多時(shí)間點(diǎn)電針對(duì)腰多裂肌損傷大鼠HGF 及相關(guān)因子影響

李欣怡，李亞軍，李祎琳，陳 莉，陳 潔，許 玥，張 莉*，劉 通*

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京100029；2.河北省保定市第一中心醫(yī)院，河北 保定071000；3.承德醫(yī)學(xué)院，河北 承德067000；4.中國(guó)中醫(yī)藥出版社，北京100029；5.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第五臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州510000）

腰多裂肌是腰椎的最強(qiáng)穩(wěn)定器，腰多裂肌損傷影響腰椎穩(wěn)定。肌衛(wèi)星細(xì)胞(muscle satellite cells,MSC)作為肌肉損傷微環(huán)境的重要干細(xì)胞，受到牽拉刺激被激活，促進(jìn)損傷肌肉的修復(fù)[1]。 肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor, HGF)通過激活肌衛(wèi)星細(xì)胞參與組織再生和修復(fù)[2]，它的特異性受體酪氨酸激酶c-Met 與HGF 結(jié)合而被激活，響應(yīng)環(huán)境刺激促進(jìn)組織重塑。 細(xì)胞性骨髓瘤樣癌基因(cellularmyelocytomatosis oncogene, c-Myc)蛋白表達(dá)受生長(zhǎng)因子影響，同樣在參與細(xì)胞增殖活動(dòng)中發(fā)揮重要作用[3]。因此，HGF 與c-Met、c-Myc 對(duì)于損傷微環(huán)境的改變值得探究。電針作為一種外源性刺激促進(jìn)多裂肌損傷后修復(fù)[4]，觀察電針委中穴后相關(guān)因子動(dòng)態(tài)改變，可加深對(duì)損傷微環(huán)境的認(rèn)識(shí)。 故本文通過復(fù)制建立腰多裂肌損傷大鼠模型，探究不同時(shí)間點(diǎn)電針干預(yù)對(duì)于腰多裂肌損傷后HGF、c-Met、c-Myc 的表達(dá)及組織修復(fù)的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組

SPF 級(jí)雄性SD 大鼠54 只，體質(zhì)量為（300±20） g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0006。 隨機(jī)分籠并適應(yīng)性飼養(yǎng)10 d，自由飲食普通飼料和水，明暗周期為12 h∶12 h，溫度環(huán)境24 ℃，濕度40%～50%。 將54 只大鼠采用完全隨機(jī)方法分為空白組、模型組、電針組，每組18 只。 根據(jù)干預(yù)時(shí)間點(diǎn)每組再分1 d、3 d 和7 d 3 個(gè)亞組，各組6 只。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 主要試劑 布比卡因鹽酸鹽(美國(guó)Sigma 公司， 批號(hào)：80-477-DK)；10% 水合氯醛(北京百諾威生物科技有限公司，貨號(hào)：RH32027)；4%多聚甲醛溶液(北京雷根生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：90090525)；HE（蘇木素-伊紅）染色劑試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：G1121）；山羊抗兔二抗（北京中杉金橋生物科技有限公司，批號(hào)：SAP-9101）；兔多抗HGF 抗體、兔單抗c-Myc 抗體（美國(guó)Abacm 公司，批號(hào)：ab216623，ab32072）；兔多抗c-Met 抗體（美國(guó)Proteintech 公司，批號(hào)：25869-1-AP）；兔多抗β-actin抗體（北京博奧森生物試劑有限公司，批號(hào)：bs-0061R）；預(yù)染蛋白Maker（美國(guó)Thermo 公司，批號(hào)：26616）；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒、SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：PC0020，P1200）；5X 蛋白上樣緩沖液、RIPA 裂解液、ECL 超敏發(fā)光液（北京Coolaber 生物有限公司，批號(hào)分別為：SL1170，SL1010，SL1350）。

1.2.2 主要儀器 半自動(dòng)化石蠟切片機(jī)(德國(guó)萊卡儀器有限公司，RM2245)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司，SKP-02.600)；高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf 有限公司，5810R）；超低溫病冰箱（美國(guó)Thermo Scientific 公司，F(xiàn)ORMA907）；全自動(dòng)組織脫水機(jī)（德國(guó)徠卡儀器有限公司，ASP300S）；正置智能型顯微鏡及采集系統(tǒng)（奧林巴斯中國(guó)有限公司，BX53）；韓式電針儀（北京思盛達(dá)醫(yī)療器械中心，HANS200A）；凝膠成像系統(tǒng)儀（美國(guó)AI-phaInnoteeh公司）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司，SKP-02.600）。

