小柴胡湯“去滓重煎”對(duì)LPS 誘導(dǎo)發(fā)熱白兔模型體溫及血清IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平的影響

蘭 斌，張 鈺，龍 睿，丑天舒*（湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙410208）

小柴胡湯是臨床用于治療發(fā)熱病癥的經(jīng)典方劑，但近年來(lái)常存在“病準(zhǔn)方對(duì)藥不靈”的情況，即辨證施治準(zhǔn)確但臨床療效卻不理想[1-2]。 正如李時(shí)珍[3]的《本草綱目》中云：“凡服湯藥，雖品物專(zhuān)精，修治如法，而煎藥者魯莽造次，水火不良，火候失度，則藥亦無(wú)功。 ”北宋醫(yī)家沈括[4]在《良方》中論煎煮湯劑必“煮煉有節(jié)”，表明煎煮方法的正確選擇能夠確保經(jīng)方的臨床療效。“去滓重煎”法首見(jiàn)于《傷寒論》中，是一類(lèi)特殊的濃縮煎煮法，自漢末以來(lái)就被歷代醫(yī)家所認(rèn)可，可使藥液濃縮，減輕患者胃腸刺激[5-6]。 前期臨床研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)用小柴胡湯“水煎服”治療臨床發(fā)熱的2829 例中，嚴(yán)格按照原文要求“去滓重煎”的僅29 例，約占總體的1%，而痊愈者占總數(shù)的49.13%，提示臨床上不規(guī)范的煎煮方式可能導(dǎo)致藥效作用的減弱甚至喪失[7-8]。 本課題通過(guò)觀察小柴胡湯去滓重煎對(duì)脂多糖（lipopolysaccharides, LPS）誘導(dǎo)新西蘭兔發(fā)熱模型體溫及血清中白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β, IL-1β）、白細(xì)胞介素6（interleukin-6, IL-6）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）水平的影響，探討小柴胡湯“去滓重煎”治療發(fā)熱的作用機(jī)制，為臨床解熱提供新的治療思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取健康新西蘭兔50 只，雌雄各半，體質(zhì)量（1.5±0.5） kg，由湖南太平生物科技有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK（湘）2015-0004，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：1107301911000138。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)室，室溫（25±2） ℃，濕度45%～65%，許可證編號(hào)：SYXK（湘）2019-0009。 符合中華人民共和國(guó)科學(xué)技術(shù)部頒發(fā)的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》，并經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查和批準(zhǔn)。

1.2 主要儀器與試劑

漩渦混勻儀（型號(hào)：MIX-25P，武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司）；電子秤（武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司）；肛溫計(jì)（安徽方達(dá)藥械有限公司）；EDTA 抗凝管（三力醫(yī)用科技發(fā)展有限公司）；5 mL 普通試管（南京瑞崛儀器設(shè)備有限公司）。

IL-1β、IL-6 和TNF-α ELISA（批號(hào)：L150707213）均產(chǎn)自武漢優(yōu)爾生科技有限公司，由上海朗頓生物技術(shù)有限公司提供。 LPS（Escherichca coli endotoxin 055：B5，美國(guó)Sigma 公司，批號(hào)1010A031）用無(wú)菌生理鹽水溶解成2 μg·mL-1溶液。阿司匹林（拜耳醫(yī)藥保健有限公司，批號(hào)J20130078）用無(wú)菌生理鹽水溶解成0.13 g·mL-1。 水合氯醛（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20160113）用無(wú)菌生理鹽水溶解成10%溶液。

1.3 中藥材的選取與制備

小柴胡湯組成：北柴胡.24 g，青半夏9 g，黃芩9 g，人 參9 g，炙甘草6 g，生姜9 g 和大棗10 g，按照《中華人民共和國(guó)藥典》（2015 版）藥材標(biāo)準(zhǔn)，購(gòu)自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房。

小柴胡湯普通煎煮法制備藥液：取小柴胡湯干燥飲片一劑，加入760 mL 水，浸泡40 min，大火煎煮至沸騰40 min 后，過(guò)濾并取藥渣，將藥渣同法再煎煮2 次，合并3 次藥液，并將所得藥液用雙層紗布過(guò)濾，再煎取600 mL，生藥濃度為0.13 g·mL-1。

