四種全自動免疫組化儀染色結果的比較分析

高麗麗，脫 穎，周建文，張芬芬，梁英杰，朱長樂

免疫組化技術已成為臨床病理診斷中常規(guī)檢測手段之一，特別是在判斷腫瘤組織的起源、分類以及良、惡性腫瘤的鑒別診斷等方面發(fā)揮重要作用。但在實際工作中，因工作環(huán)境、檢測方法及個人操作差異等因素影響染色結果的準確性和穩(wěn)定性。全自動免疫組化儀的應用對免疫組化標準化染色起到了推動作用，可以有效解決人為因素對染色結果的影響[1-4]。本實驗對四種全自動免疫組化儀檢測五種抗體染色的結果進行比較，優(yōu)化染色流程，最終達到一致性高的檢測結果。

1 材料與方法

1.1 材料回顧性選取中山大學附屬第一醫(yī)院病理科存檔的浸潤性乳腺癌標本5例和淋巴瘤標本5例。

1.2 儀器設備與試劑全自動免疫組化儀為美國Roche公司的Ultra、德國Leica公司的BOND-Ⅲ、丹麥DAKO公司的Link 48和Omnis。一抗分別為Ki-67(MIB-1)、CKpan(AE1/AE3)、CD5(4C7)、BCL-6(PG-Bbp)均購自丹麥DAKO公司，Calponin(EP63)購自北京中杉金橋公司。二抗及顯色系統(tǒng)、蘇木精復染液均為相應儀器自帶套裝。

1.3 方法常規(guī)脫水、包埋石蠟組織塊，2～3 μm厚切片，并將切片撈于帶陽性對照的防脫片上，于60～70 ℃烤箱烘烤1～2 h。按提前設置好的程序上機染色，浸潤性乳腺癌標本染色Ki-67、Calponin、CKpan；淋巴瘤標本染色CD5、BCL-6，染色后的切片清洗后常規(guī)脫水、透明、封固。

2 結果

2.1 四款儀器染色比較Ki-67陽性定位于細胞核，為棕黃色著色。5例浸潤性乳腺癌標本中，除1例出現(xiàn)四款儀器染色結果各不相同外，Link48染色陽性率和強度最低，Omnis和BOND Ⅲ染色強度較Link48強，但陽性率不高，Ultra染色陽性率和強度最高；其余染色結果一致(圖1)。Calponin陽性定位于細胞質，為棕黃色著色。四款儀器免疫組化Roche Ultra染色強度較弱，其余染色結果一致。CKpan陽性定位于細胞質，為棕黃色著色。四款儀器免疫組化Leica BOND-Ⅲ染色強度過強，其余染色結果一致。CD5陽性定位于細胞膜，為棕黃色著色。四款儀器免疫組化Leica BOND-Ⅲ染色強度過強，其余染色結果一致。BCL-6陽性定位于細胞核，為棕黃色著色。四款儀器免疫組化DAKO Link 48和Omnis染色強度較弱，其余染色結果一致。

圖1 四款儀器檢測Ki-67染色：A. DAKO Link 48染色；B. DAKO Omnis染色；C. Leica BOND-Ⅲ染色；D. Roche Ultra染色

2.2 優(yōu)化染色流程后四款儀器染色比較經過測試，確定最終相應抗體的染色流程調整。(1)Ki-67：DAKO Link48一抗孵育時間延長至30 min，DAB顯色時間延長至10 min；DAKO Omnis二抗孵育時間延長至25 min；Leica BOND Ⅲ延長抗原修復時間至30 min。(2)Calponin：Roche Ultra抗原修復時間延長至90 min。(3)CKpan：Leica BOND-Ⅲ抗原修復時間減短為10 min。(4)CD5：Leica BOND-Ⅲ染色程序未改動，一抗1 ∶1稀釋。(5)BCL-6：DAKO Link 48二抗染色后增加增強試劑孵育30 min，阻斷劑調整至滴加一抗后孵育1 min；Omnis二抗染色后增加增強試劑孵育30 min。流程優(yōu)化后，各個抗體在四種檢測平臺上染色結果一致。

3 討論

Ki-67是重要的細胞增殖標志物,腫瘤細胞增殖情況可作為預測惡性腫瘤發(fā)展及臨床預后的指標，研究表明Ki-67表達與乳腺癌臨床病理特點及預后有一定的相關性；另外，近年來p16/Ki-67雙重染色檢測作為子宮頸癌篩查技術，改善了子宮頸癌篩查的靈敏度和特異性。

乳腺診斷病理中乳腺導管原位癌與早期微小浸潤癌的診斷與鑒別診斷一直是難點。是否存在肌上皮標記是診斷有/無浸潤的關鍵。Calponin蛋白是一種相同分子質量3.4×104多肽，在平滑肌組織中廣泛表達，并參與收縮機制。Calponin與肌纖維母細胞的交叉反應較輕，特異性好，可作為臨床肌上皮標志物。

細胞角蛋白是一種中間絲，在細胞內形成一個復雜的細胞骨架網絡，并與相鄰細胞的細胞骨架相互作用。CK(AE1/AE3)又稱CKpan，屬于廣譜CK。CKpan已用于檢測常規(guī)病理檢查難以發(fā)現(xiàn)的微轉移[5-6]。

CD5是T細胞和少數(shù)B細胞表面表達的一種相對分子質量為6.7×104的糖蛋白。研究證實，CD5可以通過提供一些細胞因子控制異常的免疫反應，但是CD5+淋巴細胞可能對人體有害。

BCL-6蛋白是生發(fā)中心B細胞的標志物之一，也表達于生發(fā)中心細胞及其起源的淋巴瘤中?？膳cCD10一起作為濾泡中心B細胞的標記。

免疫組化染色結果準確性極大影響臨床病理診斷，特別在腫瘤鑒別診斷、早期微小浸潤等方面。為減少手工操作對免疫組化準確性及穩(wěn)定性的影響，大多數(shù)病理科已開展全自動免疫組化染色。但是仍然會出現(xiàn)相同的抗體在不同檢測平臺上染色結果不一致，因此對于每一種科室新增、更換克隆號或批號的抗體都要進行性能驗證。若科室有不同廠家或型號免疫組化儀，性能驗證既要縱向比較也要橫向比對，對于染色偏弱或強的抗體，橫向比對更容易發(fā)現(xiàn)問題。

免疫組化操作步驟復雜，影響其結果的因素很多，如抗體濃度、抗原修復時間、一抗/二抗/DAB孵育時間、H2O2抑制劑滴加順序、增強劑的使用等因素。目前大多病理技術員已使用儀器進行免疫組化染色，儀器染色的流程、每一種試劑的用途，染色程序的設置，都應該熟悉掌握。當出現(xiàn)染色異常時，我們能及時調整染色流程，優(yōu)化方案，最終呈現(xiàn)出準確穩(wěn)定的染色結果。