1.3 動(dòng)物造模

模型組和電針組復(fù)制大鼠腰多裂肌注射布比卡因建立損傷模型[4]。首先，選用10%的水合氯醛溶液(350 mg/kg)進(jìn)行大鼠腹腔注射麻醉，以消除疼痛反射為度。成功后將大鼠四肢固定，背部備皮后暴露下腰，一次性注射器緊貼L4-L5 水平脊柱雙側(cè)的4 點(diǎn)棘突旁進(jìn)針，針到達(dá)骨面后回抽無血注射。 每處注100 μL 的0.5% 布比卡因溶液，時(shí)間≥3 s，旋轉(zhuǎn)針頭拔出，操作過程保持無菌，模型制作完成。

1.4 干預(yù)方法

（1）電針組：造模24 h 后，將大鼠固定在操作臺(tái)上，暴露背部和雙側(cè)后肢，參照大鼠解剖圖[5]和最新國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)穴位圖[6]，于大鼠膝關(guān)節(jié)背面正中取雙側(cè)委中穴干預(yù)。 針刺前用75%乙醇消毒，華佗牌0.25 mm×13 mm 一次性針灸針垂直刺入委中穴，連接韓式電針儀HANS-200A，2/100 Hz 的疏密波，電流強(qiáng)度1 mA，1 次/d，每次持續(xù)20 min。 （2）模型組：與電針組同步抓取、固定，不做其他處理。（3）空白組：不做任何干預(yù)，與其他兩組大鼠同步取材。

1.5 取材

空白組、模型組和電針組分別于干預(yù)后1、3、7 d 同步取材。麻醉方式同動(dòng)物造模，成功后將大鼠四肢固定，充分暴露腹部，先進(jìn)行5 mL 以上的腹主動(dòng)脈取血，再解開大鼠，將其俯臥暴露背部，固定四肢和頭部，剪開大鼠背部皮膚，以鑷子和組織剪剝離腰部筋膜，使腰骶部肌肉暴露，剝離開髂肋肌和最長(zhǎng)肌，于L4-L5 銳性取下大鼠腰部的多裂肌，一側(cè)放入4%多聚甲醛溶液固定，一側(cè)迅速放入凍存管后投入液氮，待冷卻后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱。

1.6 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.6.1 HE 染色觀察腰多裂肌形態(tài) 大鼠腰多裂肌組織置于4%多聚甲醛溶液固定48 h，將每一塊組織轉(zhuǎn)移至單個(gè)的包埋盒中。脫水與透明后，浸蠟包埋。使用半自動(dòng)切片機(jī)連續(xù)切片，將包埋好的蠟塊至水中展片，后在載玻片貼上，制好的載玻片于45 ℃恒溫箱中進(jìn)行烘干。結(jié)束后將石蠟切片放入浸泡用的鐵架，經(jīng)二甲苯（Ⅰ、Ⅱ，分別15 min）浸泡脫去切片中的石蠟，再經(jīng)由高濃度至低濃度（100%、95%、90%、80%、70%、50%，分別1 min）的乙醇浸泡，最后轉(zhuǎn)移至自來水沖洗2 min。 浸泡蘇木素5 min 染色，再自來水洗1 min。 分化液10 s，自來水清洗10 min。浸泡伊紅染色液2 min。 將切片浸于梯度乙醇脫水，二甲苯透明。 封片自然陰干后即進(jìn)行顯微鏡觀察。1.6.2 免疫組化法染色測(cè)HGF、c-Myc 表達(dá) 石蠟組織切片制作成功后，放入3%雙氧水中浸泡10 min，PBS 溶液浸泡3 次，每次3 min，置抗原修復(fù)液中加熱，自然冷卻1 h 后，PBS 溶液浸泡3 次，每次3 min。切片于20%蛋清20 min 孵育，PBS 溶液浸泡1 次，3 min。 加山羊血清孵育在37 ℃環(huán)境下20 min，結(jié)束后不洗甩干。滴加一抗，置于4 ℃孵育過夜。結(jié)束后移至室溫下復(fù)溫30 min，而后放入PBS 溶液浸泡3 次，每次3 min。 滴加二抗，37 ℃孵育20 min。 結(jié)束后于PBS 溶液浸泡3 次，每次3 min。 滴加試劑SABC，于37 ℃20 min，最后PBS 溶液浸泡3次，每次3 min。 顯色：滴加DAB 顯色液10 min，在顯微鏡下觀察，顯色即可自來水沖洗，蒸餾水再次沖洗。蘇木素溶液中復(fù)染3 min。脫水、透明后封片，自然陰干后即進(jìn)行顯微鏡觀察，采集圖像進(jìn)行分析。