小柴胡湯“去滓重煎”法制備藥液：取小柴胡湯干燥飲片一劑，加入2 400 mL 水，煎煮至1 200 mL后濾掉藥渣，將所得藥液再煎煮至600 mL，生藥濃度為0.13 g·mL-1。

1.4 動(dòng)物分組及模型建立

選取50 只新西蘭白兔在實(shí)驗(yàn)環(huán)境中喂養(yǎng)1 周（自由取食、飲水和光照等），再將其隨機(jī)分為5 組：正常組、模型組、小柴胡湯原液組、小柴胡湯“去滓重煎”組和阿司匹林組，每組10 只。實(shí)驗(yàn)前，新西蘭兔禁食、不禁水12 h。 正常組經(jīng)耳緣靜脈注射同等體積生理鹽水，其余組動(dòng)物以0.3 mL·kg-1劑量經(jīng)耳緣靜脈注射濃度為2 μg·mL-1的LPS 水溶液，完成發(fā)熱模型建立。

1.5 動(dòng)物給藥處理

造模成功后，新西蘭兔灌胃劑量按照“人與動(dòng)物體表面積折算等效劑量”進(jìn)行灌服給藥。小柴胡湯原液組：按0.32 g·kg-1劑量灌服普通煎煮法所得的水煎液5 mL；小柴胡湯去滓重煎組：按0.32 g·kg-1劑量灌服“去滓重煎”法所得的水煎液5 mL；阿司匹林組：按0.32 g·kg-1劑量灌服阿司匹林水溶液5 mL；正常組與模型組灌服同等體積生理鹽水5 mL；均早、晚灌服1 次。

1.6 指標(biāo)檢測(cè)

1.6.1 各組新西蘭兔體溫在不同時(shí)間點(diǎn)體溫值 造模前，連續(xù)3 d 早、晚測(cè)量各組新西蘭兔肛溫（測(cè)溫探頭插入肛門(mén)4 cm）2 次，并取3 d 平均值作為新西蘭兔的基礎(chǔ)體溫（T0）。 各組新西蘭兔經(jīng)灌服給藥后，每隔0.5 h 監(jiān)測(cè)新西蘭兔肛溫（T1），連續(xù)觀測(cè)2 h，記錄各組平均體溫變化△T（△T =T1-T0）。

1.6.2 各組新西蘭兔血清IL-1β、IL-6 和TNF-α 含量 經(jīng)白兔耳緣靜脈采血入5 mL 普通試管內(nèi)，室溫靜置4 h， 以3 500 r/min 轉(zhuǎn)速于4 ℃離心15 min，分離出血清后。再?lài)?yán)格按ELISA 試劑盒內(nèi)操作程序，運(yùn)用ELISA 法檢測(cè)新西蘭兔血清IL-1β、IL-6和TNF-α 含量。

1.6.3 各組新西蘭兔中白細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞水平 測(cè)量最后1 次體溫后，采用10%水合氯醛進(jìn)行腹腔注射麻醉。經(jīng)白兔耳緣靜脈采血入EDTA 抗凝管中，輕輕搖晃使抗凝素與血液完全混合，再通過(guò)血細(xì)胞檢測(cè)分析儀進(jìn)行自動(dòng)檢測(cè)白細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)量，并記錄讀數(shù)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組數(shù)據(jù)均以“±s”表示，多組間數(shù)據(jù)經(jīng)方差齊性檢驗(yàn)后，兩組間比較采用單因素方差分析，檢驗(yàn)水平α=0.05，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組新西蘭兔在不同時(shí)間點(diǎn)的體溫值變化

與正常組比較，各組新西蘭兔在造模30 min 后開(kāi)始發(fā)熱，皮膚溫度逐漸升高（P＜0.05），結(jié)膜充血并出現(xiàn)發(fā)抖、蜷縮；1.5 h 后，各組新西蘭兔體溫明顯上升（P＜0.01），皮溫升高，呼吸急促，結(jié)膜充血嚴(yán)重，運(yùn)動(dòng)行為萎靡。與模型組比較，小柴胡湯原液組和小柴胡湯去滓重煎組在各時(shí)間點(diǎn)的癥狀都有明顯改善以及體溫下降（P＜0.05）；與小柴胡湯原液組比較，小柴胡湯去滓重煎組在1.5 h 和2 h 時(shí)間節(jié)點(diǎn)的體溫低于小柴胡湯原液組（P＜0.05）。 見(jiàn)表1。

