活性升高（P ＜0.05），結(jié)核桿菌誘導組較BEAS-2B轉(zhuǎn)染組線粒體復合物Ⅰ、線粒體復合物Ⅳ活性降低（P ＜0.05）。見表4。

表4 線粒體復合物活性檢測Tab.4 Detection of mitochondrial complex activity ±s

表4 線粒體復合物活性檢測Tab.4 Detection of mitochondrial complex activity ±s

組別BEAS-2B 組結(jié)核桿菌誘導組BEAS-2B 轉(zhuǎn)染組F 值P 值線粒體復合物Ⅰ（AU/50 μg MITO）15.64±3.24 4.28±1.32 16.57±3.18 20.285 0.001線粒體復合物Ⅳ（AU/10 μg MITO）17.58±2.28 8.61±1.16 14.81±1.50 11.491 0.001

2.4 細胞線粒體膜電位評估BEAS-2B組較結(jié)核桿菌誘導組膜電位升高（P ＜0.05），結(jié)核桿菌誘導組較BEAS-2B轉(zhuǎn)染組膜電位降低（P ＜0.05）。結(jié)核桿菌誘導了細胞的線粒體功能受損，活化蛋白C的超表達抑制了線粒體受損情況。見表5。

表5 線粒體復合物活性檢測Tab.5 Detection of mitochondrial complex activity±s

表5 線粒體復合物活性檢測Tab.5 Detection of mitochondrial complex activity±s

組別 膜電位×103 BEAS-2B 組9.52±0.42結(jié)核桿菌誘導組BEAS-2B 轉(zhuǎn)染組F 值P 值7.43±0.19 8.74±0.23 9.151 0.001

2.5 細胞凋亡率和細胞活力檢測BEAS-2B組較結(jié)核桿菌誘導組細胞凋亡率降低（P ＜0.05），結(jié)核桿菌誘導組較BEAS-2B轉(zhuǎn)染組細胞凋亡率升高（P ＜0.05）。BEAS-2B組較結(jié)核桿菌誘導組細胞活力升高（P ＜0.05），結(jié)核桿菌誘導組較BEAS-2B轉(zhuǎn)染組細胞細胞活力降低（P ＜0.05）。TUNEL染色檢測各組細胞的凋亡情況，結(jié)核桿菌誘導組的陽性率較BEAS-2B組高（P ＜0.05），BEAS-2B轉(zhuǎn)染組減少了TUNEL染色陽性率（P ＜0.05）。見圖3、表6。

表6 細胞凋亡率、活力情況檢測Tab.6 Detection of apoptosis rate and vitality±s

表6 細胞凋亡率、活力情況檢測Tab.6 Detection of apoptosis rate and vitality±s

細胞凋亡（%） 細胞活力（%）組別BEAS-2B 組結(jié)核桿菌誘導組BEAS-2B 轉(zhuǎn)染組F 值P 值18.34±2.17 46.35±3.36 25.47±6.19 19.158 0.001 71.68±8.14 42.15±2.96 68.35±6.04 25.658 0.001

3 討論

活化蛋白C活化后有許多不同的生物學活性，包括抗血栓形成作用以及各種抗炎和細胞保護作用，其最終作用是維持脈管系統(tǒng)的完整性［8］。雖然活化蛋白的抗凋亡和內(nèi)皮屏障功能需要激活內(nèi)皮蛋白C受體（endothelin C receptor，EPCR）和依賴性蛋白酶激活受體1（dependent protease activated receptor 1，PAR-1），但其抗炎作用是由EPCR-PAR-1依賴性和獨立途徑，可能涉及細胞粘附受體［9］。EPCR是在內(nèi)皮細胞上鑒定出的第一個活化蛋白C受體。活化蛋白C的抗凋亡和血管保護作用由EPCR參與和APC-EPCR復合體對G蛋白偶聯(lián)的PAR-1的次級激活介導［10］。許多表達EPCR的細胞類型包括內(nèi)皮細胞也表達VLA-3。

圖3 細胞TUNEL 染色檢測Fig.3 TUNEL staining of cells

本研究發(fā)現(xiàn)BEAS-2B組較結(jié)核桿菌誘導組細胞凋亡率降低，結(jié)核桿菌誘導組較BEAS-2B轉(zhuǎn)染組細胞凋亡率升高。BEAS-2B組較結(jié)核桿菌誘導組細胞活力升高，結(jié)核桿菌誘導組較BEAS-2B轉(zhuǎn)染組細胞細胞活力降低。凋亡過程非常耗能，并且依賴于ATP來執(zhí)行凋亡程序。結(jié)核桿菌誘導細胞發(fā)生炎癥反應，并且可阻止ATP的生成，從而通過釋放促炎性細胞因子和隨后募集嗜中性白細胞來激活先天免疫應答。結(jié)核桿菌誘導組較BEAS-2B組IL-6、IL-8、MCP-1mRNA表達升高，BEAS-2B轉(zhuǎn)染組較結(jié)核桿菌誘導組IL-6、IL-8、MCP-1mRNA表達降低，APC降低了結(jié)核桿菌誘導的細胞炎癥反應。同時對相應的細胞線粒體功能和線粒體膜電位進行檢測，評估細胞炎癥反應對線粒體的損傷程度，檢測各組細胞線體線粒體復合物Ⅰ、線粒體復合物Ⅳ活性受損情況發(fā)現(xiàn)，BEAS-2B組較結(jié)核桿菌誘導組線粒體復合物Ⅰ、線粒體復合物Ⅳ活性升高，結(jié)核桿菌誘導組較BEAS-2B轉(zhuǎn)染組線粒體復合物Ⅰ、線粒體復合物Ⅳ活性降低。BEAS-2B組較結(jié)核桿菌誘導組膜電位升高，結(jié)核桿菌誘導組較BEAS-2B轉(zhuǎn)染組膜電位降低。結(jié)核桿菌誘導了細胞的線粒體功能受損，活化蛋白C的超表達抑制了線粒體受損情況。筆者分析發(fā)現(xiàn)，嗜中性粒細胞表達活化蛋白C的受體，暴露于人類重組活化蛋白C會抑制嗜中性粒細胞的趨化性［11］。在白細胞整合素中，VLA-3（α3β1；CD49c/CD29）是一種新型的高親和力細胞，它是嚴重系統(tǒng)性炎癥期間出現(xiàn)的高炎癥性嗜中性白細胞亞群的獨特細胞表面標記rhAPC的受體［12］。在小鼠內(nèi)毒素血癥嚴重期間，嗜中性白血球表面上整合素VLA-3（CD49c/CD29）上調(diào)。本研究發(fā)現(xiàn)，將濃度不同的活化蛋白C與等量的活化的可溶性VLA-3，VLA-5和αVβ3整聯(lián)蛋白孵育。VLA-3較VLA-3和αVβ3結(jié)合程度升高。與其他兩種整聯(lián)蛋白相比，VLA-3對活化蛋白C的親和力更高?；罨鞍證通過整合素VLA-3（CD49c/CD29）以比其他RGD結(jié)合整合素有更高的親和力。活化蛋白C和整聯(lián)蛋白間的相互作用抑制促炎細胞因子的產(chǎn)生，暴露于結(jié)核桿菌的BEAS-2B或長時間暴露會導致壞死細胞死亡。

綜上所述，VLA-3是活化蛋白C的新型細胞受體，活化蛋白C可靶向作用VLA3中性粒細胞亞群降低人高炎癥反應，提高線粒體復合物Ⅰ、復合物Ⅳ活性，有效抑制結(jié)合桿菌誘導的細胞線粒體膜電位下降。