1.6.3 Western blot 測(cè)c-Met 含量 取出存放在-80 ℃的腰部多裂肌組織，放置于預(yù)先配置的蛋白酶抑制劑和RIPA 裂解液混合溶液。使用超聲粉碎儀充分裂解腰部多裂肌組織，選用BCA 法測(cè)量樣品蛋白含量，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線后測(cè)定蛋白原液濃度。 用5×上樣緩沖液按1∶4 比例與蛋白原液、RIPA 裂解液混合，放置水浴鍋中加熱，100 ℃5 min 后迅速靜置冰上降溫。 電泳、電轉(zhuǎn)后，將膜取出置于麗春紅染色液中，若目標(biāo)蛋白完整清晰，用TBST 將染色液快速洗脫。然后將其浸沒于由脫脂奶粉與TBST 配置的封閉液中，常溫下置于搖床上，緩慢搖動(dòng)1.5 h。 將膜取出放置于稀釋好的一抗（c-Met 按1∶500 稀釋，選用脫脂奶粉與10×TBST 配置）中，4 ℃搖床孵育過夜，后室溫TBST 洗膜。 結(jié)束后將條帶放入配制好的二抗稀釋液（1∶3 000 稀釋，選用脫脂奶粉與10×TBST 配置）中，室溫?fù)u床上慢速孵育1 h，后TBST洗膜。 洗膜結(jié)束后將目標(biāo)條帶顯影曝光，進(jìn)行圖像分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。每組樣本數(shù)據(jù)用“±s”表示，服從正態(tài)分布采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，兩兩比較方差齊時(shí)用LSD-t 檢驗(yàn)，方差不齊用非參數(shù)檢驗(yàn)。 以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE 染色觀察肌纖維形態(tài)結(jié)果

空白組肌纖維細(xì)長(zhǎng)多核，粗細(xì)均勻，縱向分布緊密；胞核呈扁橢圓形且靠近肌膜。干預(yù)1 d 后，模型組肌纖維壞死變形，肌纖維間隙增寬明顯，間隙分布大量炎性細(xì)胞；電針組肌纖維增寬，間隙較模型組縮短，浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞減少。干預(yù)3 d 后，模型組肌纖維形態(tài)仍不規(guī)則，部分排列開始緊湊，但仍有肌纖維的碎片存在，且大量炎性細(xì)胞分布；電針組肌纖維較模型組形態(tài)均勻、排列規(guī)則，間隙仍有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。干預(yù)7 d 后，模型組可見新生的肌纖維，且纖維間較干預(yù)1 d 和3 d 的模型組間隙縮短明顯，仍有部分炎性細(xì)胞分布；電針組新生的肌纖維融合，排列緊密，細(xì)胞核開始向新生肌纖維邊緣遷移。 詳見圖1。

2.2 免疫組化測(cè)定HGF、c-Myc 陽性表達(dá)情況

圖1 大鼠腰多裂肌HE 染色結(jié)果（×200）

2.2.1 各組大鼠腰部的多裂肌HGF 陽性表達(dá)比較 與空白組比較，模型組1 d 組大鼠腰多裂肌HGF陽性表達(dá)降低（P＜0.01）；模型組3 d 組、7 d 組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與模型組比較，電針組治療1 d 后腰多裂肌HGF 陽性表達(dá)升高（P＜0.01）；電針組3 d 組和7 d 組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1、圖2。