表1 各組新西蘭兔注射LPS 后體溫在不同時(shí)間點(diǎn)△T 值變化(℃，±s,n=10）

表1 各組新西蘭兔注射LPS 后體溫在不同時(shí)間點(diǎn)△T 值變化(℃，±s,n=10）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與小柴胡湯原液組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別正常組模型組小柴胡湯原液組小柴胡湯去滓重煎組阿司匹林組F 值P 值30 min 0.24±0.07 0.80±0.38*0.37±0.29#0.31±0.37##0.77±0.23#235.418 0.000 1 h 0.24±0.09 0.84±0.21*0.68±0.39#0.72±0.34#0.78±0.21#199.445 0.012 1.5 h 0.23±0.10 1.48±0.34**1.05±0.29#0.63±0.31##△0.89±0.20##△217.613 0.000 2 h 0.24±0.09 0.81±0.21**0.72±0.32#0.35±0.54##△0.75±0.21#203.756 0.000

2.2 小柴胡湯“去滓重煎”對(duì)發(fā)熱白兔血清IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平的影響

與正常組比較，模型組血清IL-1β、IL-6 和TNFα 含量均顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，小柴胡湯原液組和小柴胡湯去滓重煎組血清IL-1β、IL-6和TNF-α 含量均下降（P＜0.05 或P＜0.01）；與小柴胡湯原液組比較，小柴胡湯去滓重煎組血清IL-1β、IL-6 和TNF-α 含量低于小柴胡湯原液組（P＜0.05）。 見(jiàn)表2。

表2 小柴胡湯“去滓重煎”對(duì)發(fā)熱白兔血清IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平的影響(±s,n=10,ng·L-1）

表2 小柴胡湯“去滓重煎”對(duì)發(fā)熱白兔血清IL-1β、IL-6 和TNF-α 水平的影響(±s,n=10,ng·L-1）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與小柴胡湯原液組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別正常組模型組小柴胡湯原液組小柴胡湯去滓重煎組阿司匹林組F 值P 值IL-1β 11.33±3.89 36.44±9.23**24.98±3.97#16.80±2.24##△11.65±2.74##△△43.734 0.000 IL-6 36.63±10.2 131.36±21.22**100.71±12.50#63.83±11.29##△55.45±14.98##△△51.453 0.000 TNF-α 47.19±10.50 220.89±26.33**149.05±18.51#83.34±27.21##△69.56±20.08##△△131.794 0.000

2.3 各組新西蘭兔中白細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞變化

與正常組比較，模型組白細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞數(shù)目均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，小柴胡湯原液組和小柴胡湯去滓重煎組白細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞數(shù)目均有所降低（P＜0.05 或P＜0.01）；與小柴胡湯原液組比較，小柴胡湯去滓重煎組白細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞數(shù)目差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 見(jiàn)表3。

表3 各組新西蘭兔中白細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞變化(±s,n=10）

表3 各組新西蘭兔中白細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞變化(±s,n=10）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與小柴胡湯原液組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別正常組模型組小柴胡湯原液組小柴胡湯去滓重煎組阿司匹林組F 值P 值白細(xì)胞計(jì)數(shù)/（×109/L-1）16.8±1.11 21.19±1.23*7.73±4.18##7.94±4.48##12.76±8.52#15.601 0.026嗜中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)/（×109/L-1）4.00±0.70 9.51±4.02*5.66±4.00##6.53±3.82#10.83±8.00 15.850 0.027嗜中性粒細(xì)胞百分比/%51.05±3.87 77.19±7.50*75.00±4.30#80.91±4.82 80.86±11.87 20.772 0.328