表1 各時(shí)間點(diǎn)大鼠腰多裂肌HGF 的平均光密度值（n=6，±s）

表1 各時(shí)間點(diǎn)大鼠腰多裂肌HGF 的平均光密度值（n=6，±s）

注：與空白組比較，##P＜0.01；與模型組比較，&&P＜0.01

組別空白組模型組電針組1 d 組0.37±0.02 0.30±0.02##0.36±0.05&&3 d 組0.38±0.03 0.36±0.04 0.40±0.01 7 d 組0.34±0.02 0.36±0.09 0.37±0.03

2.2.2 各組大鼠腰部的多裂肌c-Myc 陽性表達(dá)比較 與空白組比較，模型組1 d 組腰多裂肌c-Myc陽性表達(dá)升高（P＜0.05），模型組3 d 組、7 d 組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），電針組1 d 組、7 d 組腰多裂肌c-Myc 陽性表達(dá)升高（P＜0.05 或P＜0.01），電針組3 d 組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與模型組比較，電針組1 d 組、3 d 組腰多裂肌c-Myc 陽性表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），電針組7 d 組表達(dá)升高（P＜0.01）。 見表2、圖3。

圖2 大鼠腰多裂肌HGF 陽性表達(dá)結(jié)果（×200）

圖3 大鼠腰多裂肌c-Myc 陽性表達(dá)（×200）

表2 各取材時(shí)間點(diǎn)大鼠腰多裂肌c-Myc 的平均光密度值（n=6，±s）

表2 各取材時(shí)間點(diǎn)大鼠腰多裂肌c-Myc 的平均光密度值（n=6，±s）

注：與空白組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，&&P＜0.01

組別空白組模型組電針組1 d 組0.20±0.01 0.24±0.02#0.25±0.04#3 d 組0.19±0.02 0.19±0.01 0.21±0.02 7 d 組0.18±0.02 0.18±0.01 0.23±0.03##&&

2.3 Western blot 檢測(cè)c-Met 含量

與空白組相比，模型組和電針組各時(shí)間點(diǎn)腰多裂肌c-Met 表達(dá)量均降低（P＜0.01）；與模型組相比，電針組1 d 組、7 d 組腰多裂肌c-Met 表達(dá)量降低（P＜0.05），電針組3 d 組腰多裂肌c-Met 表達(dá)量升高（P＜0.01）。 見表3、圖4。

表3 各取材時(shí)間點(diǎn)大鼠腰多裂肌c-Met 表達(dá)量（n=6，±s）

表3 各取材時(shí)間點(diǎn)大鼠腰多裂肌c-Met 表達(dá)量（n=6，±s）

注：與空白組比較，##P＜0.01；與模型組比較，&P＜0.05，&&P＜0.01

組別空白組模型組電針組1 d 組0.54±0.03 0.31±0.02##0.28±0.02##&3 d 組0.48±0.03 0.24±0.02##0.36±0.02##&&7 d 組0.40±0.01 0.22±0.02##0.17±0.02##&

圖4 各取材時(shí)間點(diǎn)大鼠腰多裂肌c-Met 表達(dá)量

3 討論

多裂肌作為脊柱肌肉維持著腰椎穩(wěn)定。 臨床上許多腰痛患者通過MRI 檢測(cè)到單雙側(cè)多裂肌萎縮[7-8]。由此可以看出，腰部多裂肌損傷后修復(fù)對(duì)于預(yù)防和治療腰痛尤為重要。

本實(shí)驗(yàn)復(fù)制腰多裂肌損傷模型，一次性直接定量注射局部麻醉藥0.5%鹽酸布比卡因溶液，布比卡因具有肌肉毒性，可在不影響肌衛(wèi)星細(xì)胞的情況下改變肌組織形態(tài)[4]。 HE 染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組肌纖維破壞，提示造模成功。 干預(yù)后電針加速了多裂肌的恢復(fù)，出現(xiàn)新生肌纖維融合，電針在多裂肌損傷后的修復(fù)作用直觀可見。 研究發(fā)現(xiàn)與腰多裂肌損傷后即刻干預(yù)和48 h 干預(yù)相比，24 h 電針干預(yù)的大鼠Myostatin、Myod、Foxol 和CDK4 表達(dá)改變差異更為顯著，提示損傷后24 h 電針干預(yù)效果最佳[9-10]。在干預(yù)時(shí)間方面，研究發(fā)現(xiàn)與腎俞穴比較，電針委中穴對(duì)于骨骼肌損傷后早期有較好促修復(fù)作用[11]，故本實(shí)驗(yàn)選擇干預(yù)后1 d、3 d 和7 d，以觀察早期電針干預(yù)對(duì)腰多裂肌損傷修復(fù)的影響。