3 討論

發(fā)熱是由于內(nèi)、外致熱源通過(guò)中樞發(fā)熱介質(zhì)作用于體溫調(diào)節(jié)中樞，促使體溫調(diào)定點(diǎn)上移而引起的調(diào)節(jié)性體溫升高[9-10]。 LPS 作為革蘭陰性細(xì)菌內(nèi)毒素的活性成分，是誘導(dǎo)強(qiáng)發(fā)熱的主要外源性致熱源，通過(guò)作用于機(jī)體內(nèi)巨噬細(xì)胞，促使其產(chǎn)生IL-1β、IL-6和TNF-α 等重要的炎性遞質(zhì)，從而引起機(jī)體的強(qiáng)烈炎癥反應(yīng)，促使體溫升高[11-12]。 前期研究表明，在眾多動(dòng)物模型中，新西蘭兔對(duì)內(nèi)毒素的生物學(xué)反應(yīng)與人類(lèi)最為接近。在本實(shí)驗(yàn)研究中，我們選取新西蘭兔作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，以0.6 μg·kg-1劑量經(jīng)耳緣靜脈注射濃度為2 μg·mL-1的LPS 建立新西蘭兔發(fā)熱模型。結(jié)果顯示各組新西蘭兔在造模30 min 后開(kāi)始發(fā)熱，皮膚溫度逐漸升高，結(jié)膜充血并出現(xiàn)發(fā)抖、蜷縮；1.5 h后，各組新西蘭兔體溫明顯上升，皮溫升高，呼吸急促，結(jié)膜充血嚴(yán)重，運(yùn)動(dòng)行為萎靡，且模型組血清IL-1β、IL-6 和TNF-α 含量均顯著升高，白細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞數(shù)目均顯著升高，提示模型建立成功。

小柴胡湯出自東漢張仲景《傷寒論》中“和”法的經(jīng)典方，廣泛用于臨床治療發(fā)熱性病證。方中柴胡味辛微苦，氣質(zhì)薄且味稍輕，煎煮時(shí)常溶出且升散。 半夏性溫味辛、氣平微苦，可開(kāi)結(jié)氣，降逆氣，消正邪之搏結(jié)。 黃芩可除少陽(yáng)郁熱，再配以生姜之辛溫，以助柴胡、半夏樞轉(zhuǎn)開(kāi)結(jié)。加大棗、人參、炙甘草等味甘之類(lèi)，以扶正達(dá)邪，并緩其溫散之勢(shì)，且制約黃芩苦寒傷正[13]。 “去滓重煎”法首見(jiàn)于《傷寒論》：“以水一斗二升，煮取六升，去滓，再煎取三升”，煎煮時(shí)，所需湯藥之量更少，減少了對(duì)胃腸道的刺激，避免停飲致嘔，能達(dá)到調(diào)和方中藥性寒溫之差，味苦辛甘之異，功用祛邪扶正之別[14-15]。 現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)高效液相色譜法測(cè)定小柴胡湯“去滓重煎”法中黃芩的有效化學(xué)成分（如黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素等）含量明顯高于不去滓煎法（P＜0.05），且溶液中柴胡皂苷a、b1、d 含量及抗炎效果明顯優(yōu)于傳統(tǒng)“水煎服”法（P＜0.05）[16-17]。

本研究通過(guò)選取小柴胡湯干燥飲片，經(jīng)“去滓重煎”后的濃縮液治療LPS 誘導(dǎo)的新西蘭兔發(fā)熱模型。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)小柴胡湯“去滓重煎”組新西蘭兔血清IL-1β、IL-6 和TNF-α 含量低于小柴胡湯原液組；小柴胡湯原液和小柴胡湯去滓重煎液均能有效降低模型組白細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞數(shù)目；但小柴胡湯去滓重煎組在1.5 h 和2 h 時(shí)間節(jié)點(diǎn)的體溫明顯低于小柴胡湯原液組，且解熱效果更佳，可能主要與小柴胡湯“去滓重煎”液降低血清中IL-1β、IL-6 和TNF-α 含量有關(guān)；小柴胡湯“去滓重煎”時(shí)，湯液中有效成分并不增加，但繼續(xù)煎煮過(guò)程中，藥物屬氣、屬陽(yáng)的成分相對(duì)于屬陰、屬味的成分易偏于升散，更多地?fù)]發(fā)而丟失，則味分之藥物成分得到保存，既取藥物之氣，又留藥物之味，使藥物間陰陽(yáng)調(diào)和，補(bǔ)瀉相和，更好地發(fā)揮了和解少陽(yáng)之功[18-19]。

本實(shí)驗(yàn)研究探討了小柴胡湯“去滓重煎”的解熱效果及血清中IL-1β、IL-6 和TNF-α 含量的影響，為臨床應(yīng)用小柴胡湯“去滓重煎”法治療發(fā)熱提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，無(wú)論是從理論基礎(chǔ)，還是解熱療效，都說(shuō)明了小柴胡湯“去滓重煎”法在臨床應(yīng)用中的潛在價(jià)值，但其機(jī)制仍需深入研究。