肌衛(wèi)星細(xì)胞作為成體肌源干細(xì)胞，受環(huán)境刺激激活進(jìn)行增殖分化以修復(fù)受損細(xì)胞，對(duì)骨骼肌損傷修復(fù)發(fā)揮重要作用[12]。 研究表明外源性注射HGF 到正常肌肉中可激活靜息狀態(tài)衛(wèi)星細(xì)胞，將HGF 注射到受損肌肉中則可促進(jìn)肌細(xì)胞增殖[13]。 HGF 對(duì)針刺的機(jī)械牽拉刺激較為敏感，可誘導(dǎo)肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖，促進(jìn)骨骼肌損傷后修復(fù)[14-15]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)模型組多裂肌損傷早期HGF 表達(dá)降低，提示腰部多裂肌損傷影響HGF 表達(dá)，7 d 后表達(dá)增高可能與損傷多裂肌組織的自我恢復(fù)有關(guān)。電針組整體趨勢(shì)均高于模型組，且不同時(shí)間點(diǎn)變化趨勢(shì)提示干預(yù)3 d 后HGF陽性表達(dá)升高，由此提示HGF 對(duì)電針干預(yù)后的骨骼肌修復(fù)早期效果明顯。

HGF 與特異性受體c-Met 結(jié)合激活肌衛(wèi)星細(xì)胞，共同參與對(duì)組織損傷的重塑。c-Met 作為受體酪氨酸激酶參與細(xì)胞增殖，對(duì)骨骼肌發(fā)育和再生起著重要作用[16]。 研究發(fā)現(xiàn)，c-Met 在骨骼肌損傷組織的肌衛(wèi)星細(xì)胞中有表達(dá)，可能是肌損傷后修復(fù)的關(guān)鍵蛋白[17]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，模型組整體腰部的多裂肌c-Met表達(dá)量低于空白組，提示多裂肌損傷致該蛋白表達(dá)減少。干預(yù)后1 d、7 d 電針組c-Met 表達(dá)量低于模型組，干預(yù)后3 d 電針組高于模型組，且不同時(shí)間點(diǎn)變化顯示3 d 表達(dá)量高，提示電針干預(yù)后3 d肌衛(wèi)星細(xì)胞中的c-Met 增加，但隨著腰多裂肌組織再生，肌衛(wèi)星細(xì)胞減少致c-Met 減少。

c-Myc 參與細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖等變化。 c-Myc蛋白在增殖細(xì)胞中的表達(dá)較高，隨細(xì)胞分化而降低，并失去促進(jìn)增殖的能力[18]。 c-Myc 的水平得以提高在很大程度上依賴于生長(zhǎng)因子[3，19]。研究發(fā)現(xiàn)，HGF 誘導(dǎo)髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞中的c-MycmRNA 和蛋白質(zhì)水平。當(dāng)被生長(zhǎng)因子刺激時(shí)，c-Myc 迅速積累并在整個(gè)細(xì)胞周期中保持高含量[20]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組1 d 腰多裂肌c-Myc 陽性表達(dá)高于空白組，模型組3 d 和7 d 表達(dá)與之基本一致，提示多裂肌損傷早期刺激c-Myc 參與細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖等活動(dòng)。 電針組腰多裂肌c-Myc 陽性表達(dá)高于模型組，且不同時(shí)間點(diǎn)變化趨勢(shì)顯示1 d 表達(dá)較之高，提示電針干預(yù)多裂肌損失模型引起c-Myc 早期作用，促多裂肌損傷后細(xì)胞增殖，進(jìn)而有助于損傷后的修復(fù)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠腰多裂肌損傷模型，觀察電針委中穴后不同組間的HGF 及相關(guān)因子表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)電針委中穴干預(yù)早期大鼠腰多裂肌HGF、c-Met、c-Myc 均上調(diào)，促肌衛(wèi)星細(xì)胞修復(fù)損傷的腰多裂肌。